Yöntem makalesi

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

6.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62213

⸱

24 Şubat 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1University Bordeaux, INSERM, LAMC, U1029, 33600, Pessac, France, 2Univ. Bordeaux, CNRS, Interdisciplinary Institute for Neuroscience, IINS, UMR 5297, Bordeaux, France, 3Alvéole, Bordeaux, France, 4University Bordeaux, CNRS, IBGC, UMR5095, 33000, Bordeaux, France

Yazışma yazarları: Thomas Daubon <thomas.daubon@u-bordeaux.fr>

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, desenli nöronlar üzerinde glioblastoma (GBM) göçünü analiz etmek için kullanımı kolay bir ortak kültür tahlili sunuyoruz. Nöronlar üzerinde GBM hücre göçünün kolay ölçülmesi için FiJi yazılımında bir makro geliştirdik ve nöronların GBM hücre invaziv kapasitesini değiştirdiğini gözlemledik.

Özet

Glioblastomas (GBM), grade IV malign gliomalar, agresif özellikleri nedeniyle en ölümcül insan kanseri türlerinden biridir. Bu tümörlerin genetiğindeki önemli gelişmelere rağmen, GBM hücrelerinin sağlıklı beyin parankimini nasıl istila ettiği iyi anlaşılamamıştır. Özellikle, GBM hücrelerinin peritümoral alanı farklı rotalarla istila ettiği gösterilmiştir; bu makalenin ana ilgisi beyaz madde yolları (WMTs) boyunca rotadır. Tümör hücrelerinin peritumoral sinir hücresi bileşenleri ile etkileşimleri iyi karakterize değildir. Burada nöronların GBM hücre invazyonunun üzerindeki etkisini değerlendiren bir yöntem tanımlanmıştır. Bu makale, GBM kök benzeri hücrelerin nöronlar üzerindeki göçünü analiz ederek WMT invazyonunun taklit edildiği gelişmiş bir ortak kültür in vitro testini sunun. GBM hücrelerinin nöronların varlığındaki davranışları, açık kaynaklı ve serbest erişimli yazılımlarla otomatik bir izleme prosedürü kullanılarak izlenir. Bu yöntem, özellikle fonksiyonel ve mekanistik çalışmalar için birçok uygulamanın yanı sıra GBM hücre göçini engelleyebilen farmakolojik ajanların nöronlar üzerindeki etkilerini analiz etmek için yararlıdır.

Giriş

GBM'ler de dahil olmak üzere primer malign gliomalar yıkıcı tümörlerdir ve GBM hastaları için orta sağkalım oranı 12 ila 15 ay olarak bildirilmiştir. Mevcut tedavi, radyoterapi ile birlikte büyük tümör kitle rezeksiyonu ve kemoterapiye dayanır, bu da sağkalım oranını sadece birkaç ay uzatır. Terapötik başarısızlıklar, kan-beyin bariyeri (BBB) boyunca zayıf ilaç dağıtımı ve pervasküler alanlarda, menenjitlerde ve WMTs1boyunca invaziv büyüme ile yakından ilgilidir. Vasküler ko-seçenek olarak da adlandırılan pervasküler istila iyi çalışılmış bir süreçtir ve moleküler mekanizmalar aydınlatılmaya başlanmıştır; ancak, WMTs boyunca GBM hücre istilası süreci iyi anlaşılamamıştır. Tümör hücreleri Scherer'in ikincil yapıları boyunca sağlıklı beyne göç2. Gerçekten de, neredeyse bir yüzyıl önce, Hans-Joachim Scherer, şimdi perineuronal satellitoz, perivasküler satellitoz, subpial spread ve WMT boyunca istila olarak adlandırılan GBM'nin istilacı yollarını tanımladı (Şekil 1A).

Stromal hücre türevi faktör-1α (SDF1α) ve C-X-C motifli kemokin reseptörü 4 (CXCR4) gibi bazı kemokinler ve reseptörleri, ancak vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) değil, WMT invazyon3'ekarışmış gibi görünmektedir. Daha yakın zamanda, hücrelerarası bir ÇEN1-SOX2 ekseninin, GBM hücrelerinin WMT istilasında önemli bir yol olduğu gösterilmiştir4. Yazarlar, GBM kök benzeri hücrelerin kısmen olgunlaşmamış nöronlarda beyin parenkimini nasıl istila ettiğini anlattılar ve miyelin kılıflarının GBM hücreleri tarafından yok edilmesini önerdiler. 2019 yılında Nature dergisinde üç makalenin güvenli bir şekilde yayınlandığı bir kilometre taşına ulaşıldı ve glioma gelişiminde elektriksel aktivitenin rolünün altını çizdi5,6. Monje ve işbirlikçilerinin ufuk açıcı çalışmaları, glioma gelişimini destekleyen nöroligin-3'ün salgılanmasında elektrik aktivitesinin merkezi rolüne ışık tutuyor.

Winkler ve işbirlikçileri, GBM hücreleri (mikrotüpler) arasındaki bağlantıların invaziv adımlarda ve son zamanlarda yeni tanımlanan nöroglioma sinapsları aracılığıyla GBM hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşimlerde çok önemli olduğunu açıkladılar. Bu yapılar, tümör gelişimini ve istilasını destekleyen GBM hücre zarındaki α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoksazolepropionik asit (AMPA) reseptörlerinin glutamaterjik stimülasyonunu tercih eder. Tümör hücre invazyonu, GBM hastalarında gözlendiği gibi metastazların veya uzak sekonder odakların yayılmasında merkezi bir süreçtir. Thrombospondin-1, dönüşen büyüme faktörü beta (TGFβ tarafından düzenlenmiş matrisli protein veya kemokin reseptörü CXCR3)7,8gibi GBM invazyonunda önemli olduğu belirlenmiştir.

Burada, nöronların laminin izleri üzerinde desenli olduğu ve GBM hücrelerinin tek hücreli veya küresel olarak tohumlandığı GBM istilasını incelemek için basitleştirilmiş bir biyomimetik model tanımlanmıştır (Şekil 1B). İki deneysel ayar, GBM 9,10,11'de gözlenen nöronlar üzerindeki istilayı yeniden yakalamayı amaçlamaktadır. Bu tür modeller geçmişte, mekanik veya kimyasal özellikleri modüle ederek hücre göçlerini incelemeye izin veren hizalanmış nanofiber biyomalzemeler (çekirdek kabuk elektrospinning) olarak geliştirilmiştir12. Bu makalede açıklanan ortak kültür modeli, bu süreçte yer alan yeni moleküler yollar tanımlayarak GBM hücrelerinin nöronlar üzerinde nasıl kaçtığını daha iyi anlamanızı sağlar.

Protokol

Tüm hastalardan (yerel etik kurul yönetmeliklerine göre Norveç'in Bergen kentindeki Haukeland Hastanesi'nden) bilgilendirilmiş yazılı onay alınmıştır. Bu protokol Bordeaux Üniversitesi insan ve hayvan araştırma etik kurullarının yönergelerine uyar. Hamile sıçanlar Bordeaux Üniversitesi'nin hayvan tesisinde barındırıldı ve tedavi edildi. E18 zamanlı hamile bir sıçanın ötanazisi CO2kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm hayvan işlemleri kurumsal yönergelere göre yapılmış ve yerel etik kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm ticari ürünlere Malzeme Tablosundaatıfta bulunulmaktadır.

1. Desenli slaytların hazırlanması

  1. Mikropatterning için substrat hazırlığı
    1. 18 mm dairesel cam kapakları 5 dakika boyunca hava/plazma aktivasyonu ile tedavi edin. Kapakları 100 μL (3-aminopropil) triethoxysilane ile kapalı bir odaya 1 saat boyunca bir kurutucuya yerleştirin.
    2. 10 mM karbonat tamponunda 100 mg/mL poli (etilen glikol)-süksinimimidyl değer (moleküler ağırlık 5.000 (Peg-SVA)) ile 1 saat boyunca pH > 8 ile kuluçkaya yatırın. Ultra saf suyla yoğun bir şekilde durulayın ve kimyasal bir kaputun altında kurulayın.
      NOT: Bu aşamada, numune daha fazla kullanım için karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.
    3. Fosfat tamponlu saline (PBS) 14,7 mg/mL'de fotoinitiatör olan 4-benzoylbenzyl-trimethylammonium klorürü (PLPP) ekleyin.
      NOT: Plpp jelinin konsantre bir formu da kullanılabilir. PEG fırçasını (100 mJ/mm2)bozmak için gereken daha kısa ultraviyole (UV) aydınlatma süresi ile sonuçlanır.
  2. Fotoinitiator jel biriktirme
    1. Slaytın ortasına biriktirmek için 3 μL PLPP jel ve 50 μL mutlak etanol karışımı hazırlayın. Mutlak etanol tamamen buharlaşana kadar numuneyi kimyasal bir kaputun altına yerleştirin.
      NOT: Bu aşamada, numune daha fazla kullanım için karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.
  3. Cam slayt mikropatterning
    1. Kapak kapağını bir Ludin odasına monte edin ve otomatik odaklama sistemi ile donatılmış bir mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirin.
    2. Öngörülen mikropatternlere karşılık gelen görüntüleri yazılıma yükleyin. Bu parametreleri uygulayın: replikasyon 4 x 4 kez, 200 μm aralık, UV dozu 1.000 mJ / mm2. Otomatik UV aydınlatma dizisinden sonra PLPP'yi birden fazla PBS yıkama ile durulayın.
      NOT: PLPP jel kullanılmışsa, deiyonize su ile kapsamlı yıkamalarla çıkarın, N2akışında kurulayın ve 4 °C'de saklayın.
    3. 30 dakika boyunca laminin (PBS'de 50 μg/ mL) ile kuluçkaya yatın. PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkayın.
      NOT: Saflaştırılmış yeşil floresan proteinin floresan çözeltisi (PBS'de GFP, 10 μg/mL) laminin ile karıştırılarak mikropatternlerin floresan mikroskopisi ile görselleştirilmesi istenebilir.

2. Nöronların ve GBM hücrelerinin ortak kültür için hazırlanması

  1. Embriyonik sıçan hipokampal nöronların kültürü
    1. Embriyonik (E18) sıçanların hipokampuslarını parçalara parçalara parçalar ve dokuyu Hank'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS)/1 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethaneslfonic acid (HEPES)/penisilin-streptomisin çözeltisine 15 mL'lik bir tüpte aktarın. Hipokampusu kurutmadan fazla çözeltiyi çıkarın.
    2. Penisilin (10.000 birim/mL)/streptomisin (10.000 μg/mL) ve 1 mM HEPES ile desteklenmiş 5 mL tripsin-etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. HBSS/HEPES/penisilin-streptomisin çözeltisi ile 2x yıkayın ve dokunun bu çözeltide 2-3 dakika kalmasını sağla.
    3. Her doku ile 10x yukarı ve aşağı pipetleme yaparak, köpürmeyi en aza indirmeye özen göstererek, iki alev cilalı Pasteur pipet kullanarak dokuyu ayrıştırın. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun uygulanabilirliğini değerlendirin. Nöronları aşağıda belirtildiği gibi mikropatterned kapak örtüleri üzerine plakalayın.
      NOT: Ekstraksiyondan sonra hücre canlılık oranı %85-90'dır.
  2. Mikropatterned kapaklarda nöronlar için hücre kültürü
    1. PBS ile mikropatterned cam slaytları yeniden sulandırın ve komple nöronal hücre kültürü ortamını kuluçkaya yatırın.
    2. E18 Sprague-Dawley sıçanlarından elde edilen hipokampal nöronları, %3 at serumu ile zenginleştirilmiş nörobakal ortamda (NBM) cm2 başına 50.000 hücre yoğunluğunda doğrudan mikropatterned cam kapak sapının üzerine tohum atın. Mikropatterned nöronları 48 saat boyunca inkübatöre (37 °C, % 5 CO2)yerleştirin.
      NOT: ~6 saat sonra, primer hipokampal nöronlar laminin mikropatternlerine bağlı olarak görülebilir.
  3. Nöronlar üzerinde insan GBM kök benzeri hücrelerin ortak kültürü
    NOT: Bu çalışma için, membran GFP pozitif ve nükleer-domates hasta kaynaklı GBM hücreleri daha önce yayınlanan protokollere göre yetiştirilmiştir10.
    1. Küresel şekilli hücreler süspansiyonda büyüdükçe, süspansiyonu 200 × g'da 5 dakika santrifüj edin. Küreselleri 5 mL PBS ile yıkayın ve hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca hücre ayrıştırma reaktifinin 0,5 mL'si ile kuluçkaya yatırın (Malzeme Tablosunabakın).
    2. 4,5 mL tam NBM ekleyin (B27 takviyesi, heparin, fibroblast büyüme faktörü 2, penisilin ve streptomisinin daha önce açıklandığı gibi8ile tamamlanır) ve otomatik sayım tekniği kullanarak hücreleri sayın.
    3. NBM'deki mikropatterned nöronal kültürün üzerinde %3 at serumu ile zenginleştirilmiş 1.000 GBM hücre tohum. Plakayı 37 °C, %5 CO2ve %95 nemde kuluçkaya yatırın.

3. Canlı hücre görüntüleme

  1. GBM hücre tohumlamadan hemen sonra, numuneyi termostat odası ile donatılmış ters bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Yazılımda çok boyutlu bir alım araç kutusu kullanarak birden fazla pozisyonu kaydetmek için motorlu bir aşama ile donatılmış mikroskopta canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Sıcaklık (37 °C) ve gaz kontrollü (%5CO2) ortamda 20x hedefle 12 saat boyunca her 5 dakikada bir parlak alan ve epifluoresans GFP/Domates görüntüleri elde edin.

4. Görüntü analizi

NOT: Fiji kullanılarak, iki boyutlu (2D) görüntü yığını yarı otomatik olarak ev yapımı ve kullanıcı dostu bir araç kullanılarak (bu adreste mevcuttur: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), IJ1 makro dilinde yazılmıştır (Şekil 2A). Otomatik iş akışı ve yordamlar Şekil 2B'de özetlenmiştir.

  1. Nöronal ağ analizi (Şekil 2Bi)
    1. Yığının bir görüntüsünü seçin. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığıve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için Ağ aracını sağ tıklatın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
    2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Ağ aracını sol tıklatın.
      1. Seçili görüntüyü çoğaltın ve üç renk kanalına bölün (Kırmızı-Gri-Yeşil).
      2. Gri kanalı (brightfield) seçin ve farklı alanlar arasındaki ayrımı geliştirmek için kontrast uzatma geliştirme (CSE) gerçekleştirin. Kenar Bul komutu altında zaten gruplanmış olan 2D sinyal işleme konvolüzyon işlemini gerçekleştirmek için Sobel kenar dedektörünü (SED) kullanın.
      3. Çift filtreleme (F) için, gürültüyü azaltmak ve nesne sinyalini yumuşatmak için Gauss bulanıklığı ve ortanca filtre uygulayın. Siyah pikseller (hücre alanı) ve beyaz pikseller (arka plan) içeren ikili bir resim (BIN-gri) elde etmek için uyarlanmış eşik algoritmaları yürüterek Maskeye (CM) dönüştürün. Hücre alanını basit bir ağa (NET) iskeletleştirin (Sk) ve küçük, ağ bağlantısı olmayan parçacıkları kaldırarak net görüntüdeki parçacıkları (EP) filtreleyin.
      4. Kırmızı ve yeşil kanallar (çekirdek ve membran) için çift filtrelemegerçekleştirin, uyarlanmış eşik yöntemini kullanarak Maske'ye dönüştürün ve BIN-green'in Parçacıkları Çözümle komutuyla hücre morfolojisini belirlemesine izin verin.
      5. İlgi alanlarını (ROI) kullanarak tüm kanalları OR (birleştirme) işleciyle birleştirin ve ilk renklerini basit bir RGB görüntüsüne yeniden yönlendirin.
  2. Tek hücreli hareketlilik analizi (Şekil 2Bii)
    1. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak için Tek Hücre İzleme aracına sağ tıklayın ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, İz türü = Çekirdek veya Zar, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Z projeksiyonu = Maksimum yoğunluk, Toplam Dilimler..., Gauss Bulanıklığı ve Ortanca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
    2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Tek Hücreli İzleme aracını sol tıklatın.
      1. Gri kanalı çıkarın. Zamana göre bir görüntü yığınına karşılık gelen bir görüntü oluşturacak yığına bir Z projeksiyonu uygulayın (T yığını). Çift filtre uygula ve hücrelerin bıraktığı izleri maskele'ye dönüştür. Bin-kırmızı/yeşil görüntüye küçük parçacıkları kaldırın.
      2. Yatırım getirisini kullanarak, hücre izlemenin her konturunun öğesini seçin ve sonraki adımlar için bu ön işleme adımını atlamak üzere Seçenekler iletişim kutusunda Kenar algılamayı atla kutusunu işaretleyin.
      3. Kırmızı kanalı(İz türü = Çekirdek) özgün yığında yalıtın. Bir yatırım getirisi seçin ve dış alanı kaldırın. Tüm görüntüleri çift filtreleyin ve Maske'ye (BIN-red) dönüştürün. Her binarized çekirdeğin centroid X/Y konumunu belirleyin.
    3. Elektronik tablo yazılımı13için zaten yayımlanmış bir makro kullanarak, bu hücrenin ortalama kare yer değiştirme, yön oranı ve ortalama hızını hesaplayın.
  3. Çok hücreli izleme analizi (Şekil 2Biii)
    1. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin hassas bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığı ve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için İzleme aracına sağ tıklayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
    2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için İzleme aracını sol tıklatın.
      1. Gri kanalı çıkarın.
      2. Kırmızı ve yeşil kanalları bölün, çift filtreyi iki katınaçıkarın ve Maske 'ye dönüştürün.
      3. Görüntü Hesaplayıcısı'nıkullanarak kanalları birleştirin ... ve operatörü ile komut vererek, yalnızca zarlarda bulunan çekirdek sinyalini bırakır.
        NOT: Fiji'deki birkaç eklenti, bu ikili önceden işlenmiş görüntüdeki birkaç hücrenin X/Y konumunu aynı anda belirlemek için kullanılabilir (bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Daha önce açıklanan makro13'ü kullanarak, bu hücreler için yörünge grafiğini, ortalama kare yer değiştirme oranını, yönlülük oranını ve ortalama hızı hesaplayın.
  4. Sinir paspasında küresel göç (Şekil 2Biv)
    1. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin hassas bir segmentasyonunu oluşturmak için Ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığı ve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için Geçiş aracına sağ tıklayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
    2. Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Geçiş aracını sol tıklatın.
      1. Kırmızı kanalı kaldırın.
      2. Yeşil ve gri kanalları bölün.
      3. Gri kanal için, nöronal paspasın konturunu manuel olarak çizin ve alanını ölçün.
      4. Yeşil kanal için, yığını çift filtreleyin ve Maske 'ye dönüştürün. Desenin (BIN) dışındaki alanı kaldırın ve her görüntü için binarized hücre alanını belirleyin.
        NOT: Yukarıda açıklanan parametreler, ilgi çekici simgeye sol tıklayarak değerleri değiştirerek kalibre edilir. Bu işlem manuel olarak yapılabilir. Ancak, çok sayıda görüntü (satın alma başına yaklaşık yüz), kanallar (genellikle 3 kanal) ve işleme adımları için otomatik veya yarı otomatik bir araç tercih edilir.

Sonuçlar

Protokol bölümünde açıklandığı gibi floresan GBM hücreleri ile birlikte kültürlenen desenli nöronlar hazırlandı ve izleme deneyleri yapıldı. GBM hücreleri nöronlara göç ederken şekillerini hızla değiştirdi (Şekil 1B: panel 6 ve Video 1). Hücreler rastgele bir hareketle nöronal uzantılar boyunca göç etti (Video 1). Floresan GBM hücreleri ve floresan olmayan nöronlar kolayca ayırt edilebilir ve bu, protokol bölümünde açıklandığı gibi Fiji makrosunu kullanarak hücre hareketlerinin izlenmesine izin verdi (Şekil 2). Fiji, görüntü işleme ve analizini kolaylaştıran açık bir lisans yazılımıdır. Çok sayıda görüntü analizi için nispeten zaman alan manuel yordamlar bir makroda otomatik olarak düzenlenebilir. Görüntüler sürükle ve bırak yordamı ile içe aktarılır, işlenir ve ölçülür, bir yatırım getirisi yöneticisi kullanılarak kullanılabilen veriler oluşturulur.

Fiji.app | makrolar | araç setleri klasörüne yatırıldığında, Gliomas-Neurons aracı Diğer Araçlar menüsünde mevcuttu ve birkaç simge görüntüledi (Şekil 2A). Simgelere tıklayarak elde edilen görüntü işleme iş akışı Şekil 2B (i-iv)'de gösterilmiştir. Hücre şekli sinir ağında analiz edilebilir (Şekil 2B, i). Hücre takibinden bir (Şekil 2B, ii) veya birkaç hücre ( Şekil2B,iii) için iki ayrı görüntü işlemi kullanılarak çeşitli parametreler elde edilebilir. Nöronlar üzerindeki küresel GBM hücreleri tarafından iyileşme hızı da analiz edilebilir (Şekil 2B, iv). Nöronlara tohumlanan hücreler, nöron yollarını takip eden birden fazla çıkıntı ile uzun bir şekil gösterdi (Şekil 3A, i), ancak doğrudan laminin üzerinde kültürlendiğinde yuvarlak bir şekle sahipti ( Şekil3A,ii). Nöronlar üzerinde kültürlenen hücreler, laminin üzerinde kültürlendiğinde uzatılmamış olmalarına rağmen şekillerini verimli bir şekilde değiştirdiler(Şekil 3A, iii-v). Bazen iki hücreyi birbirine bağlayan ince çıkıntılar, daha sonraki aşamalarda nöronlarla birlikte kültürlenmiş hücrelerde görülmüştür(Video 1).

Nöronlar üzerinde tohumlanan GBM hücrelerinin göçmen kapasitesi, doğrudan laminin üzerine tohumlanmış hücrelerle karşılaştırıldı. Nöronlar üzerinde tohumlanan hücreler sadece laminin'den daha fazla göçmen kapasitesine sahipti (Şekil 3B, i,ii). P3 hücrelerinin rastgele hareketi, yörünge grafiğinde gösterildiği gibi, nöronlardaki P3 hücreleri için daha fazla mesafe ile her iki durumda da tespit edildi (Şekil 3B, i,ii). Hücre hareketliliği ortalama kare yer değiştirme (MSD) tarafından nicel olarak tahmin edildi ve günlük gösterimi doğrusal bir işlev14 (Şekil 3B, iii)ile donatılmıştır. Yön ve ortalama hız da her iki koşul için hesaplanmıştır (Şekil 3B, iv,v). P3 sferoidlerinin hücre göçü de nöronlar üzerinde zaman içinde floresan alanı tespit ederek ve sadece laminin üzerindeki göçle karşılaştırıldığında takip edildi (Şekil 3C, i,ii ve Video 2). Nöronlu desenin yarısı doğrusal bir profilde 500 dk sonra GBM hücreleri ile kaplandı; ancak, küreseller laminin desenine uymadı (Şekil 3D, iii ve Video 2).

figure-results-1
Şekil 1: Desenli nöronlar üzerinde göç eden glioblastoma hücrelerinin deneysel kurulumu. (A) Kontrallateral yarımküreyi istila eden glioblastoma hücrelerinin korpus callosum yoluyla temsili. (B) Deneysel kurulum. 1. adımda, plaka yüzeyi birtifouling PEG tabakası ile kaplanmıştır. Fotoinitiatör, tüm kaplamayı kapsayan 2. 3. adımda, fotoinitiatör moleküllerini yerel olarak aktive eden mikroskopun hedefi üzerinden bir UV geniş alan görüntüsü yansıttır. Aktif fotoinitiatör YEREL olarak PEG moleküllerini ayırır ve laminin sonraki adsorpsiyonu sağlar. 5. adımda, nöronlar tohumlanır ve laminin dizilerine yapışır. P3 (GFP/Tomatonükleer)glioblastoma hücreleri daha sonra nöronal desen üzerine biriktirilir ve görüntüler elde edilir (adım 6). Kısaltmalar: PEG = polietilen glikol; UV = ultraviyole; GFP = yeşil floresan protein. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Fiji araç sunumu ve analiz iş akışı. (A) Makro Fiji.app klasöre eklendiğinde Gliomas-Neurons adlı araç kullanılabilir | makrolar | araç setleri (sol panel). Aşağıda açıklanan birkaç eylem aracından (sağ panel) oluşur. (B) i. Ağ aracı: sinir ağını ve glioma hücrelerini basitleştirilmiş bir gösterimde çizmek için kullanılan görüntü işleme. ii. Tek hücreli izleme aracı: tek hücrelerin yer değiştirmesini analiz etmek için hücre hareket alanını çizmek ve seçmek için kullanılan görüntü işleme. iii. İzleme aracı: önceden yüklenmiş Fiji izleme eklentilerinin kullanımı için görüntü ön işleme adımları. iv. Göreli geçiş aracı: el ile seçilen bir desendeki göreli hücre geçişini belirlemek için kullanılan görüntü işleme. Bazı parametreler, takım düğmesine sol tıklamayla kalibre edilebilir. Kısaltmalar: CSE = Kontrast Streç Geliştirme; SED = Sobel Kenar Dedektörü; F = çift Filtreleme; CM = Maskeye Dönüştür; Sk = İskeletleşme; EP = Parçacıkların eliminasyonu; VEYA (birleştirme) = Seçili ROI'larda birleşim işleci; VE = Seçili ROI'larda birlikte işleç. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: P3 hücrelerinin veya küresellerin desenli nöronlar ve laminin kaplaması üzerinde karşılaştırılması. (A) Nöronlar veya laminin üzerinde ayrışmış P3 GFP/ Domatesnükleer hücrelerinin şekil tanımlayıcıları. i'de P3 hücrelerinin işlenmiş ağlarına örnek olarak. desenli nöronlar veya ii. laminin kaplama. Ölçek çubuğu = 50 μm. iii. Desenli nöronlarda veya laminin üzerinde ortalama hücre alanı. iv. Formfactor, hücre uzama ve hücre dallanması ile ilgili parametreler sağlayan, çevrenin bir daireye normalleştirilmiş alana oranıdır. v. En boy oranı, ana eksenin hücrenin küçük eksenine oranıdır. Iii, ivve v'de, alan başına 15 hücre analiz edildi; 4 bağımsız desen; veriler ortalama ± S.E.M. (B) Ayrışmış P3 hücrelerinin izleme analizi olarak temsil edilir. (i) desenli nöronlar ve (ii) laminin kaplama üzerinde hücrelerin bir temsili grafik grafiği. iii. Nöronlara veya laminin kaplamaya göç eden P3 hücrelerinin MSD'si. X/Y değerleri logaritmik ölçeklerdedir. iv. Yön oranı. v. Ortalama hücre hızı geçişi. Iii, ivve v'de, alan başına 15 hücre analiz edildi; 4 bağımsız desen; veriler, P3 GFP sferoidlerinin ortalama ± S.E.M. (C) Geçiş analizi olarak temsil edilir. P3 küresellerinin farklı zaman noktalarındaki temsili görüntüler (i) desenli nöronlar veya (ii) laminin kaplama üzerinde. Ölçek çubuğu = 100 μm. iii. Desen konfluensi ile temsil edilen küresel göç; 4 bağımsız desen; veriler ortalama ± olarak temsil edilir ± S.E.M. Kısaltmaları: GFP = yeşil floresan protein; S.E.M. = ortalamanın standart hatası; MSD = Ortalama Kare Yer Değiştirme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Nöronlar veya laminin üzerindeki P3 hücreleri 8 saatin üzerinde kaydedildi (her 5 dakikada bir görüntülendi). Videoda nöronlarda (solda) ve laminin kaplamada (sağda) P3 tek hücreli göç gösterilir. Hücreler yeşil floresan proteini (GFP, yeşil renk) ve nükleer Domatesi (kırmızı renk) ifade etti. Bar = 50 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: Nöronlar veya laminin üzerindeki P3 küreseloidleri 8 saatin üzerinde kaydedildi (her 5 dakikada bir görüntülenmiştir). Videoda nöronlarda (solda) ve laminin kaplamada (sağda) P3 küresel göçü göstermektedir. Hücreler yeşil floresan proteini (GFP, yeşil renk) ifade etti. Bar = 100 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Glioblastomas, farklı modlar kullanarak parenkimayı kapsamlı bir şekilde istila eder: WMTs18'dekan damarlarını çevreleyen ortak seçenek, interstisyel istila veya istila . Bu ikinci mod, literatürde WMT istilası ile ilgili uygun in vitro veya in vivo modelleri bulma zorluğu nedeniyle iyi karakterize değildir. Burada, kültürlü kemirgen nöronlarının laminin kaplı yüzeylerde desenli olduğu ve nöronların üzerine floresan GBM kök benzeri hücrelerin tohum edildiği basitleştirilmiş bir model önerilmiştir. Bu çalışmada tümör hücre bağlanması, invazyon ve çoğalma analizini iyileştirmek için ızgara şeklinde bir desen kullanılmıştır. GBM hücreleri nöronların üzerine doğrudan matristen daha verimli bir şekilde göç etti, bu deneylerde laminin idi. Kayıt işlemi boyunca hücre şekli değişti ve hücre yüzey alanı aynı anda arttı. GBM kök benzeri hücrelerin, belirli sinyal yollarının (yani, NOTCH2/SOX2)4 veya nöronların kendisinden salgılanan faktörlerin ve sinyallerin aktivasyonu yoluyla nöron yolları tarafından çekilmesi muhtemeldir. Bu sistem, metabolitler, nörotransmitterler veya sitokinler içerebilen GBM hücreleri ve nöronlar arasındaki moleküler değişimleri analiz etmek için çok uygundur.

Son zamanlarda, Venkatesh ve işbirlikçileri glutamat reseptörünü aktive ettiği bir nöroglioma sinaps oluşumunu tanımladı, AMPAR6. GBM hücrelerinin WMT istilası sırasında benzer işlemler söz konusu mudur? Bu deneysel sistem ile farmakolojik inhibisyon veya genetik yaklaşımlar kullanılarak araştırılabilir.

Aşağıdaki kritik noktalara dikkat edilmelidir. İlk olarak, PEGylation adımları sırasında, yapışkan önleyici kaplamanın bütünlüğünü etkilememek için substratın kurumasına izin verilmemelidir. Not olarak, PEG-SVA çözeltisini ultra saf suyla kapsamlı bir şekilde yıkamak ve karanlıkta 4 ° C'de saklamadan önce bir azot akışı altında kurutmak mümkündür. İkincisi, nöronlardaki GBM hücre geçişini analiz etmek için geliştirilen makro açık erişim modundadır ve FiJi yazılımı ile uyumludur. Bu makro ve güncelleştirmeleri GitHub'da mevcut olsa da, hücreleri algılamak için uygun bir kalibrasyon gerektirir. Bu nedenle, analize başlarken numuneleri kalite kontrol olarak manuel olarak kontrol etmek yararlı olabilir. Burada kullanılan sistemin esnekliği, nöronları farklı derecelerde ayıran paralel çizgilerle desenin farklı şekillerine izin verir. Bu yaklaşımla, WMT istilasının esas olarak gözlendiği insan beynindeki en büyük beyaz madde yapısı olan korpus callosumda gözlemlendiği gibi, birkaç serebral yapının şekli taklit edilebilir. Alternatif olarak, aynı UV-ışık projeksiyon cihazının UV'ye duyarlı yapışkan olmayan hidrojelleri z kontrollü bir şekilde yapıladığı gösterilmiştir15, küresel oluşumun standardizasyonunu sağlar.

Bu bağlamda, GBM istilasını test etmek için 3D nörosferler oluşturulabilir. Bu teknik, beyin endotel hücreleri gibi diğer serebral hücrelerin damar benzeri şekil üretmesi veya mikroglial veya diğer bağışıklık hücrelerini taklit etmesi için de uygulanabilir. Böylece GBM hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde serebral hücrelerin sinerjik veya inhibitör etkileri gözlenebilir. Bu çalışmanın bir sınırlaması, embriyonik sıçan nöronlarının insan GBM hücreleriyle ortak kültürde kullanılmasıdır, bu da gerçek fizyolojik durumları taklit emeyebilir. Bu dezavantajın üstesinden gelmenin bir yolu, türler arası reaktiviteyi önlemek için insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi nöronları kullanmak olacaktır16. Bununla birlikte, GBM hücreleri bu deneylerde gösterildiği gibi sıçan nöronlarına hızla yapışır ve verimli bir şekilde göç eder. Ayrıca sıçan serebral hücrelerinin (Schwann hücreleri) insan nöronları ile verimli bir şekilde birlikte kültürlenebileceğinden daha fazla gösterilmiştir17. Diğer yöntemler arasında glioma hücre göçü12'yi incelemek için iyi bir model sunan, ancak nanofiberler canlı olmayan yapılar olarak kabul edildikçe hücre hücre temasını sınırlayan 3D nanofiberlerin kullanımı yer almaktadır.

Ayrıca, 2D kültürler indirgemecidir, hücresel süreçlerin gözlemini basitleştirir ve in vivo bağlam10için geçerliliklerini sınırlayabilir. Bu nedenle, GBM hücrelerinin ve nöronlarının 3D ortak kültürleri in vivo durumun daha iyi temsilcileridir. Mini beyinler18gibi karmaşık beyin organoidleri, yüzleşme kültürü istilasında kullanılmıştır19. Burada açıklanan stratejinin temel avantajı, ortak kültür yaklaşımının tekrarlanabilirliğidir, yani birincil nöronlar geometrik olarak boyut kontrollü mikropatternler üzerinde kısıtlanır ve enjekte edilen GBM hücreleriyle etkileşim başka bir yerde gerçekleşemez. Ayrıca, nöronların mekansal organizasyonu, UV projeksiyon sisteminin çok yönlülüğü nedeniyle ayarlanabilir ve daha fazla optimizasyon sağlar. Sonuç olarak, bu tür biyomimetik yaklaşımların geliştirilmesi ve doğrulanması, biyomedikal araştırmalarda kullanılan hayvan modellerinin sayısını azaltmaya da yardımcı olabilir.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO tarafından desteklendi. Alveole, Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43) tarafından desteklenmektedir. Joris Guyon, Toulouse Üniversite Hastanesi'nden (CHU Toulouse) burs alan bir kişidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(3-aminopropil) trietoksisilanSigma440140-100MLAmino grubu, mPEG-SVA
96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakanınSarstedt2582624Sferoidleri hazırlamak için kullanılır
AccutaseGibcoA11105-01-20 ° C'de saklanır; C (uzun vadeli) veya 4 & derece; C (kısa süreli), küre ayrışma enzimi
B27Gibco12587-20 °C'de saklanır; C, kullanmadan önce buzunu çözün
Temel Fibroblast Büyüme FaktörüPeprotech100-18B-20 ° C'de saklanır; C, kullanmadan önce buz çözme
Kontes Hücre Sayma OdasıSlaytlarInvitrogenC10283Hücre sayımı için kullanılır
LamellerMarienfeld111580Hücre kültürü substratı
Kurutucu kartuşlarıSigmaZ363456-6EA(3-aminopropil) trietoksisilan tedavisi sırasında mostürü azaltmak için kullanılır
DPBS 10xPan BiotechP04-53-5004'te saklanır ° C
Fiji yazılımı, MTrack2 makroImageJResimleri analiz etmek için kullanılır
Flask 75 cm²Falcon10497302
HBSSSigmaH8264-500ML
Heparin sodyumSigmaH3149-100KU4 ° C'de saklanır; C
Laminin114956-81-9Nöronal yapışmayı teşvik eder
Leonardo yazılımıöngörülen mikro desenlerin yüklenmesi
MetaMorph Yazılımı Molecular Devices LLCNAMikroskopi otomasyon yazılımı
MetilselülozSigmaM0512%2 nihai konsantrasyon için NBM'de seyreltilmiş
Nörobazal ortamGibco21103-0494 °C'de saklanır; C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)motorlu tabla ile donatılmış ters mikroskop 
Penisilin - StreptomisinGibco15140-1224 &°C'de saklanır; C
PLPPAlveolPLPPclassic_1mlPEG fırçasını bozmak için kullanılan foto başlatıcı
Poli (etilen glikol) -Süksinimidil Valerate (mPEG-SVA)Laysan BioVA-PEG-VA-5000-5gKirlenme önleyici kaplama olarak kullanılır
PRIMOAlveolePRIMO1Dijital mikro ayna cihazı (DMD) tabanlı UV projeksiyon cihazı
Tripan mavisi %0,4ThermoFisherT10282Hücre sayımı için kullanılır
Tripsin-EDTASigmaT4049-100MLYapışık hücreleri ayırmak için kullanılır
biyokonjugasyonu için yararlıdır

Kaynaklar

  1. Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
  2. Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
  3. Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
  4. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
  5. Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
  6. Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
  7. Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571(2017).
  8. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146(2019).
  9. Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
  10. Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
  11. Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
  12. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
  13. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  14. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
  15. Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519(2020).
  16. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
  17. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
  18. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
  19. Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Glioblastoma Kök HücreleriNöron Ko-KültürüHücre MigrasyonuBeyaz Madde YollarıCanlı Hücre GörüntülemeTek Hücre TakibiKonfokal MikroskopiNöronal Ağ AnaliziHücre Motilitesi
Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.