Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

2.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62201

⸱

2 Şubat 2021

 , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

Bu makalede

Özet

Burada, nötr lipitlerin ayrılması için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilen 14C-asetik asit ile mayanın metabolik etiketlemesi için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Nötr lipitler (NL'ler), enerji ve lipid homeostazında kilit roller oynayan hidrofobik, şarjsız biyomoleküller sınıfıdır. NL'ler asetil-CoA'dan sentezlenir de novo ve öncelikle ökaryotlarda trigliseritler (TG' ler) ve sterol esterleri (SE' ler) şeklinde bulunur. NL'lerin sentezinden sorumlu enzimler, Saccharomyces cerevisiae'den (maya) insanlara yüksek oranda korunur ve mayayı NL metabolizma enzimlerinin işlevini ve düzenlemesini parçalamak için yararlı bir model organizma haline getirir. Asetil-CoA'nın çeşitli NL türlerine nasıl dönüştürüldüğü hakkında çok şey bilinmesine gerek varken, NL metabolizma enzimlerini düzenleme mekanizmaları ve yanlış düzenlemenin hücresel patolojilere nasıl katkıda bulunabileceği hala keşfedilmektedir. NL türlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için onlarca yıllık araştırmalar boyunca çok sayıda yöntem geliştirilmiş ve kullanılmıştır; bununla birlikte, büyük NL türlerinin kapsamlı karakterizasyonu için nicel ve basit bir protokol tartışılmamıştır. Burada, mayadaki büyük NL türlerinin de novo sentezini ölçmek için basit ve uyarlanabilir bir yöntem sunulmuştur. Fizyolojik açıdan önemli NL'lerin çeşitli aralıklarını ayırmak ve ölçmek için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilmiş 14C-asetik asit metabolik etiketleme uyguluyoruz. Ayrıca, bu yöntem NL enzimlerinin in vivo reaksiyon oranlarını veya NL türlerinin zaman içinde bozulmasını incelemek için kolayca uygulanabilir.

Giriş

Asetil-CoA, membran oluşturmak, ATP üretmek ve hücre sinyalini düzenlemek için çok yönlü bir biyomoleküler para birimi olarak hizmet veren nötr lipitler (NL' ler) dahil olmak üzere çeşitli biyomoleküllerin temel yapı taşıdır1,2. Bu ilgili yollardan herhangi birine sokılacak NL'lerin kullanılabilirliği, kısmen depolamaları tarafından düzenlenir. Lipid damlacıkları (LD'ler), trigliseritlerin hidrofobik çekirdeklerinden (TG' ler) ve sterol esterlerinden (SE) oluşan sitoplazmik organeller, çoğu hücresel NCI'nın ana depolama bölmeleridir. Bu nedenle, LD'ler, biyokimyasal ve metabolik süreçler için bozulabilen ve daha sonra kullanılabilecekNL'leriinzal eder ve düzenler 3,4. NL ve LD ilişkili proteinlerin yanlış düzenlenmesinin lipodystrofi ve metabolik sendromlar5,6dahil olmak üzere patolojilerin başlangıcı ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, mevcut LD araştırmaları yoğun bir şekilde NL sentezinin mekansal, zamansal ve çok hücreli organizmaların farklı dokularında nasıl düzenlendiğine odaklanmıştır. NL'ler için her yerde bulunan hücresel roller nedeniyle, NL'lerin sentezi ve düzenlenmesinden sorumlu birçok enzim ökaryotlar boyunca korunur7. Gerçekten de, bazı prokaryotes bile LD'lerde NL'leri depolar8. Bu nedenle, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) gibi genetik olarak çekilebilir model organizmalar NL sentezi ve regülasyonu için yararlı olmuştur.

NL'lerin hücre özlerinden ayrılması ve nicelleştirilmesi, gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve ultra performanslı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (UPLC-MS) 9,10,11dahil olmak üzere sayısız şekilde gerçekleştirilebilir. NL'leri ayırmak için belki de en basit yöntem, standart bir eğri12 , 13'ten sonraki densitometrik niceleme sağlayan ince tabaka kromatografisi (TLC) yoluyladır. TLC, NL'lerin yalnızca ders taneli bir ayrımını sağlasa da, ucuz olduğu için güçlü bir teknik olmaya devam eder ve AYNı anda birkaç örnekten NL'lerin hızlı bir şekilde ayrılmasına izin verir. TLC aracılığıyla NIS'lerin incelenmesinin karşılaştığı en önemli zorluklardan ikisi şunlardır: 1) NL türlerinin ve aralarının geniş hücresel bolluk yelpazesi ve 2) NL sentez yolları içindeki lipid aralarının hidrofililik / hidrofobikliği aralığı. Sonuç olarak, NL türlerinin TLC aracılığıyla nicelemesi tipik olarak en bol türlerle sınırlıdır; bununla birlikte, 14C-asetik asit radyolabelinin tanıtılması, NL yollarında düşük bolluklu ara maddelerin tespitini önemli ölçüde artırabilir. Asetik asit, asetil-CoA sentezi ACS214tarafından hızla asetil-CoA'ya dönüştürülür, bu da 14C-asetik asidi mayada uygun bir radyolabelingsubstratı yapar 15. Ek olarak, hem hidrofobik NCI'lerin hem de NL'lerin hidrofilik aralarının ayrılması, çoklu solvent sistemleri kullanılarak TLC tarafından elde edilebilir16. Burada, mayada 14C-asetik asit metabolik etiketleme kullanılarak NL'lerin ayrılması için bir yöntem sunulmuştur. Nabız döneminde etiketlenen lipitler daha sonra iyi kurulmuş bir toplam lipid izolasyon protokolü17, ardından NL türlerinin TLC ile ayrılması. Etiketli lipitleri görselleştirmek için hem otoradyografi hem de toplam lipitleri görselleştirmek için kimyasal bir sprey ile TLC plakalarının geliştirilmesi, birden fazla niceleme yöntemine izin sağlar. Bireysel lipid bantları da jilet kullanılarak TLC plakasından kolayca çıkarılabilir ve bant içindeki radyolabelli malzeme miktarını ölçmek için scintillation sayımı kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Maya hücrelerinin 14C-asetik asit ile büyümesi ve etiketlenerek etiketlenerek

  1. Bir tabaktan bir koloni seçerek ve % 2 dekstroz içeren 20 mL sentetik komple (SC) ortama dağıtarak bir maya kültürünü aşılayın (BKZ. SC ortamı tarifi için Ek Dosya). 200 rpm'de sallanarak bir gece boyunca 30 °C'de kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Büyüme durumu, örnek hacmi ve tedavi, ilgi çekici lipitlere göre farklılık gösterecektir. Tam deneyler yapmadan önce, optimal büyüme koşulları ve kültür hacimleri ampirik olarak belirlenmelidir. Bu protokol, sabit faza yetiştirilen maya kültürlerinin radyolabelingini, biyo-membran ve hücre büyümesinin yavaşladığında bir büyüme aşamasını ve NL sentezinin çok aktif olduğunu tartışır.
  2. Spektrofotometre kullanarak geceleme kültürünün OD600'ünü ölçün ve maya hücre kültürünü% 2 dekstroz içeren50 mL taze SC medyasında 0,2'nin son OD 600'üne seyreltin. Hücreleri 24 saat boyunca veya sabit faza ulaşana kadar büyütün (genellikle OD600 ölçümünü iki katına çıkaran hücrenin düz bir astarı ile tanımlanır).
  3. Hücreleri toplamadan önce, söndürme arabelleği yapın (ayrıntılar için Ek Dosya'ya bakın). Her numune için iki adet 20 mL'lik söndürme tamponu yapın (yani, her örnek için 40 mL söndürme tamponu) ve iki adet 50 mL konik tüpe eşit olarak bölün. Söndürme tampon aliquots'u ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
  4. Kültürler istenen OD veya büyüme aşamasına ulaştıktan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüjleyarak toplayın. Numuneler santrifüjdeyken, dekstrozsuz SC ortamına 10 μCi/mL'lik son konsantrasyonda[1- 14C] asetik asit sodyum tuzu ekleyerek radyolabeling ortamı hazırlayın.
    DİkKAT: Radyoaktif malzemelerle çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) her zaman giyilmelidir. Radyoaktif maddelerin uygun şekilde depolanmasını, kullanımını ve bertaraf edilmesini için her zaman yerel kurallara uyun.
    NOT: Hem etiketleme ortamındaki 14C-asetik asit konsantrasyonu hem de radyolabeling inkübasyon süresi ilgi çekici metabolitlere göre ayarlanmalıdır. Burada, NL türlerini bir dizi bollukla etiketlemek için yeterli olan 20 dakikalık bir radyolabeling darbe inkübasyonu kullanılır.
  5. Üstnatantı peletlenmiş hücrelerden çıkarın ve peletin pipetle yeniden canlanarak hücre peletini 20 mL dekstrozsuz SC ortamıyla bir kez yıkayın. 5 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüj yaparak hücreleri tekrar toplayın.
  6. Hücreleri 1 mL dekstroz içermeyen SC ortamına yeniden boşaltın ve hücreleri etiketli 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 2 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüj yaparak hücreleri tekrar toplayın.
  7. Hücreleri 500 μL dekstroz içermeyen SC medyasında bir kez daha yeniden biriktirin. 50 mL konik borular için donatılmış bir santrifüjü -10 °C'ye veya en düşük sıcaklık ayarına önceden soğutun.
  8. Her 500 μL hücre süspansiyonuna (son 14C-asetik asit konsantrasyonu = 5 μCi/mL) hızlı bir şekilde 500 μL radyolabeling ortamı ekleyerek radyolabeling dönemine başlayın. Etiketleme süresinin bitiminden 2 dakika önce 30 °C'de dönen bir inkübatörde tüpleri kuluçkaya yaslanın, -80 °C dondurucudan bir kova buz için her numune için bir adet 20 mL'lik söndürme tamponu aktarın
  9. Radyolabeling süresi sona erdiğinde, 1 mL örneğin tamamını 20 mL soğuk söndürme tamponuna daldırmak için bir pipet kullanın. Numunenin söndürme tamponu ile iyice karıştırıldığından emin olmak için 5-10 sn konik tüpleri vorteks edin. Numuneleri buz üzerinde 2 dakika boyunca söndürme tamponunda kuluçkaya yatırın.
  10. -10 °C'ye ayarlanmış 3 dakika boyunca veya en düşük sıcaklık ayarında 5.000 x g'da bir santrifüjde dönerek hücre peletini toplayın. Numune tüpleri dönerken, -80 °C dondurucudan başka bir söndürme tamponu aliquot setini buzla dolu bir kovaya aktarın (yani, numune başına bir adet 20 mL'lik söndürme tamponu tüpü).
  11. Söndürme tamponu üstnatantı hücre peletlerinden çıkarın ve 20 mL taze, soğuk, söndürme tamponu ile değiştirin. Vorteks ve pelet konik tüpün dibinden yerinden çıkana ve söndürme tamponunda tamamen yeniden depolanana kadar örnekleri çalkalayın. Hücreleri toplamak için numuneleri -10 °C'de 3 dakika boyunca 5.000 x g'da tekrar santrifüjlayın.
  12. Hücreler peletlendikten sonra, üsttan dökerek ve fazlalıkları bir pipetle çıkararak tüm söndürme tamponunu numunelerden iyice çıkarın. Daha fazla işlem için tüpleri -80 °C'de saklayın.

2. Toplam lipitlerin mayadan izolesi

NOT: Lipid izolasyonu için aşağıdaki protokol, çoğu nötr lipit türünü verimli bir şekilde ayıklayan köklü ve sık kullanılan bir yönteme dayanmaktadır17,18.
DİkKAT: Organik çözücü kullanırken, her zaman uygun KKD giyin ve mümkün olduğunda bir duman davlumbazının içinde çalışın. Lipid ekstraksiyonu sırasında, organik çözücülerle uyumsuz plastikler kullanmaktan kaçının. Polipropilen tüpler aşağıdaki protokol için uygundur.

  1. Her numune için 0,3 g asitle yıkanmış cam boncuk tartın ve bunları buz üzerinde 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. Hücre topaklarını -80 °C dondurucudan çıkarın ve buzda tutun. Her numuneye 350 μL metanol ve 700 μL kloroform ekleyin, yeniden ıslatın ve önceden tartılmış cam boncuklar içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
  2. Lyse hücreleri, bir girdap üzerindeki tüpleri 1 dakika boyunca 3x ile ajitasyonlar arasında buz üzerinde 30 s inkübasyon ile. Alternatif olarak, hücreler üç 1 dakikalık döngüler için mini boncuk çırpıcı kullanılarak yutlanabilir. Scintillation sayımı için ayrı bir tüpte 25-30 μL tüm hücre lisatını sakla.
    NOT: Kaydedilen lisat, darbe süresi boyunca her numune tarafından alınan ve TLC plakasına yüklenen her numunenin miktarını etkileyecek olan göreceli radyoizotop miktarını belirlemek için kullanılacaktır. Bu, 3.2 adımında daha fazla tartışılmıştır.
  3. 2 mL mikrosantrifüj tüpünün tüm içeriğini 15 mL cam santrifüj tüpüne [Tüp A] dökün. 2 mL mikrosantrifüj tüplerini 1 mL metanol ekleyerek ve 10-15 sn boyunca girdaplayarak yıkayın. 1 mL metanol yıkamayı A tüpüne aktarın ve A tüpüne 2 mL kloroform ve ardından 4,45 mL'lik son numune hacmi için 400 μL su ekleyin.
  4. 1 dakika boyunca Vortex örnekleri ve ardından 1.000 x g'da5 dakikalık bir santrifüjleme. Santrifüjlemeden sonra, sulu (üst) ve organik (alt) aşamalar, arayüzde yatan hücre kalıntıları ile açıkça görsel olarak ayrılmalıdır.
  5. Cam pastör pipet kullanarak, organik fazı A tüpünden toplayın ve yeni bir 15 mL cam santrifüj tüpüne (Tüp B) geçin. B tüpüne 1 mL 1M KCl ekleyin. A tüpüne 1 mL metanol ve 2 mL kloroform ve 200 μL MiliQ su ekleyin. A tüpündeki girdap ve santrifüj adımlarını tekrarlayın.
  6. Organik fazı bir kez daha A tüpünden toplayın ve B tüpüne ekleyin. Vortex tüp B 1 dakika boyunca 1.000 x g'da5 dk santrifüjleme.
  7. Üst sulu tabakayı B tüpünden çıkarın ve atın. B tüpüne 1 mL taze 1 M KCl ekleyin ve girdap/santrifüjleme adımını tekrarlayın. Katmanlar ayrıldıktan sonra, tüm alt organik tabakayı etiketli 4 mL cam şişeye dikkatlice toplayın.
    NOT: Bu adımda, lipid özleri -80 °C'de saklanabilir veya lipitlerin TLC ayrımı için protokole devam edilebilir.

3. Radyoizotop etiketli NL'lerin ince tabaka kromatografisi ile ayrılması ve nicelleştirilmesi

  1. Lipid özleri -80 ° C'ye yerleştirilmişse, yavaşça buzda ve daha sonra bir tezgahta inkübe ederek oda sıcaklığına getirin. Lipid özlerinden elde edilen çözücüyü vakumla kurutarak veya hafif bir inert gaz akışı (örneğin, argon veya azot) kullanarak tamamen buharlaştır. Bu arada, TLC plakasını ısıtmak için fırını 145 °C'ye ısıtın.
  2. Numuneler TLC plakasına yüklenmeden önce, hücreler tarafından alınan göreceli radyolabel miktarlarını belirleyin. Pipet 10 μL tüm hücrenin 2.2 adımından 6 mL cam scintillation şişesine dökülür, 6 mL scintillation sıvısı ekleyin ve şişeleri bir rafa yerleştirin. 1 dakika sayım süresine ayarlanmış sayım tek raf seçeneğini kullanarak her numunenin cpm veya dpm'sini ölçmek için bir scintillation sayacı kullanın. Her örnek için bir ortalama elde etmek için her hücrenin tamamını yinelenen olarak ölçün. Yükleme miktarını vahşi bir türe veya referans örneğine göre ayarlama
    NOT: TLC plakasına yüklenecek her numunenin miktarı aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir: (ortalama örnek sayıları)/(ortalama referans sayıları) x istenen yükleme hacmi. Örneğin, referans örneğinin 20 μL'si TLC plakasına yüklenecekse ve ortalama 1.000 sayısına sahipse, ortalama sayısı 2.000 olan deneysel bir numunenin TLC plakasına 10 μL'si yüklenecektir.
  3. Örnek lipitleri 40-50 μL 1:1 (v/v%) kloroform:methanol içinde 5 dakika boyunca girdapla yeniden inşa edin. Cam mezunu bir silindirde mobil faz çözücüsünü 101 mL hazırlayın (50:40:10:1 (v/v%) Hexane:Petrol eter:Dietil eter:Asetik asit çözücü) ile büyük NL türlerinin ayrılması örneği için Temsili Sonuçlar bölümüne bakın).
  4. Çözücüyü 20 x 20 TLC doygunluk pedi ve sıkı oturan bir kapak içeren bir cam TLC haznesine dökün. Bir kalem kullanarak plakanın altından 1,5 cm yukarıda bir çizgiyi hafifçe işaretleyerek kanallı 20 x 20 silika jel 60 G plaka hazırlayın. Hat, kökeni ve lipitlerin nereye yüklendiğini belirler. Çizginin altında, her şeride yüklenecek örneği hafifçe etiketle. TLC plakası hazırlandıktan sonra, plakayı önceden ısıtmak ve fazla nemi gidermek için plakayı 145 °C fırında en az 30 dakika kuluçkaya bırakın.
  5. Plaka yeterince ısıtıldıktan ve TLC doygunluk pedi çözücü ile doyurulursa, TLC plakasını fırından çıkarın ve hemen TLC plakasını yüklemeye devam edin. Plakanın sıcakken yüklenmesi hızlı çözücü buharlaşmasını sağlar. İlgi alan her lipit türü için, ayırmayı ve beklenen göç mesafesini izlemek için TLC plakasının bir şeridine 5-20 μg saflaştırılmış lipit standardı yükleyin. Bir pipet kullanarak, TLC plakasının altından 1,5 cm yukarıda bulunan her şeridin kökenine 5μL numuneyi noktalayın. Her şeride 20-40 μL numune yüklenene kadar 5 μL noktanın tekrar yüklenmesi.
    NOT: 5-20 μg etiketsiz saflaştırılmış lipitler, lipitlerin TLC ayrımından sonra boyanabilen ve görselleştirilebilen izleyiciler olarak her örnek şeride eklenebilir. Lekeli bir standardın varlığı, sonraki scintillation sayımı için radyolabeled lipid bantlarının kolay izlenmesini ve eksizyonunu sağlar. Plakaya hangi saflaştırılmış standartların yüklendiği NL ilgi gören türler tarafından belirlenecektir. Oleik asit (FFA), 1,2 dioleoyl-gliserol (DG), trilein (TG), kolesterol (Chol), kolesteril-linoleat (SE) ve örnek şeritlere bitişik şeritlerde squalene ayırma örnekleri için Temsili Sonuç bölümüne bakın.
  6. Standart ve deneysel numuneler yüklendikten sonra, plakayı gelişmekte olan odaya yerleştirin ve çözücü plakanın tepesine ulaşana kadar bekleyin (40-60 dk). Plaka tamamen geliştikten sonra, hazneden çıkarın ve duman kaputunda 20 dakika kurumasını bekleyin.
  7. Plaka kuruduktan sonra plastik filmle örtün ve otoradyografi ekranı ile gelişmekte olan bir kasete yerleştirin. Plakanın 24-48 saat boyunca ekranla gelişmesine izin verin.

4. TLC ayrılmış lipitlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi

  1. Ekranı gelişmekte olan kasetten çıkarın ve fosfor görüntüleyicinin içine yerleştirin. Fosfor Görüntüleme seçeneğini seçin ve 800-1000 V'ta geliştirin.
    NOT: Fosfor görüntüleme, TLC plakasındaki radyolabelli lipitlerin nitel bir görünümünü verir. Bununla birlikte, radyolabelli lipitlerin nicelemesi en iyi daha sonra açıklanan scintillation sayımı ile gerçekleştirilir.
  2. 100 mL p-anisaldehit reaktifini karıştırın (ek dosyayabakın) ve bir cam sprey şişesinde biriktirin. Silika doyurulana kadar TLC plakasını p-anisaldehit reaktifi ile püskürtün. Tabağı 145 °C fırında 5 dakika veya bantlar ortaya çıkana kadar pişirin.
  3. Radyolabel scintillation sayma kullanarak bireysel lipid türlerini ölçmek için, silika jelini cam TLC plakasından kazımak için bir jilet kullanın. Tek bir radyolabeled lipid türüne karşılık gelen her silika jel bandını bir cam scintillation şişesine aktarın ve 6 mL scintillation sıvısı ekleyin. Silika bandı küçük parçalara indirgenene kadar güçlü bir şekilde girdap.
    1. Alternatif olarak, lipitler bölüm 3'teki lipit ekstraksiyon protokolü kullanılarak silika jel bandından çıkarılabilir. Lipitler silika jelden çıkarılırsa, çözücüyü tamamen adım 3.1'deki gibi buharlaştırın ve kurutulmuş lipitlere 6 mL scintillation sıvısı ekleyin. Scintillation şişeleri içeren rafı bir scintillation sayacına yerleştirin. Tek rafı say seçeneğini belirleyin ve sayım süresini şişe başına 2 dakika olarak ayarlayın. Scintillation sayacından elde edilen sonuçlar yazdırılır ve çubuk grafik olarak görselleştirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolde, NL türlerinin etiketlenmesi, tespiti ve niceliğinin 14C-asetik asit metabolik etiketleme ile gerçekleştirilebileceğini göstermiş olduk. Büyük NL türleri 50:40:10:1 (v/v/v%) Heksan:Petrol eter:Dietil eter:Asetik asit (Şekil 1A,B)çözücü sisteminde ayrılabilir. Fosfor görüntüleme, etiketli serbest yağ asidi (FFA), triyasilgliserol (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) ve squalene (SQ) görselleştirilmesine izin verir (Şekil 1...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, mayadaki NL türlerinin sentezini nicel olarak izlemek için çok yönlü bir radyolabeling protokolü sunulmuştur. Bu protokol çok modülerdir, bu da prosedürün 3-6 gün içinde bitmesine izin verir. Ek olarak, kullanıcının TLC solvent sistemlerinin basit bir değişikliği ile ilgi çekici birkaç lipit türünü tespit etmesine izin vermeli olan lipit türlerini ve metabolitleri ayırmak için TLC kullanımı hakkında çok sayıda literatürvardır 16,19. Bu protokol radyolabel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu makalenin hazırlanmasında rakip bir çıkar olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışmanın tamamlanmasında yardım ve kavramsal tavsiyeler için Henne laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. W.M.H., Welch Vakfı (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Tıbbi Araştırma Fonu ve UT Southwestern Endowed Scholars Programı'ndan fonlarla desteklenmektedir. S.R, bir T32 programı hibesi (5T32GM008297) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
[1-C14] Asetik asit sodyum tuzu spesifik aktivite: 45-60mCiPerkinElmerNEC084H001MC
18: 1 1,2 dioleoil-sn-gliserolAvanti800811O
200 kanıt mutlak etanolSigma459836
Asitle yıkanmış cam boncuklar 425-600umSigmaG8772
Pastuer pipetler için kehribar ampullerFisher03-448-24
Amonyum Sülfat >% 99SigmaA4418
Beckman LS6500 sintilasyon sayacıPerkinElmerA481000
Kloroform (HPLC sınıfı)FisherC607SK
Kolesterol >% 99SigmaC8667
Kolesteril-linoleat >% 98SigmaC0289
Konsantre sülfürik asitSigma339741
Corning 50mL konik borular, santrifüj kapaklı polipropilenSigmaCLS430829
Dekstroz, susuz sınıfSigmaD9434
Dietil eter susuz sınıfSigma296082
Kurutma fırınıFisher11-475-155
EcoLume sintilasyon sıvısıVWRIC88247001
Eppendorf 5424R santrifüjFisher05-401-205
GE Depolama fosfor ekranıSigmaGE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 görüntüleyici
Buzlu asetik asit, ACS sınıfıSigma695092
Cam 6mL sintilasyon şişeleriSigmaM1901
Cam santrifüj tüp kapaklarıFisher14-595-36A
Cam santrifüj tüpleriFisher14-595-35A
Cam Pastör pipetiFisher13-678-20C
Hekzan, susuz sınıfSigma296090
L-Adenin >%99SigmaA8626
L-Alanin %>98SigmaA7627
L-Arginin %>99SigmaA1270000
L-Asparagin %>98SigmaA0884
L-Aspartat %>98SigmaA9256
L-Sistein %>97SigmaW326305
L-Glutamik asit monosodyum tuzu monohidrat %>98Sigma49621
L-Glutamin %>99SigmaG3126
L-Glisin %>99SigmaG8898
L-Histidin %>99SigmaH8000
L-İzolösin %>98SigmaI2752
L-Lösin %>98SigmaL8000
L-Lizin %>98SigmaL5501
L-Metionin, HPLC sınıfıSigmaM9625
L-Fenilalanin, reaktif sınıfıSigmaP2126
L-Prolin %>99SigmaP0380
L-Serin >%99SigmaS4500
L-Theronine, reaktif sınıfıSigmaT8625
L-Triptofan %>98SigmaT0254
L-Tirozin %>98SigmaT3754
L-Urasil %>99SigmaU0750
L-Valin %>98SigmaV0500
Metanol, ACS sınıfıFisherA412
Oleik asit >%99SigmaO1008
p-anyaldehitSigmaA88107
Petrol eteri, ACS sınıfıSigma184519
Fosfatidilkolin, dipalmitoil >%99SigmaP1652
PipetlerEppendorf2231000713
Potasyum klorür, ACS sınıfıSigmaP3911
Sodyum Hidroksit peletleri, sertifikalı ACSFisherS318-100
Skualen %>98SigmaS3626
Süksinik Asit kristal/sertifikalıFisher110-15-6
TLC doygunluk pediSigmaZ265225
TLC silika jel 60G cam kanallı plakaFisherNC9825743Floresan gösterge yok
Şeffaf plastik filmApollo829903
TrisinSigmaT0377
Triolein >% 99SigmaT7140
Vorteks karıştırıcıFisher02-215-414
Whatman pozlama kasetiSigmaWHA29175523
Amonyum sülfat ve amino asitler içermeyen maya azot bazıSigmaY1251

Kaynaklar

  1. Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
  2. Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
  3. Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
  4. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
  5. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  6. Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
  7. Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
  8. Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
  9. Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
  10. Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099(2020).
  11. Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
  12. Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
  13. Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006(2018).
  14. Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), Chichester, England. 1607-1633 (1996).
  15. Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
  16. Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  18. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. "Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708(2017).
  19. Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lipid EkstraksiyonuRadyoetiketleme Tekni iTrigliserit KantifikasyonuSterol Ester AnaliziFosfor G r nt lemeSintilasyon Say m
Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.