Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

GBM'ler de dahil olmak üzere primer malign gliomalar yıkıcı tümörlerdir ve GBM hastaları için orta sağkalım oranı 12 ila 15 ay olarak bildirilmiştir. Mevcut tedavi, radyoterapi ile birlikte büyük tümör kitle rezeksiyonu ve kemoterapiye dayanır, bu da sağkalım oranını sadece birkaç ay uzatır. Terapötik başarısızlıklar, kan-beyin bariyeri (BBB) boyunca zayıf ilaç dağıtımı ve pervasküler alanlarda, menenjitlerde ve WMTs¹boyunca invaziv büyüme ile yakından ilgilidir. Vasküler ko-seçenek olarak da adlandırılan pervasküler istila iyi çalışılmış bir süreçtir ve moleküler mekanizmalar aydınlatılmaya başlanmıştır; ancak, WMTs boyunca GBM hücre istilası süreci iyi anlaşılamamıştır. Tümör hücreleri Scherer'in ikincil yapıları boyunca sağlıklı beyne göç². Gerçekten de, neredeyse bir yüzyıl önce, Hans-Joachim Scherer, şimdi perineuronal satellitoz, perivasküler satellitoz, subpial spread ve WMT boyunca istila olarak adlandırılan GBM'nin istilacı yollarını tanımladı (Şekil 1A).

Stromal hücre türevi faktör-1α (SDF1α) ve C-X-C motifli kemokin reseptörü 4 (CXCR4) gibi bazı kemokinler ve reseptörleri, ancak vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) değil, WMT invazyon^3'ekarışmış gibi görünmektedir. Daha yakın zamanda, hücrelerarası bir ÇEN1-SOX2 ekseninin, GBM hücrelerinin WMT istilasında önemli bir yol olduğu gösterilmiştir⁴. Yazarlar, GBM kök benzeri hücrelerin kısmen olgunlaşmamış nöronlarda beyin parenkimini nasıl istila ettiğini anlattılar ve miyelin kılıflarının GBM hücreleri tarafından yok edilmesini önerdiler. 2019 yılında Nature dergisinde üç makalenin güvenli bir şekilde yayınlandığı bir kilometre taşına ulaşıldı ve glioma gelişiminde elektriksel aktivitenin rolünün altını çizdi^5,6. Monje ve işbirlikçilerinin ufuk açıcı çalışmaları, glioma gelişimini destekleyen nöroligin-3'ün salgılanmasında elektrik aktivitesinin merkezi rolüne ışık tutuyor.

Winkler ve işbirlikçileri, GBM hücreleri (mikrotüpler) arasındaki bağlantıların invaziv adımlarda ve son zamanlarda yeni tanımlanan nöroglioma sinapsları aracılığıyla GBM hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşimlerde çok önemli olduğunu açıkladılar. Bu yapılar, tümör gelişimini ve istilasını destekleyen GBM hücre zarındaki α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoksazolepropionik asit (AMPA) reseptörlerinin glutamaterjik stimülasyonunu tercih eder. Tümör hücre invazyonu, GBM hastalarında gözlendiği gibi metastazların veya uzak sekonder odakların yayılmasında merkezi bir süreçtir. Thrombospondin-1, dönüşen büyüme faktörü beta (TGFβ tarafından düzenlenmiş matrisli protein veya kemokin reseptörü CXCR3)^7,8gibi GBM invazyonunda önemli olduğu belirlenmiştir.

Burada, nöronların laminin izleri üzerinde desenli olduğu ve GBM hücrelerinin tek hücreli veya küresel olarak tohumlandığı GBM istilasını incelemek için basitleştirilmiş bir biyomimetik model tanımlanmıştır (Şekil 1B). İki deneysel ayar, GBM 9^,10^,11'de gözlenen nöronlar üzerindeki istilayı yeniden yakalamayı amaçlamaktadır. Bu tür modeller geçmişte, mekanik veya kimyasal özellikleri modüle ederek hücre göçlerini incelemeye izin veren hizalanmış nanofiber biyomalzemeler (çekirdek kabuk elektrospinning) olarak geliştirilmiştir¹². Bu makalede açıklanan ortak kültür modeli, bu süreçte yer alan yeni moleküler yollar tanımlayarak GBM hücrelerinin nöronlar üzerinde nasıl kaçtığını daha iyi anlamanızı sağlar.

Tüm hastalardan (yerel etik kurul yönetmeliklerine göre Norveç'in Bergen kentindeki Haukeland Hastanesi'nden) bilgilendirilmiş yazılı onay alınmıştır. Bu protokol Bordeaux Üniversitesi insan ve hayvan araştırma etik kurullarının yönergelerine uyar. Hamile sıçanlar Bordeaux Üniversitesi'nin hayvan tesisinde barındırıldı ve tedavi edildi. E18 zamanlı hamile bir sıçanın ötanazisi CO₂kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm hayvan işlemleri kurumsal yönergelere göre yapılmış ve yerel etik kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm ticari ürünlere Malzeme Tablosundaatıfta bulunulmaktadır.

1. Desenli slaytların hazırlanması

1. Mikropatterning için substrat hazırlığı
   1. 18 mm dairesel cam kapakları 5 dakika boyunca hava/plazma aktivasyonu ile tedavi edin. Kapakları 100 μL (3-aminopropil) triethoxysilane ile kapalı bir odaya 1 saat boyunca bir kurutucuya yerleştirin.
   2. 10 mM karbonat tamponunda 100 mg/mL poli (etilen glikol)-süksinimimidyl değer (moleküler ağırlık 5.000 (Peg-SVA)) ile 1 saat boyunca pH > 8 ile kuluçkaya yatırın. Ultra saf suyla yoğun bir şekilde durulayın ve kimyasal bir kaputun altında kurulayın.
      NOT: Bu aşamada, numune daha fazla kullanım için karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.
   3. Fosfat tamponlu saline (PBS) 14,7 mg/mL'de fotoinitiatör olan 4-benzoylbenzyl-trimethylammonium klorürü (PLPP) ekleyin.
      NOT: Plpp jelinin konsantre bir formu da kullanılabilir. PEG fırçasını (100 mJ/mm²⁾bozmak için gereken daha kısa ultraviyole (UV) aydınlatma süresi ile sonuçlanır.
2. Fotoinitiator jel biriktirme
   1. Slaytın ortasına biriktirmek için 3 μL PLPP jel ve 50 μL mutlak etanol karışımı hazırlayın. Mutlak etanol tamamen buharlaşana kadar numuneyi kimyasal bir kaputun altına yerleştirin.
      NOT: Bu aşamada, numune daha fazla kullanım için karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.
3. Cam slayt mikropatterning
   1. Kapak kapağını bir Ludin odasına monte edin ve otomatik odaklama sistemi ile donatılmış bir mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirin.
   2. Öngörülen mikropatternlere karşılık gelen görüntüleri yazılıma yükleyin. Bu parametreleri uygulayın: replikasyon 4 x 4 kez, 200 μm aralık, UV dozu 1.000 mJ / mm². Otomatik UV aydınlatma dizisinden sonra PLPP'yi birden fazla PBS yıkama ile durulayın.
      NOT: PLPP jel kullanılmışsa, deiyonize su ile kapsamlı yıkamalarla çıkarın, N₂akışında kurulayın ve 4 °C'de saklayın.
   3. 30 dakika boyunca laminin (PBS'de 50 μg/ mL) ile kuluçkaya yatın. PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkayın.
      NOT: Saflaştırılmış yeşil floresan proteinin floresan çözeltisi (PBS'de GFP, 10 μg/mL) laminin ile karıştırılarak mikropatternlerin floresan mikroskopisi ile görselleştirilmesi istenebilir.

2. Nöronların ve GBM hücrelerinin ortak kültür için hazırlanması

1. Embriyonik sıçan hipokampal nöronların kültürü
   1. Embriyonik (E18) sıçanların hipokampuslarını parçalara parçalara parçalar ve dokuyu Hank'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS)/1 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethaneslfonic acid (HEPES)/penisilin-streptomisin çözeltisine 15 mL'lik bir tüpte aktarın. Hipokampusu kurutmadan fazla çözeltiyi çıkarın.
   2. Penisilin (10.000 birim/mL)/streptomisin (10.000 μg/mL) ve 1 mM HEPES ile desteklenmiş 5 mL tripsin-etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. HBSS/HEPES/penisilin-streptomisin çözeltisi ile 2x yıkayın ve dokunun bu çözeltide 2-3 dakika kalmasını sağla.
   3. Her doku ile 10x yukarı ve aşağı pipetleme yaparak, köpürmeyi en aza indirmeye özen göstererek, iki alev cilalı Pasteur pipet kullanarak dokuyu ayrıştırın. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun uygulanabilirliğini değerlendirin. Nöronları aşağıda belirtildiği gibi mikropatterned kapak örtüleri üzerine plakalayın.
      NOT: Ekstraksiyondan sonra hücre canlılık oranı %85-90'dır.
2. Mikropatterned kapaklarda nöronlar için hücre kültürü
   1. PBS ile mikropatterned cam slaytları yeniden sulandırın ve komple nöronal hücre kültürü ortamını kuluçkaya yatırın.
   2. E18 Sprague-Dawley sıçanlarından elde edilen hipokampal nöronları, %3 at serumu ile zenginleştirilmiş nörobakal ortamda (NBM) cm² başına 50.000 hücre yoğunluğunda doğrudan mikropatterned cam kapak sapının üzerine tohum atın. Mikropatterned nöronları 48 saat boyunca inkübatöre (37 °C, % 5 CO₂₎yerleştirin.
      NOT: ~6 saat sonra, primer hipokampal nöronlar laminin mikropatternlerine bağlı olarak görülebilir.
3. Nöronlar üzerinde insan GBM kök benzeri hücrelerin ortak kültürü
   NOT: Bu çalışma için, membran GFP pozitif ve nükleer-domates hasta kaynaklı GBM hücreleri daha önce yayınlanan protokollere göre yetiştirilmiştir¹⁰.
   1. Küresel şekilli hücreler süspansiyonda büyüdükçe, süspansiyonu 200 × g'da 5 dakika santrifüj edin. Küreselleri 5 mL PBS ile yıkayın ve hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca hücre ayrıştırma reaktifinin 0,5 mL'si ile kuluçkaya yatırın (Malzeme Tablosunabakın).
   2. 4,5 mL tam NBM ekleyin (B27 takviyesi, heparin, fibroblast büyüme faktörü 2, penisilin ve streptomisinin daha önce açıklandığı gibi⁸ile tamamlanır) ve otomatik sayım tekniği kullanarak hücreleri sayın.
   3. NBM'deki mikropatterned nöronal kültürün üzerinde %3 at serumu ile zenginleştirilmiş 1.000 GBM hücre tohum. Plakayı 37 °C, %5 CO₂ve %95 nemde kuluçkaya yatırın.

3. Canlı hücre görüntüleme

1. GBM hücre tohumlamadan hemen sonra, numuneyi termostat odası ile donatılmış ters bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Yazılımda çok boyutlu bir alım araç kutusu kullanarak birden fazla pozisyonu kaydetmek için motorlu bir aşama ile donatılmış mikroskopta canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Sıcaklık (37 °C) ve gaz kontrollü (%5_CO2) ortamda 20x hedefle 12 saat boyunca her 5 dakikada bir parlak alan ve epifluoresans GFP/Domates görüntüleri elde edin.

4. Görüntü analizi

NOT: Fiji kullanılarak, iki boyutlu (2D) görüntü yığını yarı otomatik olarak ev yapımı ve kullanıcı dostu bir araç kullanılarak (bu adreste mevcuttur: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), IJ1 makro dilinde yazılmıştır (Şekil 2A). Otomatik iş akışı ve yordamlar Şekil 2B'de özetlenmiştir.

1. Nöronal ağ analizi (Şekil 2Bi)
   1. Yığının bir görüntüsünü seçin. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığıve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için Ağ aracını sağ tıklatın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
   2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Ağ aracını sol tıklatın.
      1. Seçili görüntüyü çoğaltın ve üç renk kanalına bölün (Kırmızı-Gri-Yeşil).
      2. Gri kanalı (brightfield) seçin ve farklı alanlar arasındaki ayrımı geliştirmek için kontrast uzatma geliştirme (CSE) gerçekleştirin. Kenar Bul komutu altında zaten gruplanmış olan 2D sinyal işleme konvolüzyon işlemini gerçekleştirmek için Sobel kenar dedektörünü (SED) kullanın.
      3. Çift filtreleme (F) için, gürültüyü azaltmak ve nesne sinyalini yumuşatmak için Gauss bulanıklığı ve ortanca filtre uygulayın. Siyah pikseller (hücre alanı) ve beyaz pikseller (arka plan) içeren ikili bir resim (BIN-gri) elde etmek için uyarlanmış eşik algoritmaları yürüterek Maskeye (CM) dönüştürün. Hücre alanını basit bir ağa (NET) iskeletleştirin (Sk) ve küçük, ağ bağlantısı olmayan parçacıkları kaldırarak net görüntüdeki parçacıkları (EP) filtreleyin.
      4. Kırmızı ve yeşil kanallar (çekirdek ve membran) için çift filtrelemegerçekleştirin, uyarlanmış eşik yöntemini kullanarak Maske'ye dönüştürün ve BIN-green'in Parçacıkları Çözümle komutuyla hücre morfolojisini belirlemesine izin verin.
      5. İlgi alanlarını (ROI) kullanarak tüm kanalları OR (birleştirme) işleciyle birleştirin ve ilk renklerini basit bir RGB görüntüsüne yeniden yönlendirin.
2. Tek hücreli hareketlilik analizi (Şekil 2Bii)
   1. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak için Tek Hücre İzleme aracına sağ tıklayın ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, İz türü = Çekirdek veya Zar, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Z projeksiyonu = Maksimum yoğunluk, Toplam Dilimler..., Gauss Bulanıklığı ve Ortanca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
   2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Tek Hücreli İzleme aracını sol tıklatın.
      1. Gri kanalı çıkarın. Zamana göre bir görüntü yığınına karşılık gelen bir görüntü oluşturacak yığına bir Z projeksiyonu uygulayın (T yığını). Çift filtre uygula ve hücrelerin bıraktığı izleri maskele'ye dönüştür. Bin-kırmızı/yeşil görüntüye küçük parçacıkları kaldırın.
      2. Yatırım getirisini kullanarak, hücre izlemenin her konturunun öğesini seçin ve sonraki adımlar için bu ön işleme adımını atlamak üzere Seçenekler iletişim kutusunda Kenar algılamayı atla kutusunu işaretleyin.
      3. Kırmızı kanalı(İz türü = Çekirdek) özgün yığında yalıtın. Bir yatırım getirisi seçin ve dış alanı kaldırın. Tüm görüntüleri çift filtreleyin ve Maske'ye (BIN-red) dönüştürün. Her binarized çekirdeğin centroid X/Y konumunu belirleyin.
   3. Elektronik tablo yazılımı¹³için zaten yayımlanmış bir makro kullanarak, bu hücrenin ortalama kare yer değiştirme, yön oranı ve ortalama hızını hesaplayın.
3. Çok hücreli izleme analizi (Şekil 2Biii)
   1. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin hassas bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığı ve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için İzleme aracına sağ tıklayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
   2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için İzleme aracını sol tıklatın.
      1. Gri kanalı çıkarın.
      2. Kırmızı ve yeşil kanalları bölün, çift filtreyi iki katınaçıkarın ve Maske 'ye dönüştürün.
      3. Görüntü Hesaplayıcısı'nıkullanarak kanalları birleştirin ... ve operatörü ile komut vererek, yalnızca zarlarda bulunan çekirdek sinyalini bırakır.
         NOT: Fiji'deki birkaç eklenti, bu ikili önceden işlenmiş görüntüdeki birkaç hücrenin X/Y konumunu aynı anda belirlemek için kullanılabilir (bkz. Malzeme Tablosu).
   3. Daha önce açıklanan makro¹³'ü kullanarak, bu hücreler için yörünge grafiğini, ortalama kare yer değiştirme oranını, yönlülük oranını ve ortalama hızı hesaplayın.
4. Sinir paspasında küresel göç (Şekil 2Biv)
   1. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin hassas bir segmentasyonunu oluşturmak için Ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığı ve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için Geçiş aracına sağ tıklayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
   2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Geçiş aracını sol tıklatın.
      1. Kırmızı kanalı kaldırın.
      2. Yeşil ve gri kanalları bölün.
      3. Gri kanal için, nöronal paspasın konturunu manuel olarak çizin ve alanını ölçün.
      4. Yeşil kanal için, yığını çift filtreleyin ve Maske 'ye dönüştürün. Desenin (BIN) dışındaki alanı kaldırın ve her görüntü için binarized hücre alanını belirleyin.
         NOT: Yukarıda açıklanan parametreler, ilgi çekici simgeye sol tıklayarak değerleri değiştirerek kalibre edilir. Bu işlem manuel olarak yapılabilir. Ancak, çok sayıda görüntü (satın alma başına yaklaşık yüz), kanallar (genellikle 3 kanal) ve işleme adımları için otomatik veya yarı otomatik bir araç tercih edilir.

Protokol bölümünde açıklandığı gibi floresan GBM hücreleri ile birlikte kültürlenen desenli nöronlar hazırlandı ve izleme deneyleri yapıldı. GBM hücreleri nöronlara göç ederken şekillerini hızla değiştirdi (Şekil 1B: panel 6 ve Video 1). Hücreler rastgele bir hareketle nöronal uzantılar boyunca göç etti (Video 1). Floresan GBM hücreleri ve floresan olmayan nöronlar kolayca ayırt edilebilir ve bu, protokol bölümünde açıklandığı gibi Fiji makrosunu kullanarak hücre hareketlerinin izlenmesine izin verdi (Şekil 2). Fiji, görüntü işleme ve analizini kolaylaştıran açık bir lisans yazılımıdır. Çok sayıda görüntü analizi için nispeten zaman alan manuel yordamlar bir makroda otomatik olarak düzenlenebilir. Görüntüler sürükle ve bırak yordamı ile içe aktarılır, işlenir ve ölçülür, bir yatırım getirisi yöneticisi kullanılarak kullanılabilen veriler oluşturulur.

Fiji.app | makrolar | araç setleri klasörüne yatırıldığında, Gliomas-Neurons aracı Diğer Araçlar menüsünde mevcuttu ve birkaç simge görüntüledi (Şekil 2A). Simgelere tıklayarak elde edilen görüntü işleme iş akışı Şekil 2B (i-iv)'de gösterilmiştir. Hücre şekli sinir ağında analiz edilebilir (Şekil 2B, i). Hücre takibinden bir (Şekil 2B, ii) veya birkaç hücre ( Şekil2B,iii) için iki ayrı görüntü işlemi kullanılarak çeşitli parametreler elde edilebilir. Nöronlar üzerindeki küresel GBM hücreleri tarafından iyileşme hızı da analiz edilebilir (Şekil 2B, iv). Nöronlara tohumlanan hücreler, nöron yollarını takip eden birden fazla çıkıntı ile uzun bir şekil gösterdi (Şekil 3A, i), ancak doğrudan laminin üzerinde kültürlendiğinde yuvarlak bir şekle sahipti ( Şekil3A,ii). Nöronlar üzerinde kültürlenen hücreler, laminin üzerinde kültürlendiğinde uzatılmamış olmalarına rağmen şekillerini verimli bir şekilde değiştirdiler(Şekil 3A, iii-v). Bazen iki hücreyi birbirine bağlayan ince çıkıntılar, daha sonraki aşamalarda nöronlarla birlikte kültürlenmiş hücrelerde görülmüştür(Video 1).

Nöronlar üzerinde tohumlanan GBM hücrelerinin göçmen kapasitesi, doğrudan laminin üzerine tohumlanmış hücrelerle karşılaştırıldı. Nöronlar üzerinde tohumlanan hücreler sadece laminin'den daha fazla göçmen kapasitesine sahipti (Şekil 3B, i,ii). P3 hücrelerinin rastgele hareketi, yörünge grafiğinde gösterildiği gibi, nöronlardaki P3 hücreleri için daha fazla mesafe ile her iki durumda da tespit edildi (Şekil 3B, i,ii). Hücre hareketliliği ortalama kare yer değiştirme (MSD) tarafından nicel olarak tahmin edildi ve günlük gösterimi doğrusal bir işlev14 (Şekil 3B, iii)ile donatılmıştır. Yön ve ortalama hız da her iki koşul için hesaplanmıştır (Şekil 3B, iv,v). P3 sferoidlerinin hücre göçü de nöronlar üzerinde zaman içinde floresan alanı tespit ederek ve sadece laminin üzerindeki göçle karşılaştırıldığında takip edildi (Şekil 3C, i,ii ve Video 2). Nöronlu desenin yarısı doğrusal bir profilde 500 dk sonra GBM hücreleri ile kaplandı; ancak, küreseller laminin desenine uymadı (Şekil 3D, iii ve Video 2).

Şekil 1: Desenli nöronlar üzerinde göç eden glioblastoma hücrelerinin deneysel kurulumu. (A) Kontrallateral yarımküreyi istila eden glioblastoma hücrelerinin korpus callosum yoluyla temsili. (B) Deneysel kurulum. 1. adımda, plaka yüzeyi birtifouling PEG tabakası ile kaplanmıştır. Fotoinitiatör, tüm kaplamayı kapsayan 2. 3. adımda, fotoinitiatör moleküllerini yerel olarak aktive eden mikroskopun hedefi üzerinden bir UV geniş alan görüntüsü yansıttır. Aktif fotoinitiatör YEREL olarak PEG moleküllerini ayırır ve laminin sonraki adsorpsiyonu sağlar. 5. adımda, nöronlar tohumlanır ve laminin dizilerine yapışır. P3 (GFP/Tomatonükleer)glioblastoma hücreleri daha sonra nöronal desen üzerine biriktirilir ve görüntüler elde edilir (adım 6). Kısaltmalar: PEG = polietilen glikol; UV = ultraviyole; GFP = yeşil floresan protein. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Fiji araç sunumu ve analiz iş akışı. (A) Makro Fiji.app klasöre eklendiğinde Gliomas-Neurons adlı araç kullanılabilir | makrolar | araç setleri (sol panel). Aşağıda açıklanan birkaç eylem aracından (sağ panel) oluşur. (B) i. Ağ aracı: sinir ağını ve glioma hücrelerini basitleştirilmiş bir gösterimde çizmek için kullanılan görüntü işleme. ii. Tek hücreli izleme aracı: tek hücrelerin yer değiştirmesini analiz etmek için hücre hareket alanını çizmek ve seçmek için kullanılan görüntü işleme. iii. İzleme aracı: önceden yüklenmiş Fiji izleme eklentilerinin kullanımı için görüntü ön işleme adımları. iv. Göreli geçiş aracı: el ile seçilen bir desendeki göreli hücre geçişini belirlemek için kullanılan görüntü işleme. Bazı parametreler, takım düğmesine sol tıklamayla kalibre edilebilir. Kısaltmalar: CSE = Kontrast Streç Geliştirme; SED = Sobel Kenar Dedektörü; F = çift Filtreleme; CM = Maskeye Dönüştür; Sk = İskeletleşme; EP = Parçacıkların eliminasyonu; VEYA (birleştirme) = Seçili ROI'larda birleşim işleci; VE = Seçili ROI'larda birlikte işleç. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: P3 hücrelerinin veya küresellerin desenli nöronlar ve laminin kaplaması üzerinde karşılaştırılması. (A) Nöronlar veya laminin üzerinde ayrışmış P3 GFP/ Domatesnükleer hücrelerinin şekil tanımlayıcıları. i'de P3 hücrelerinin işlenmiş ağlarına örnek olarak. desenli nöronlar veya ii. laminin kaplama. Ölçek çubuğu = 50 μm. iii. Desenli nöronlarda veya laminin üzerinde ortalama hücre alanı. iv. Formfactor, hücre uzama ve hücre dallanması ile ilgili parametreler sağlayan, çevrenin bir daireye normalleştirilmiş alana oranıdır. v. En boy oranı, ana eksenin hücrenin küçük eksenine oranıdır. Iii, ivve v'de, alan başına 15 hücre analiz edildi; 4 bağımsız desen; veriler ortalama ± S.E.M. (B) Ayrışmış P3 hücrelerinin izleme analizi olarak temsil edilir. (i) desenli nöronlar ve (ii) laminin kaplama üzerinde hücrelerin bir temsili grafik grafiği. iii. Nöronlara veya laminin kaplamaya göç eden P3 hücrelerinin MSD'si. X/Y değerleri logaritmik ölçeklerdedir. iv. Yön oranı. v. Ortalama hücre hızı geçişi. Iii, ivve v'de, alan başına 15 hücre analiz edildi; 4 bağımsız desen; veriler, P3 GFP sferoidlerinin ortalama ± S.E.M. (C) Geçiş analizi olarak temsil edilir. P3 küresellerinin farklı zaman noktalarındaki temsili görüntüler (i) desenli nöronlar veya (ii) laminin kaplama üzerinde. Ölçek çubuğu = 100 μm. iii. Desen konfluensi ile temsil edilen küresel göç; 4 bağımsız desen; veriler ortalama ± olarak temsil edilir ± S.E.M. Kısaltmaları: GFP = yeşil floresan protein; S.E.M. = ortalamanın standart hatası; MSD = Ortalama Kare Yer Değiştirme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Nöronlar veya laminin üzerindeki P3 hücreleri 8 saatin üzerinde kaydedildi (her 5 dakikada bir görüntülendi). Videoda nöronlarda (solda) ve laminin kaplamada (sağda) P3 tek hücreli göç gösterilir. Hücreler yeşil floresan proteini (GFP, yeşil renk) ve nükleer Domatesi (kırmızı renk) ifade etti. Bar = 50 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: Nöronlar veya laminin üzerindeki P3 küreseloidleri 8 saatin üzerinde kaydedildi (her 5 dakikada bir görüntülenmiştir). Videoda nöronlarda (solda) ve laminin kaplamada (sağda) P3 küresel göçü göstermektedir. Hücreler yeşil floresan proteini (GFP, yeşil renk) ifade etti. Bar = 100 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.