Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

3.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62182

⸱

30 Ocak 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, University of South Carolina School of Medicine, 2Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine Baltimore, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center, 6Department of Drug Discovery and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, University of South Carolina

Bu makalede

Özet

Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Özet

Epitel düzensizliği, kronik yaralama, iltihaplanma ve tüm insan kanserlerinin% 80'inden fazlası dahil olmak üzere çeşitli insan koşulları ve rahatsızlıkları için bir düğümdür. Bir astar dokusu olarak, cilt epitel genellikle yaralanmaya maruz kalır ve hasarlı dokuyu onarmak için gerekli hücresel plastisiteyi elde ederek evrimsel olarak adapte olur. Yıllar boyunca, in vitro ve ex vivo hücre bazlı modeller kullanarak epitel plastisitesini incelemek için çeşitli çabalar sarf edilmiştir. Bununla birlikte, bu çabalar epitel hücre plastisitesinin çeşitli aşamalarını yeniden yakalama kapasitelerinde sınırlı olmuştur. Burada primer yenidoğan insan keratinositlerinden 3D epidermal sferoidler ve epidermal sferoid türevli hücreler üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, epidermal sferoid kültürlerinin keratinosit üretici plastisitenin farklı aşamalarını işlevsel olarak modelleme kapasitesini özetlemektedir ve epidermal küresel re-kaplamanın integrinα6hi/EGFRlo keratinosit subpopulasyonları için heterojen normal insan keratinosit (NHKc) kültürlerini gelişmiş kök benzeri özelliklerle zenginleştirebileceğini göstermektedir. Raporumuzda cilt keratinosit plastisitesi ve epidermal rejenerasyon çalışması için yüksek verimli bir sistemin geliştirilmesi ve sürdürülmesi açıklanmaktadır.

Giriş

Memeli tabakalı epitel, tüm canlı sistemlerde en karmaşık epitel mimarisidir ve en sık hasar ve yaralanmaya maruz kalır. Koruyucu bir doku olarak, tabakalı epitel karmaşık ve etkili bir doku hasarı tepkisi oluşturmak için evrimleşmiştir. Yaralanma üzerine, bu hücreler, yaralı bölgeye göç etmelerini ve onarım1,2,3'ü gerçekleştirmelerini sağlayan soy plastisite programlarını etkinleştirmelidir. Bu çok yönlü yanıt, yedenmiş olarak anlaşılan birkaç sıralı adımda gerçekleşir.

Epitel rejenerasyonunun karmaşık sürecinin incelenmesinde büyük bir engel, hücre yenilenmesinin tanımlanmış aşamalarında dinamik hücresel aktiviteleri yakalayabilen yüksek verimli model sistemlerinin değerinde yatmaktadır. In vivo fare modelleri yara iyileşmesi hakkında ilgili içgörüler sunarken ve insan rejeneratif sürecini en yakından özetlese de, gelişimleri zahmetli çabalar ve önemli maliyet gerektirir ve üretim kapasitelerini sınırlar. Bu nedenle, insan epitel dokusu yenilenmesinin yüksek verim ölçeğinde fonksiyonel olarak araştırılmasını sağlayan sistemlerin kurulması için kritik bir ihtiyaç vardır.

Son yıllarda ölçeklenebilirlik zorluğunun karşılanması için çeşitli girişimlerde bulunulmuştur. Bu, in vivo rejeneratif bağlamı yakından taklit eden yenilikçi in vitro ve ex vivo hücre tabanlı modellerin büyük genişlemesi ile görülür. Bu, çip üzerindekiorgan-on-chip 4, küresel5, organoid6ve organotipik kültürlerdeki gelişmeleri içerir7. Bu 3D hücre tabanlı sistemlerin her biri benzersiz avantajlar sunar ve farklı deneysel sınırlamalar sunar. Bugüne kadar, küresel kültür en uygun maliyetli ve yaygın olarak kullanılan 3D hücre kültürü modeli olmaya devam etmektedir. Ve birkaç rapor sferoid kültürlerinin cilt kök hücre özelliklerini incelemek için kullanılabileceğini belirtmiş olsa da, bu çalışmalar büyük ölçüde hayvan dokusu8,9veya dermal fibroblastlar10, insan epidermal küresel kültürlerinin rejeneratif özelliklerini iyice karakterize eden neredeyse hiçbir rapor olmadan yapılmıştır. Bu protokolde epidermal sferoid kültürlerin normal insan keratinositlerinden (NHKc) fonksiyonel gelişimini, kültürünü ve bakımını detaylandırıyoruz. Epidermal rejenerasyon ve keratinosit kök hücre plastisitesinin sıralı evrelerini in vitro olarak modellemek için bu sistemin yararlarını eşit olarak açıklıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deri örneklerinin toplanması ve işlenmesi ve insan keratinositlerinin izolasyonu için protokol Güney Carolina Üniversitesi (UofSC) IRB tarafından gözden geçirilmiş ve sünnet derisi örneklerinin rutin cerrahi prosedürler sırasında (yenidoğan erkek çocukların sünneti) üretilen cerrahi atmalar olduğu ve tanımlayıcı bilgilerden tamamen yoksun olduğu için "insan deneklerini içermeyen araştırma" olarak sınıflandırılmıştır. Protokol ayrıca UofSC Biyogüvenlik Komitesi tarafından düzenli olarak gözden geçirilerek onaylandı ve tüm laboratuvar personeline laboratuvar biyogüvenlik eğitimi verildi. Tüm prosedürler UofSC'nin güvenlik ve etik standartlarına uygun olarak yürütüldü.

1. Yenidoğan sünnet derisi dokusundan insan keratinositlerinin izolasyonu ve kültürü

  1. 500 mL KSFM ortamına 0,1 M HEPES tampon ekleyerek yıkama ortamını hazırlayın ve 7,2 pH'a ayarlayın. Ortamı 500 mL vakum filtresinde (0,22 μm gözenek boyutu) sterilize edin. MCDB 153-LB bazal ortam, KSFM yerine alternatif bir yıkama çözümü olarak da kullanılabilir.
  2. Laminer akış davlumbazında, yenidoğan sünnet derisi 50 mL konik bir tüpte 5 mL yıkama ortamı ile yıkayın. İki kez tekrarlayın.
  3. Yıkanmış foreskin'i steril bir Petri kabına aktarın. Neşter ve toparlap kullanarak, yağ ve gevşek bağ dokularını dermal tabakadan kazıyın. 50 mL konik tüpte 5 mL yıkama ortamı ile foreskin yeniden yıkayın.
  4. Foreskin epidermis tarafını yıkama ortamlarında seyreltilmiş 2 mL dispaz enzimi içeren 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin (50 U/mL).
  5. Plakayı 4 saat boyunca bir inkübatöre aktarın (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
  6. Foreskin'i inkübatörden çıkarın ve steril koşullar altında bir Petri kabına aktarın. İnce uçlu epepler kullanarak epidermisi dermis tabakasından ayırın.
  7. Epidermisi% 0.25 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini içeren 15 mL konik bir tüpe yerleştirin. 5 mL serolojik pipet kullanarak, yüzen epidermisi mekanik olarak ezin. Her 5 dakikada bir 5 sn periyodik girdap ile 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın.
  8. İnkübasyondan sonra, 2 mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin ve tripsini nötralize etmek için pipetle karıştırın.
  9. Santrifüj hücre süspansiyonu 450 x g'da2 dakika ve sonra 250 x g'da8 dakika .
  10. Hücre peletini yerinden çıkarmamaya dikkat ederek, yüzen kalıntıları kümeslerle çıkarın. Hücre peletinden süpernatantı dikkatlice aspire edin.
  11. Peletin 12 mL'lik komple KSFM-scm orta ve plakayı 10 cm'lik bir tabakta yeniden sunun. Bir gecede kuluçka kabı (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
  12. Ertesi gün, aspirasyon pipet kullanarak ortamı çıkarın ve 12 mL komple KSFM-scm ile değiştirin.
  13. Normal insan keratinosit (NHKc) kültürlerinin optimal büyümesini sağlamak için, hücrelerin% 80'den fazla izdiah elde etmesini önlemek için 10.

2. Cilt epidermosfer kültürlerinin in vitro olarak üretilmesi

  1. 50 mL'lik bir cam şişeye 50 mL fosfat tamponlu saline (PBS) 2,5 g agarose ekleyerek% 5 agarose karışımı hazırlayın. Sıvı döngüsü altında otoklav şişesi. Oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın.
  2. Tabak hazırlamak için, agarose çözeltisi içeren soğutulmuş cam şişeyi 200 mL deiyonize su (dH2O) ile doldurulmuş 1 L plastik bir kabın içine yerleştirin. Agarose karışımını araştırma sınıfı bir mikrodalga fırında 2 dakikaya kadar eritin, şişeyi hafifçe yana yatırarak her 60 s'de bir agarı karıştırın.
    DİkKAT: Mikrodalga fırında agar eritmek, şişe kabının aşırı derecede ısınmasına ve basınç birikmesine neden olur. Her 30 s'de bir basınç birikmesi bırakın. Yaralanmayı önlemek için uygun koruyucu ekipman giyin.
  3. %1 agarose (wt/vol) son konsantrasyon için 42 °C'ye önceden ısıtılmış 12 mL KSFM-scm'ye 3 mL eritilmiş %5 agarose ekleyin.
    İsteğe bağlı: yumuşak agarın erken polimerizasyonunu önlemek için serolojik pipetleri ve pipet uçlarını önceden ısıtın.
  4. Hızlı bir şekilde pipet 200 μL% 1 agar karışımı çok kanallı pipetör kullanarak 96 kuyulu yuvarlak tabanlı plakanın bireysel kuyularına karışır (Şekil 1A). Agarose'un tamamen polimerize olmasını sağlamak için plakayı 25 °C'de 4 saat steril ortamda bırakın.
    NOT: Denemeler burada durdurulabilir ve ertesi gün devam edilebilir. Polimerize agaroz plakaları, parafilm sargısı ile kapatıldığında 37 °C'de 24 saate kadar veya 4 °C'de 48 saate kadar muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce en az 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'ye kadar ılık plaka.
  5. Pasaj sferoid oluşturan NHKc, 2 mL PBS'de ortam ve yıkama hücreleri soluyarak. PBS'yi aspire edin ve yıkanmış hücrelere% 0.25 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyin. 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya ya da tüm hücreler tamamen çözülene kadar kuluçkaya yatır. Tabağa 2 mL Soya Trypsin Inhibitörü ekleyin ve plakadaki hücreleri 15 mL'lik bir tüpe yıkayın. 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj.
  6. Peleti 1 mL PBS'de yeniden dirsintir. Trypan mavisi boyama ve hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre canlılığını ölçün.
  7. Aliquot 2 x 104 NHKc 100 μL KSFM-scm ve tohum daha önce hazırlanmış 96 kuyulu yuvarlak-alt plaka bireysel kuyulara. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
  8. Ters faz kontrast mikroskobu kullanarak, epidermosfer oluşumu için tohumlanmış iyi analiz edin.
    NOT: Normal insan keratinositlerinden elde edilen insan epidermosferleri, hücre canlılığında önemli bir azalma olmasına rağmen, 3D süspansiyon kültüründe 96 saate kadar yaşayabilir (Şekil 2).

3. Epidermal sferoid yeniden kaplama tahlil

  1. 3D epidermosfer oluşumundan sonra 24-48 saat, 6 cm'lik bir yemeğe 4 mL önceden ısıtilmiş KSFM-scm ekleyin. Tek bir sferoidi plakaya aktarmak için geniş bir delikli 1 mL pipet ucu kullanın, parçalanmamasını sağlayın. Alternatif olarak, ucu kesmek için steril bir jilet kullanarak 1 mL pipet ucunu genişletin.
  2. Plakayı gece boyunca kuluçkaya bırakın (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
  3. Plakanın dibine bağlanmak için tohumlu küreseli analiz edin ve ters faz kontrast mikroskobu kullanarak hücreleri yaymak için gözlemleyin (Şekil 3). Plakanın içindeki 2 mL ortamı nazikçe çıkararak ve yavaşça plakaya 2 mL taze KSFM-scm ortam ekleyerek her 96 saat hücre besleyin.
  4. Pasaj sferoid türevli (SD) NHKc% 70-80 izdiah süresine ulaştıklarında ve seçim testine devam ettikleri zaman. Hücrelerin kültürde tam izdiaha ulaşmasını önlemek için SD-NHKc'yi sık sık izleyin, çünkü bu erken farklılaşma ve hücre büyümesi durması ile sonuçlanır (Şekil 3E-F).
  5. Epidermal sferoid replating test modelleri keratinosit aracılı yara onarımı epidermal rejeneratif plastisitenin önemli sıralı aşamalarının her birini yakalayarak: a) homeostatik bakım, b) diferansiyel durdurma/tersine çevirme c) stres soyu hareketliliği ve d) doku restorasyonu (Şekil 1B; Tablo 2). Bu tahlil, organotipik sal kültürleri için hücre popülasyonları üretmek veya önceki çalışmamızda gösterildiği gibi HPV aracılı neoplazi modellemek için de kullanılabilir 11,12.

4.3D floresan hücre takibi

  1. 6 cm'lik bir tabakta, gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) geni taşıyan 1 μg pMSCV-IRES-EGFP plazmid vektörü ile transfect sferoid oluşturan 2D monolayer NHKc kültürleri. Bir gecede inkübte plaka (37 °C, %5 CO2,%95 nem) mikroskop (Şekil 4A).
    NOT: Serumsuz antibiyotiksiz koşullarda transfeksiyonun tamamlanması önemlidir.
  2. Transfeksiyon karışımını çıkarmadan, hücrelere 2 mL önceden uyarılmış KSFM-scm ekleyin. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
  3. Plaka ve besleme hücrelerindeki tüm transfeksiyon ortamlarını 3 mL önceden ısıtılmış KSFM-scm ile aspire edin.
  4. Pasaj ve tohum 2 x10 4 EGFP transfected hücreler daha önce hazırlanmış 96 kuyulu yuvarlak tabanlı bir plakanın bireysel kuyularına. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO2,%95 nem). Egfppos sferoid hücre hareketini floresan mikroskobun FITC kanalı altında görselleştirin ve izleyin (Şekil 4B-C).
  5. Kaplamadan 24 saat sonra, 6 cm'lik bir tabağa 3 mL önceden ısıtilmiş KSFM-scm ekleyin. Tek bir sferoidi plakaya aktarmak için geniş bir delikli 1 mL pipet ucu kullanın, parçalanmamasını sağlayın. Bir gecede kuluçka plakası (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
  6. Floresan mikroskobu kullanarak yayılan SD-NHKcEGFP'yi gözlemleyin ve analiz edin. Plakanın içindeki 2 mL'lik ortamı nazikçe çıkararak ve yavaşça plakaya 2 mL taze KSFM-scm ortam ekleyerek her 96 saat hücre besleyin.
  7. FACS izolasyonu veya tercih edilen tahliller için hasat SD-NHKCEGFP.

5. Küresel türevli (SD) alt popülasyonların FACS tarafından karakterizasyonu

  1. Pasaj SD-NHKc ve eski medyayı aspire ederek ve hücreleri 2 mL PBS'de yıkayarak ilgili otolog 2D monolayer kültürleri. PBS'yi çıkarın ve yıkanmış hücrelere % 0,25 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyin. 37 °C'de 5 dakika veya tüm hücreler tamamen çözülene kadar kuluçkaya yatır.
  2. Plakaya 2 mL Soya Trypsin Inhibitörü ekleyin ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj.
  3. Peletleri 1 mL PBS'de yeniden sunun. Trypan mavisi ve otomatik bir hemositometre hücre sayacı kullanarak hücre canlılığını ölçün.
  4. 0,1-4 x 106 NHKc hücre içeren Aliquot 100 μL'den 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere. Laminar kaputun içindeki parlak ışıkları kapatarak oluşturulan karanlık bir ortamda tüpü buzun üzerine yerleştirin.
  5. 1:50 seyreltme elde etmek için tüplere 2 μL FITC konjuge anti-integrinα6 ve 2 μL PE-konjuge anti-EGFR ekleyin. Tespit edilmemiş kontrol görevi görmek için antikor eklenmemiş bir tüp hazırlayın. Tüpleri karanlıkta veya 4 °C'de 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Boncukların veya bir cilt SCC hattının kullanımı, cilt SCC hücrelerinin yüksek integrinα6 ve EGFR seviyelerini ifade ettiği için pozitif kontrol görevi görebilirsiniz.
  6. Uygun lazerler içeren tercih edilen akış sitometresini kullanarak akış sitometrisi analizi yapın.
  7. Kapıları kurmak için negatif ve pozitif kontrolleri kullanın. Integrinα6hi/EGFRlo hücrelerinin alt nüfusunu sıralayın; bunlar epidermal kök hücre fraksiyonudur. Integrinα6hi/EGFRhi hücreleri proliferatif progenitör hücre fraksiyonudur. Integrinα6lo/EGFRhi hücreleri taahhüt edilen progenitör hücre fraksiyonudur (Şekil 4D). SıRALAMA FACS tüpleri en az 1 mL buz-soğuk KSFM-scm içermelidir.
  8. Her bir sıralama tüpünün içeriğini PBS'deki sıralanmış hücrelerin hacminin 10 katını içeren 15 mL konik bir tüpe aktararak sıralanmış hücre alt nüfuslarının proliferatif kapasitesini test edin. NOT: Keratinositler sık sık oraya yapışabileceğinden, sıralama FACS tüplerinin duvarını birkaç kez pipetleyarak janta bağlı tüm hücrelerin çıkarılması önemlidir.
  9. 5 dakika boyunca 250 x g'da 15 mL tüpleri santrifüj edin. 12 mL KSFM-scm'de süpernatant ve resuspend peletini çıkarın. Yeniden sulanan hücreleri 6 cm'lik bir plakaya aktarın ve gece boyunca kuluçkaya bırakın (37 °C, %5 CO2, %95 nem).
  10. Ertesi gün, plakalardaki medyayı çıkarın ve 8 mL önceden ısıtılmış KSFM-scm ekleyin. Hücreleri% 70-80 birleştiği zamana kadar her 3 günde bir 12 mL ortamla yeniden besleyin (Şekil 4E).

6. Bazal kök hücre belirteçleri için epidermosferlerin immünofluoresansı ve boyanma

  1. Epidermosferleri poli lizin ile kaplanmış kapaklara aktarın. SD-NHKc'nin %75 bir araya gelene kadar yayılmasına izin verin.
  2. Hücreleri PBS'de (4 °C) iki kez 5'er dakika yıkayın.
  3. %4 paraformaldehit (PFA) içeren hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika sabitlayın.
  4. %1 glisinin %0,5 Triton X-100 ile hücreleri permeabilize eder. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca % 0.5 BSA ve% 5 keçi serumu kullanarak engelleyin.
  5. Örnekleri P63 (1:200) ve sitokeratin 14'e (1:200) karşı antikorlarla bir gecede 4 °C'de bloke çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  6. Tween 20 (PBST) içeren PBS (4 °C) ile üç kez yıkayın, ardından FITC ve Alexa 568 konjuge ikincil antikorlarla (1:1000 seyreltme) inkübasyon.
  7. Hücreleri monte etmeden önce 4', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1:5000 seyreltme) ile nuclei leke.
  8. FITC ve PE lazer hatları ile floresan özellikli bir mikroskop kullanarak hücreleri gözlemleyin (Şekil 4F).

7. Epidermosfer kültürlerinin transkripsiyon analizi

  1. RNA'yı izole etmek için düşük geçişli NHKc kültürlerinin üç taraflı plakalarını kurmak, aynı otolog hücre hattından monolayer, küresel ve küresel türetilmiş kültürlerden olabilir.
  2. Havuz 3-5 karşılık gelen epidermosferler 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne. Otolog SD-NHKc ve 2D monolayer kültürlerini ayrı ayrı hasat edin.
  3. Toplam RNA'yı üç gruptan da ayır.
  4. Toplam RNA'nın 1 μg'si ile ters transkripsiyon gerçekleştirin.
  5. cDNA kullanarak, GAPDH'yi dahili kontrol olarak kullanarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin (Tablo 1).
  6. Amplicon ürün boyutunu agarose jel elektroforez (%2 v/v) ile doğrulayın.
    NOT: Epidermosfer kültürlerinin tam genom mikroarray analizi kullanılarak transkriptomik olarak profillenerek, toplam RNA'yı tek bir NHKc donörün kütle kültürlerinden ve aynı donörden karşılık gelen SD-NHKc'den izole edin, her biri altı kopya halinde.
  7. En az 9,0 ile 9,1 arasında değişen RNA Bütünlük Numaraları (RIN) elde etmek için bir biyoanalyzer kullanarak RNA kalitesini değerlendirin.
  8. Toplam RNA örneklerini yükselterek ve biyotinilasyon yaparak mikroarray deneyleri yapın.
  9. T7 RNA polimeraz promotör serisi içeren NNN rastgele astarları kullanarak örnek başına toplam RNA'nın 100 ng'lik kısmını ds-cDNA'ya ters yazıya dökün.
  10. RNA'yı yükseltmek için cDNA örneklerine T7 RNA polimeraz ekleyin, ardından RNA'yı ss-cDNA'ya kopyalayın. RNase H kullanarak fazla RNA'yı düşürün.
  11. SscDNA moleküllerini parçala ve biotin ile etiketle.
  12. Etiketli numuneleri 45 °C'de 16 saat boyunca yükseltin.
  13. Bir hibridizasyon fırını ve yıkama ve leke kiti kullanarak numuneleri melezleştirin.
  14. Melez dizileri yıkayın ve lekelendirin.
  15. Sistem ve bilgisayar iş istasyonu kullanarak dizileri tarayın.
  16. Dizi taramalarının tamamlanmasının ardından, chp dosyaları oluşturmak için kütüphane dosyası ve Sağlam Çok Keskin Analiz (RMA) algoritmasını kullanarak prob hücresi yoğunluğu (CEL) dosyalarını ifade konsolu yazılımına ve gen düzeyinde işleme alın.
  17. Expression Console'daki veri kalitesini onayladıktan sonra, her bir prob için log2 ifade sinyallerini içeren CHP dosyalarını, varyansların tek yönlü konu analizi kullanarak hücre türüne özgü transkripsiyonel yanıtları analiz etmek için bir transkriptom analiz yazılımına aktarın.

8. SD-NHKc koloni oluşturma verimliliğinin değerlendirilmesi

  1. Hücreler% 70-80 izdiah süresine ulaştığında plakalardan ortam aspirat. Hücreleri PBS 'de (4 °C) her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  2. Hücreleri 15 dakika boyunca 3 mL% 100 metanol (4 °C) ile sabitleyin. PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  3. 30 dakika boyunca 3 mL%10 Giemsa'da leke hücreleri. PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Hücrelerin gece boyunca kurumasına izin verin.
  4. Ertesi gün koloni oluşumunu analiz edin ve elde edilen koloni sayısını ölçün

9. SD-NHKc popülasyonu iki katına çıkması

  1. Pasaj SD-NHKc ve eski medyayı arzulayarak ve 2mL PBS'de hücreleri yıkayarak ilgili otolog 2D monolayer kültürleri. PBS'yi çıkarın ve yıkanmış hücrelere 2 mL% 0.25 Trypsin-EDTA ekleyin. 5 dakika boyunca veya tüm hücreler tamamen kopana kadar kuluçkaya yatır (37 °C, %5 CO2,%95 nem).
  2. Plakaya 2 mL Soya Trypsin Inhibitörü ekleyin ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  3. 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj.
  4. 12 mL KSFM-scm'de süpernatant ve resuspend peletini çıkarın.
  5. Düşük yoğunluklu tohum hücreleri 1-2 x 104 NHKc'yi tek tek 10 cm'lik yemeklere ayırır ve gece boyunca kuluçkaya yaslar (37 °C,%5 CO 2,%95 nem).
  6. Ertesi gün 8 mL KSMF-scm besleme plakaları. En az% 25 birleştiği zamana kadar her 4 günde bir besleyin, ardından her 2 günde bir besleyin.
  7. Hücre proliferatif kapasitesi tükenene kadar 60 cm'lik yemeklerde 1:5 hücre geçişi. Trypan mavi boyama ile hücre canlılığını ölçün. Her pasajda popülasyon ikiye katlamalarını şu formülü kullanarak belirleyin: log (N/N 0) / log2, burada N her pasajda elde edilen toplam hücre sayısını veN 0 deneyin başlangıcında kaplanmış hücre sayısını temsil eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Cilt epidermosfer tahlilleri sırasında, NHKc kültürleri 96 kuyu plakasının agarose kaplı kuyularında tohumlanır (Şekil 1A). Küresel oluşturan hücreler 48 saat içinde kendi kendine toplanmalı. Otonom küresel oluşum, standart bir ters faz kontrastı mikroskobu kullanılarak 24 saat kadar erken bir sürede değerlendirilebilir. cilt epidermosfer oluşumu ve yeniden kaplama tahlil modeli epidermal doku yenilenmesinin çeşitli evreleri (Şekil 1B). Şeki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

3D küresel kültür sistemlerinin kullanımı hücre saplığını değerlendirmede geniş bir faydaya sahiptir. Bu sistemlerin doku kök hücrelerinin zenginleştirilmesini artırdığı gösterilmiştir13, ancak insan epidermal kök hücrelerinin incelenmesi için yararları sınırlı olarak araştırılmıştır. Burada, 3D kültür tekniklerini kullanarak insan keratinosit kök hücrelerini zenginleştirmek için bir strateji açıklıyoruz. Bu sistemde, NHKc, KSFM-scm içeren agarose yatakların üzerine asılan birkaç keratinosit alt t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak finansal ilişkileri yok.

Teşekkürler

UofSC Tıp Fakültesi Enstrümantasyon Kaynak Tesisi (IRF), görüntüleme ve hücre sıralama ekipmanlarına ve teknik yardıma erişim sağladı. Bu çalışma kısmen 1R21CA201853 hibesi ile desteklendi. MCF ve IRF, NIH hibe P20GM103499, SC INBRE'den kısmi destek alır. MCF ayrıca NIH hibe P20GM109091'den de destek alır. Yvon Woappi kısmen NIH tarafından 2R25GM066526-06A1 (PREP) ve R25GM076277 (IMSD) hibeleri ve UofSC'deki Grace Jordan McFadden Profesörler Programı tarafından burs ile desteklenmiştir. Geraldine Ezeka ve Justin Vercellino, UofSC'de NIH hibeleri 2R25GM066526-10A1 (PREP) tarafından desteklendi. Sean M. Bloos, UofSC'de 2016 Magellan Akademik Ödülü ile desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Affymetrix platformuAffymetrixMikrodizi deneyleri için
Affymetrix' s HuGene-2_0-st kütüphane dosyasıAffymetrixProcess
Agilent 2100 BiyoanalizörAgilentMikrodizi deneyleri için
Tüm Hazırlık DNA/RNA Mini KitiQiagen80204RNA izolasyonu için kullanılır
Analiz Konsolu Yazılımı sürüm 3.0.0.466Varyansın denekler arası tek yönlü analizini kullanarak hücre tipine özgü transkripsiyonel yanıtları analiz edin
BD FACSAria II akış sitometresiBeckmanAkış sitometrisi için
Konsol Yazılımı sürüm 3.0.0.466/Expression konsol YazılımıAffymetrix/Thermo Fisher ScientificVeri kalitesini doğrulamak için
Cytokeratin 14Santa Cruz Biotechnologysc-532531:200 seyreltme
DispaseSigma-AldrichD4818Hücre ortamı için
FITC-konjuge anti-integrin & alfa; 6Abcamab30496FACS analizi için
GeneChip Komut Konsolu 4.0 yazılımıAffymetrix/Thermo Fisher ScientificVeri kalitesini doğrulamak için
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)Affymetrix/Thermo Fisher ScientificHibritleştirilmiş dizilerin yıkanması ve boyanması için
GeneChip HuGene 2.0 ST DizileriAffymetrix/Thermo Fisher BilimselToplam RNA'nın hibridizasyonu, amplifiyesi için
GeneChip Hibridizasyon Fırını 640Thermo Fisher Scientific, toplam RNA'nın hibridizasyonu, amplifyasyonu ve amplifyasyonu için | Etiketli numuneleri çoğaltın
: GeneChip, Hibridizasyon, Yıkama ve Leke Kiti (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).Affymetrix/Thermo Fisher ScientificHibritleştirilmiş dizilerin yıkanması ve boyanması için
GeneChip Tarayıcı 3000 7G sistemiAffymetrix/Thermo Fisher ScientificHibritleştirilmiş dizileri tarama
GeneChip WT PLUS Reaktif KitiAffymetrix/Thermo Fisher ScientificBiyotinillenen toplam RNA'nın amplifasyonu için
İnsan Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (hFGF bazik/FGF2)Hücresi Hücre ortamı için Sinyalizasyon Teknolojisi8910
İnsan Epidermal Büyüme Faktörü (hEGF)Hücre Sinyal Teknolojisi8916Hücre ortamı için
İnsan İnsüliniMillipore Sigma9011-MHücre ortamı için
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)RT-qPCR için KullanılanBio-Rad
1708880 iScript cDNA Sentez KitiBio-Rad1708890İçin Kullanılır RT-qPCR
KSFMThermoFisher Scientific17005041% 1 Penisilin / Streptomisin, 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml < / > bazik fibroblast büyüme faktörü,% 0.4 sığır serum albümini (BSA) ve% 4 & mikro ile desteklenmiştir; g / ml insülin
KSFM-scmThermoFisher Scientific17005042% 1 Penisilin / Streptomisin, 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml < br / > bazik fibroblast büyüme faktörü,% 0.4 sığır serum albümini (BSA) ve% 4 & mikro ile desteklenmiştir; g/ml insülin
MCDB 153-LB bazal ortamSigma-AldrichM7403MCDB 153-LB bazal ortam, HEPES tamponlu
NEST Scientific 1-Kuyucuklu Hücre Kültürü Odası Slaytı, Cam Slayt Üzerinde SİYAH Duvarlar, 6/PK, 12/CSİmmün boyama içinStellar ScientificNST230111
P63Thermo Scientific7038091:200 seyreltme
PE konjuge anti-EGFR ( San Jose, CA; katalog numarası )BD Pharmingen555997FACS analizi için
pMSCV-IRES-EGFP plazmid vektörüAddgene20672Transfeksiyon için
Promega TransFast kitiPromegaE2431Transfeksiyon için
Qiagen RNeasy Plus Micro KitQiagenMikroarray deneyleri için
Thermo Scientific & trade; Steril Tek Kullanımlık Vakum Filtre ÜniteleriThermo Scientific09-740-63DHücre ortamı için
Zeiss Axionvert 135 floresan mikroskobuZeissAxiovision Rel. 4.5 yazılımı ile kullanın

Kaynaklar

  1. Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
  2. Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
  3. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
  4. Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
  5. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608(2020).
  6. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  7. Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407(2020).
  8. Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
  9. Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
  10. Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
  11. Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
  12. Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
  13. Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
  14. Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
  15. Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
  16. Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Keratinosit K k H creleriSferoid Yeniden Ekim AnaliziY ksek Kapasiteli SistemEpidermal RejenerasyonAk SitometrisiNormal nsan Keratinositlerintegrin Alfa AltEGFR D k H creler3D H cre K lt r
Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.