Method Article

scRNA-Seq ve scATAC-Seq Kullanarak Retinal Gen Ekspresyonu ve Kromatin Erişilebilirliğinin Multipleks Analizi

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, yazarlar fenotipleme için MULTI-seq'in ve daha sonra retinadaki transkriptomik ve kromatin erişilebilirlik profillerini karakterize etmede eşleştirilmiş scRNA-seq ve scATAC-seq'in faydasını göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Güçlü yeni nesil dizileme teknikleri, retinal gen düzenleyici ağların gelişim sırasında ve hastalık durumlarında nasıl çalıştığını araştırmak için sağlam ve kapsamlı analizler sunar. Tek hücreli RNA dizilimi, retina gelişiminde ve hastalığında gözlenen gen ekspresyon değişikliklerini hücresel düzeyde kapsamlı bir şekilde profillememize izin verirken, tek hücreli ATAC-Seq, kromatin erişilebilirliğinin ve transkripsiyon faktörü bağlanmasının analizinin benzer çözünürlükte profillenmesini sağlar. Burada, bu tekniklerin gelişmekte olan retinada kullanımı tanımlanmıştır ve bireysel örneklerin modifiye edilmiş bir oligonükleotid-lipit kompleksi ile etiketlendiği ve araştırmacıların hem bireysel deneylerin kapsamını artırmalarını hem de maliyetleri önemli ölçüde azaltmalarını sağlayan MULTI-Seq gösterilmiştir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genlerin hücre kaderini nasıl etkileyebileceğini anlamak, hastalık ve embriyonik progresyon gibi süreçleri sorgulamada önemli bir rol oynar. Transkripsiyon faktörleri ve hedef genleri arasındaki karmaşık ilişkiler, gen düzenleyici ağlarda gruplandırılabilir. Artan kanıtlar, bu gen düzenleyici ağları, evrimsel soylar boyunca hem hastalığın hem de gelişimin merkezine yerleştirir1. qRT-PCR gibi önceki teknikler tek bir gen veya gen kümesine odaklanırken, yüksek verimli dizileme teknolojisinin uygulanması, tam hücresel transkriptomların profillenmesine izin verir.

RNA-seq, büyük ölçekli transkriptomik 2,3'e bir bakış sunar. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), araştırmacılara sadece transkriptomların profilini çıkarma değil, aynı zamanda spesifik hücre tiplerini gen ekspresyon profilleri ile bağlama yeteneği verir4. Bu, bilinen gen belirteçleri5 kullanılarak bireysel hücre profillerinin sıralama algoritmalarına beslenmesiyle biyoinformatik olarak elde edilir. Lipid etiketli indeks dizilimi (MULTI-seq) kullanılarak çoklama, toplanabilen scRNA-Seq profillerinin sayısında benzeri görülmemiş bir çeşitlilik sunar6. Bu lipit bazlı teknik, plazma membran entegrasyonu7 yerine yüzey antijenlerinin ve yüksek afiniteli antikorların varlığına dayanan hücre karması gibi diğer numune indeksleme tekniklerinden farklıdır. Artık sadece gen ekspresyon profillerini hücre tiplerine profillemek mümkün değil, aynı zamanda farklı deneyler tek bir dizileme kütüphanesinde birleştirilebilir ve bu da bireysel bir scRNA-seq deneyinin maliyetini önemli ölçüde düşürür6. ScRNA-seq'in maliyeti, birçok farklı genotipin, durumun veya hasta örneğinin analiz edildiği fenotipleme deneylerinde kullanım için yasaklayıcı görünebilir, ancak çoklama, tek bir kütüphanede 96'ya kadar numunenin kombinasyonuna izin verir6.

ScRNA-seq yoluyla gen ekspresyonunun profillenmesi, moleküler mekanizmaların hücre kaderini nasıl belirlediğine dair mevcut anlayışta devrim yaratan tek yüksek verimli dizileme tabanlı teknik olmamıştır. Bir hücrede hangi gen transkriptlerinin bulunduğunu anlamak, hücre tipinin tanımlanmasını sağlarken, aynı derecede önemli olan, genomik organizasyonun gelişimi ve hastalığın ilerlemesini nasıl düzenlediğini anlamaktır. Erken çalışmalar, histonlara bağlı olmayan dizilerin DNaz aracılı bölünmesini tespit etmeye, ardından açık kromatin bölgelerini tanımlamak için ortaya çıkan DNA fragmanlarının dizilenmesine dayanıyordu. Buna karşılık, transpozon erişilebilir kromatin dizilimi (scATAC-seq) için tek hücreli tahlil, araştırmacıların tek nükleotid seviyesi8'de açık kromatinin profilini kolayca çıkarmak için evcilleştirilmiş bir transpozon ile DNA'yı araştırmalarını sağlar. Bu, scRNA-seq'e benzer bir ölçeklemeden geçti ve şimdi araştırmacılar binlerce bireysel genomda bireysel hücre tiplerini tanımlayabilir ve fenotiplerin profilini çıkarabilir8.

ScRNA-seq ve scATAC-seq eşleşmesi, araştırmacıların hastalık modellerinde ve gelişimsel süreçlerde hücre popülasyonlarını, genomik organizasyonu ve gen düzenleyici ağları belirlemek için binlerce hücrenin profilini çıkarma yeteneğini sağlamıştır 9,10,11,12. Burada yazarlar, sayısız hayvan modelinin fenotiplemesini yoğunlaştırmak için ilk önce MULTI-seq'in nasıl kullanılacağını ve bu hayvan modellerindeki kromatin manzarasını ve düzenleyici ağları daha iyi anlamak için eşleştirilmiş scRNA-seq ve scATAC-seq'i nasıl kullanacaklarını özetlemektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmalar için hayvanların kullanımı, Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kullanılarak, ARRIVE yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve ilgili kılavuz ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. ÇOKLU SEQ

  1. Medya hazırlama
    1. Ovomukoid inhibitörü, 10 mg ovomukoid inhibitörü ve mL Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) başına 10 mg albümin hazırlayın ve dengeleyin, 13 kullanımdan önce30 dakika boyunca. Bir inkübatörde% 95 O% 2:5 CO2 ile dengeleyin.
      1. Bu inkübasyon adımı13 sırasında EBSS'de 20 birim / mL papain ve% 0.005 DNaz papain ayrışma çözeltisi hazırlayın.
        NOT: 5 numune için bir şişe DNase çözeltisi yeterli olacaktır. 5'ten fazla numunede MULTI-seq gerçekleştiriliyorsa ek şişelerin yeniden yapılandırılması gerekebilir.
    2. Lipid modifiye oligo barkodlama çözümleri hazırlayın.
      1. 0,5 μL 100 μM barkod stok çözeltisini 4,5 μL Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile birleştirerek her numune için benzersiz bir barkod seyreltme işlemi yapın.
      2. 1:1 molar oranında çapa:barkod çözeltisi hazırlamak için, 4,4 μL 10 μM barkod seyreltme, 0,9 μL 50 μM çapa çözeltisi ve 16,7 μL PBS birleştirin ve buz üzerine yerleştirin. Hem barkod telleri hem de ankraj telleri için son konsantrasyon 2 μM olmalıdır.
      3. Eş-ankraj çözeltisi hazırlamak için, 0,88 μL 50 μM ko-ankraj çözeltisini ve 21,12 μL PBS'yi birleştirin ve buzun üzerine yerleştirin. Eş-ankrajın son konsantrasyonu 2 μM olmalıdır. Bu adımdaki hacimleri, numune sayısının 1,1 katı ile çarpın.
    3. PBS'de% 1 BSA yapmak için, 0.1 g sığır serum albümini (BSA) 10 mL PBS'de çözün ve buzun üzerine yerleştirin.
    4. PBS'yi RNaz inhibitörü ile yapmak için, 2.5 μL 40 U / μL RNaz inhibitörünü 197.5 μL PBS ile birleştirin ve buz üzerinde saklayın. Bu adımdaki hacimleri, numune sayısının 1,1 katı ile çarpın.
  2. Örnek ayrışma
    1. Kurumsal IACUC gerekliliklerine uygun olarak servikal çıkık ve / veya CO2 asfiksi yoluyla hayvanları ötenazileştirin. Ötanazi yöntemi, kurumsal gereksinimlere ve kullanılan model organizmaya bağlı olacaktır.
    2. Soğuk PBS'de retinayı diseksiyon mikroskobu altında her iki gözden diseksiyon ve bir transfer pipeti kullanarak steril bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    3. Papain çözeltisinin 500 μL'sini her numune için 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
    4. Numuneleri papain çözeltisine yerleştirin ve hemen tüpleri kapatın.
    5. Numuneleri içeren tüpleri 37 °C'de, 30 dakika boyunca% 5 CO2'de inkübe edin. Şişeleri her 10 dakikada bir 3 kez ters çevirin. Örnekler, her bir ters çevirme turuyla aşamalı olarak ayrışmalıdır.
    6. Şişeleri oda sıcaklığına geri döndürün ve 300 μL'ye ayarlanmış 1 mL'lik bir pipetle her numuneyi 3-4 kez tritüre edin.
    7. Tritürasyondan sonra kalan ayrışmamış doku parçalarının yerleşmesine izin verin.
    8. Ayrışmamış doku parçalarından kaçınırken bulutlu hücre süspansiyonunu çıkarın ve her numunenin hücre süspansiyonunu yeni steril 15 mL vida kapaklı tüpe yerleştirin.
    9. Hücre süspansiyonlarını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj yapın.
    10. Santrifüjleme adımı sırasında, hücre resüsitasyon ortamını hazırlayın.
      1. 857 μL EBSS (Flakon 1), steril 1.5 mL vida kapaklı bir tüp içinde 95 μL yeniden yapılandırılmış albümin-ovomukoid inhibitör çözeltisi ile karıştırın. 1.1.1'den kaydedilen 48 μL DNase çözeltisi ekleyin. Bu adımdaki hacimleri, numune sayısının 1,1 katı ile çarpın.
    11. Süpernatanı atın, hücre peletlerini tutmaya dikkat edin ve hücre peletlerini adım 1.2.10'da hazırlanan 1 mL hücre resüspansiyon çözeltisinde derhal yeniden askıya alın.
    12. Süreksiz yoğunluk gradyanı hazırlayın.
      1. Her numune için, yeni bir 15 mL steril vida kapaklı tüpe 1,6 mL ovomukoid inhibitör çözeltisi ekleyin ve hücre süspansiyonunu dikkatlice üstüne yerleştirin. Degradenin iki katmanı arasındaki arayüz görünür olmalıdır, ancak bazı karıştırmalar sonuçları etkilemez.
    13. Süreksiz yoğunluk gradyanlarını oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 70 x g'de santrifüj edin. Ayrışmış hücreler tüplerin dibinde peletlenmeli, membran parçaları ise arayüzde kalmalıdır.
    14. Süpernatantı atın ve peletlenmiş hücreleri yıkamak için 200 μL PBS ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.
    15. Süpernatantı atın ve RNaz inhibitörü ile 180 μL PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri 40 μm'lik bir hücre süzgecinden steril bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne geçirin.
  3. Hücre barkodlaması
    1. Her numuneye 20 μL çapa:barkod çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için pipeti nazikçe karıştırın. Her numunenin benzersiz bir çapa: barkod çözeltisi aldığından emin olun ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
      1. Bu inkübasyon sırasında jel boncuk-in-emülsiyon (GEM) üretimi ve barkodlama için gerekli malzemeleri hazırlayın14.
    2. Her numuneye 20 μL ko-ankraj çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için pipeti nazikçe karıştırın. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
    3. Her numuneye PBS'de 1 mL buz gibi soğuk% 1 BSA ekleyin ve hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin.
    4. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve PBS'ye 400 μL buz gibi soğuk% 1 BSA ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
      1. Toplam 2 yıkama için adım 1.3.4'ü tekrarlayın. Süpernatantı çıkarın ve PBS'de 400 μL buz soğuk% 1 BSA'da yeniden askıya alın.
    5. Bir hemositometre kullanarak her örnek için hücre konsantrasyonunu belirleyin.
      1. Her örnek için yüklenecek toplam hücre sayısını belirleyin. Tipik olarak, bu, istenen toplam hücre sayısının numune sayısına bölünmesiyle elde edilir. Bununla birlikte, bir koşul için biyolojik bir replikasyon kaybedilmişse, payı o durumdan diğer biyolojik kopyalar arasında bölünebilir.
      2. İstenilen hücre sayısını yüklemek için gereken hacmi belirlemek üzere her numune için istenen hücre sayısını, adım 3.5'te hesaplanan numunenin hücre konsantrasyonuna bölün.
    6. Her numuneden adım 3.5.2'de hesaplanan hacimleri yeni bir steril 1,5 mL santrifüj tüpünde birleştirin. GEM üretiminin başarısız olması durumunda her numuneden alınan hacmin iki katına çıkarılması akıllıca olacaktır.
      1. Bir hemositometre kullanarak kombine numunelerin "nihai" hücre konsantrasyonunu belirleyin.
  4. GEM oluşturma ve barkodlama
    1. GEM'leri oluşturmak ve barkodlamak için birleştirilmiş numuneler kullanın14.
  5. GEM-RT Sonrası Temizleme ve cDNA Amplifikasyonu
    1. Aşağıdaki modifikasyonlarla GEM sonrası ters transkriptaz temizliği ve cDNA amplifikasyonu için üreticinin talimatlarına göre malzemeler hazırlayın14. Boyut seçimine göre GEM-RT sonrası temizliği gerçekleştirin14.
      1. 2 mL ile hazırlanan% 80 etanol hacmini artırın.
      2. Buz14 üzerinde cDNA Amplifikasyon Karışımı hazırlayın. cDNA Amplifikasyon karışımına 1 μL 2,5 μM MULTI-seq primer ekleyin. Masaüstü mini santrifüjde 5 sn için vorteks ve 5 s için santrifüj.
    2. cDNA amplifikasyonugerçekleştirin 14. cDNA, bu noktada 4 ° C'de 72 saate kadar saklanabilir.
    3. Boyut seçimi14'e göre cDNA temizliği gerçekleştirin. Endojen transkript cDNA, bu noktada 4 ° C'de 72 saate kadar veya -20 ° C'de 4 haftaya kadar saklanabilir.
      1. Süpernatantı boyut seçiminin ilk turundan atmayın. Bu kesir, örnek barkodları içerir. Süpernatantı yeni steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      2. Supernatant'ı buz üzerinde saklayın.
    4. Paramanyetik boncuk bazlı boyut seçim reaktifini yeniden askıya almak ve süpernatanta 260 μL paramanyetik boncuk bazlı boyut seçim reaktifi (son 3.2x) ve 180 μL% 100 izopropanol (1.8x) eklemek için vorteks. Karışımı 10 kez pipetleyin ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    5. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin temizlenmesini bekleyin. Sonra süpernatanı çıkarın ve atın.
    6. Boncuklara 500 μL% 80 etanol ekleyin ve 30 s bekletin. Süper natantı çıkarın ve atın.
      1. Toplam 2 yıkama için tekrarlayın.
    7. Boncukları kısaca santrifüj edin ve manyetik rafa geri dönün. 2 dakika boyunca bir zamanlayıcı başlatın.
    8. Kalan etanolleri bir P10 pipetle çıkarın ve manyetik raftaki boncukları 2 dakikanın geri kalanında havayla kurulayın. 2 dakikayı geçmeyin.
    9. Boncukları manyetik raftan çıkarın ve 100 μL elüsyon tamponunda (EB) yeniden askıya alın. Pipetin tekrar askıya alınması için iyice alın.
    10. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
    11. Manyetik rafa geri dönün ve çözeltinin temizlenmesini bekleyin.
    12. Süpernatantı taze bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    13. 1.5.4 ile 1.5.12 arasındaki adımları yineleyin. Adım 1.5.9'da kullanılan arabellek EB hacmini yarıya indirin.
    14. Bir dsDNA yüksek hassasiyetli tahlil kiti ve florometre ve parça analizörü15,16 kullanarak barkod DNA konsantrasyonunu ve boyut dağılımını belirleyin. Barkod cDNA, bu noktada 4 °C'de 72 saate kadar veya -20 °C'de 4 haftaya kadar saklanabilir.
  6. Barkod kütüphanesi yapımı
    1. 1 mL% 80 etanol hazırlayın.
    2. Steril bir PCR şerit tüpünde barkod kütüphanesi PCR ana karışımını hazırlayın: 26,25 μL 2x sıcak başlangıç PCR hazır karışımını, 2,5 μL 10 μM Universal i5 astarını, 2,5 μL 10 μM RPI astarı, 3,5 ng barkod cDNA'sını (Adım 5,14'ten konsantrasyona göre belirlenen hacim) ve son hacmi 50 μL'ye getirmek için yeterli nükleaz içermeyen suyu birleştirin.
      1. Birden fazla MULTI-seq kitaplığı birlikte sıralanmışsa, her barkod kitaplığı için benzersiz bir RPI astarı kullanın.
    3. Barkod kütüphanesi ana karışımını bir kütüphane hazırlama PCR'sine tabi tutun: 5 dakika boyunca 95 °C; 15 s için 98 °C, 30 s için 60 °C, 30 s için 72 °C'lik 10 döngü; 1 dakika boyunca 72 °C; ve ardından 4 ° C'de tutun.
    4. Paramanyetik boncuk bazlı boyut seçim reaktifini yeniden askıya almak için vorteks.
    5. PCR ürününü termosiklerden çıkarın ve 80 μL (1.6x) paramanyetik boncuk bazlı boyut seçim reaktifi ekleyin. Pipetleri iyice alın.
    6. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Mıknatıslı ayırıcıyı yüksek konuma yerleştirin ve çözeltinin temizlenmesini bekleyin.
    7. Süper natantı çıkarın ve atın.
    8. Boncuklara 200 μL% 80 etanol ekleyin ve 30 s bekletin. Süper natantı çıkarın ve atın.
      1. Toplam 2 yıkama için adım 1.6.8'i tekrarlayın.
    9. Tüpü kısaca santrifüj edin ve manyetik ayırıcıya düşük konumda yerleştirin. 2 dakika boyunca bir zamanlayıcı başlatın.
    10. Kalan etanolünü bir P20 pipetle çıkarın ve manyetik ayırıcıdaki boncukları 2 dakikanın geri kalanında havayla kurulayın. 2 dakikayı geçmeyin.
    11. Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve boncukları 25 μL tampon EB içinde yeniden askıya alın. Boncukları yeniden askıya almak için pipet iyice karıştırın.
    12. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın.
    13. Manyetik ayırıcıya düşük konumda geri dönün ve çözeltinin temizlenmesini bekleyin. Süpernatantı yeni bir PCR şerit tüpüne aktarın.
    14. adsDNA yüksek hassasiyetli tahlil kiti, florometre ve fragman analizörü kullanarak ekspresyon kütüphanesini ve barkod kütüphanesi konsantrasyonunu ve parça boyutu dağılımını ölçün.
  7. 3' Gen İfade Kütüphanesi İnşaatı
    1. Üreticinin talimatlarına göre 3' gen ekspresyon kütüphanesi yapımını gerçekleştirin14.
  8. Sıralama
    1. 7. adımda çoğaltılan endojen cDNA kütüphanesine ek olarak, adım 6'da güçlendirilmiş barkod kütüphanesini gönderin. Basitlik için, bu kitaplıkları ayrı ayrı gönderin veya uygun maliyetli bir önlem olarak, endojen cDNA kitaplığına sahip örnek barkodlama malzemesinin bir aliquot'unu ekleyin. Hücre başına 20.000-50.000 cDNA ve 3.000-5.000 barkod okuması hedefleyin.
    2. Elde edilen sıralama bcl dosyalarını cellranger mkfastq tarafından fastq dosyalarına dönüştürün ve cellranger count tarafından bunlardan oluşturulan matrisleri sayın.
    3. Deconvolute örnekleri, MULTI-seq GitHub deposunda (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq) bulunan deMULTIplex r paketini kullanarak Cellranger analizi sonrası örnekler.

2. Eşleştirilmiş scRNA-seq ve scATAC-seq

  1. scATAC-seq için flaş dondurucu doku ve scRNA-seq için retina hücrelerinin metanol fiksasyonu
    1. Medya hazırlama
      1. Retina ayrışması için çözeltileri hazırlamak üzere 1.1.1 ve 1.1.4 numaralı adımları tekrarlayın.
      2. Küçük bir buz kovasında bir etanol kuru buz banyosu hazırlayın.
      3. 4.5 mL nükleaz içermeyen suya 10.5 mL etanol ekleyerek 15 mL% 70 etanol hazırlayın.
      4. Buz kovasına (tercihen pelet formunda) yeterli miktarda kuru buz ekleyin, böylece 15 mL sıvı sadece buzu örtmek için yükselecektir. 15 mL etanol ekleyin.
      5. PBS'yi buz üzerine ve 1 mL aliquot% 100 metanolü uygun bir -20 °C dondurucuya yerleştirin.
    2. Numune hazırlama
      1. Retinaları izole etmek için 1.2.1 ve 1.2.2 adımlarını izleyin; ancak, bu sefer her retinayı ayrı bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
      2. ScATAC-seq'e gönderilen numuneler için, bir P200 pipet kullanarak mikrosantrifüj tüpünden herhangi bir sıvıyı çıkarın ve numuneyi dondurmak için tüpü hemen kapatın ve etanol kuru buz banyosuna yerleştirin.
      3. ScRNA-seq'e yönlendirilen örnekler için, hücreleri ayırmak için, disseke edilmiş retinada 1.2.3 ila 1.2.15 arasındaki adımları tekrarlayın.
      4. Hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
      5. Hücre peletini bozmadan süpernatantı çıkarın.
      6. 1 mL soğutulmuş PBS ekleyin ve 10 kez veya hücreler tamamen askıya alınana kadar hafifçe pipet karışımı yapın.
      7. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
        1. Toplam 2 yıkama için 2.1.2.5 ile 2.1.2.7 arasındaki adımları yineleyin.
      8. Hücre peletini bozmadan süpernatantı çıkarın.
      9. 100 μL soğutulmuş PBS ekleyin ve 10x veya hücreler tamamen askıya alınana kadar yavaşça karıştırın.
      10. Tüpü en düşük hız ayarında vortekslemeye başlayın. Hücrelerin kümelenmesini önlemek için tüpü nazikçe vortekse etmeye devam ederken damla damla 900 μL soğutulmuş metanol (-20 ° C) ekleyin.
      11. Hücreleri 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
      12. Bir hemositometre kullanarak sabit hücrelerin konsantrasyonunu belirleyin.
      13. Tripan mavisi kullanarak fiksasyon adımının etkinliğini değerlendirin. Canlı hücrelerin yüksek bir kısmı, daha fazla fiksasyon süresinin gerekli olduğunu gösterir.
      14. Dondurulmuş dokuyu ve sabit hücreleri -80 °C'de saklayın.
  2. scATAC-seq için flaş dondurulmuş dokudan çekirdek izolasyonu
    1. Medya hazırlama
      1. 9.77 mL nükleaz içermeyen su, 100 μL 1 M Tris-HCl (pH 7.4), 100 μL 1 M NaCl, 30 μL 1 M MgCl2 ve 0.1 g BSA'yı birleştirerek lizis seyreltme tamponunu hazırlayın.
      2. Lizis seyreltme tamponunu bir gün önce olduğu gibi önceden hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Protokol gününde, buzun üzerine yerleştirin.
      3. scATAC kitinin üreticisi tarafından sağlanan 20x çekirdek tamponunu -20 ° C'den oda sıcaklığına dengeleyin. Vorteks ve santrifüj kısaca.
      4. Çökelti çözülene kadar% 5 Digitonin çözeltisini 65 ° C'lik bir su banyosunda inkübe ederek 1x lizis tamponunu hazırlayın. Daha sonra 2 mL lizis seyreltme tamponu, 20 μL% 10 Tween-20, 20 μL Nonidet P40 Substitute (alternatif olarak IGEPAL olarak etiketlenebilir) ve 4 μL Digitonin'i birleştirin.
      5. 1x lizis tamponunu buz üzerinde saklayın.
      6. 0,1x lizis tamponunu hazırlamak için, 1,8 mL lizis seyreltme tamponunu 200 μL 1x lizis tamponu ile birleştirin ve buz üzerinde saklayın.
      7. Yıkama tamponunu hazırlamak için, 2 mL lizis seyreltme tamponunu ve 20 μL% 10 Tween-20'yi birleştirin ve buz üzerinde saklayın.
      8. Seyreltilmiş çekirdek tamponunu hazırlamak için, 950 μL nükleaz içermeyen suyu 50 μL çekirdek tamponu (20x) ile birleştirin ve buz üzerinde saklayın.
    2. Çekirdek İzolasyonu
      1. Lizisten önce numuneyi çözmeyin. Dondurulmuş numuneyi içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 500 μL soğutulmuş 0,1x lizis tamponu ekleyin. Bir pelet havanesi kullanarak 15x'i hemen homojenleştirin.
      2. Buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın. Bu inkübasyon adımı17 sırasında scATAC transpozisyonu için gerekli malzemeleri hazırlayın.
      3. Pipet, 1 mL'lik bir pipetle 10 kat karıştırır ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Bu inkübasyon adımı sırasında scATAC transpozisyonu için gerekli malzemelerin henüz tamamlanmamışsa tam olarak hazırlanması. Daha fazla Seyreltilmiş Çekirdek Tamponu hazırlamak gereksizdir.
      4. Lize hücrelere 500 μL soğutulmuş yıkama tamponu ekleyin. Pipet karışımı 5x.
      5. Süspansiyonu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne geçirin. Her seferinde yeni bir 70 μm hücre süzgeci kullanarak bir seferde ~ 300 μL filtreleyin.
      6. Toplanan akışı 40 μm'lik bir hücre süzgecinden yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne geçirin ve buz üzerinde saklayın.
      7. Bir hemositometre kullanarak çekirdek konsantrasyonunu belirleyin. Çekirdek konsantrasyonuna ve hücre süspansiyonunun toplam hacmine dayanarak, ayrışmış çekirdeklerin toplam sayısını hesaplayın.
      8. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve çekirdek peletini bozmadan süpernatantı çıkarın.
      9. Adım 2.2.2.7.'de belirlenen toplam çekirdek sayısına dayanarak çekirdek stoğunu oluşturmak için, çekirdekleri istenen çekirdek konsantrasyonuna ulaşmak için yeterli seyreltilmiş çekirdek tamponunda yeniden askıya alın.
        NOT: İstenen çekirdek konsantrasyonu, scATAC-seq deneyi için hedeflenen çekirdek geri kazanımına dayanır ve üreticinin protokol17'sinde bulunan Çekirdek Konsantrasyonu Kılavuzlarından belirlenir. Örneğin, sonuçta 10.000 çekirdek istenirse, Çekirdek Stoğu için istenen çekirdek konsantrasyonu 3.080 ila 7.700 çekirdek / μL arasındadır. Konsantrasyonda aralığın ortasını hedeflemek en iyisi olabilir.
      10. Bir hemositometre kullanarak çekirdek konsantrasyonunu belirleyin.
      11. Hemen hazırlanan çekirdek stoğu17'yi kullanarak scATAC transpozisyonuna geçin.
  3. ScRNA-Seq'te kullanım için Metanol Sabit Hücrelerin Rehidrasyonu
    1. Medya Hazırlama
      1. Yıkama/seyreltme tamponunu hazırlamak için, 0,01 g BSA'yı 1 mL PBS içinde çözün. Daha sonra 12.5 μL 40 U/μL RNaz İnhibitörü ekleyin ve yavaşça karıştırın. Buz üzerinde saklayın.
    2. Hücre Rehidrasyonu
      1. Metanol sabit hücreleri, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3000 x g'de 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde santrifüj yapın. Sonra süpernatantı çıkarın.
      2. Mikrosantrifüj tüpüne 200 μL soğutulmuş yıkama/seyreltme tamponu ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Toplam 2 yıkama için tekrarlayın.
        NOT: GEM üretimi ve barkodlama için gerekli malzemeleri önceki iki adımdahazırlayın 14.
      3. Hücre stoğunu hazırlamak için, 2.1.2.12.'de hesaplanan toplam hücre sayısına dayanarak, istenen hücre konsantrasyonunu elde etmek için hücreleri yeterli yıkama / seyreltme tamponunda yeniden askıya alın. Tercih edilen hücre konsantrasyonları 700 ila 1200 hücre / μL arasındadır.
      4. Bir hemositometre kullanarak hücre stoğunun hücre konsantrasyonunu belirleyin.
      5. Hemen hücre stoğu14'ü kullanarak GEM oluşturma ve barkodlamaya geçin.
    3. Sıralama
      1. Zaman kursu analizi yaparken (geliştirme veya hastalıkta olduğu gibi), teknik varyasyonu azaltmak için birden fazla numuneyi çok katlı bir çalışmada (yani, tek bir akış hücresinde birden fazla kütüphane) sıralayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iş akışı, tek hücre dizilimini kullanarak gelişimsel fenotiplerin ve düzenleyici süreçlerin araştırılması için bir strateji ortaya koymaktadır. MULTI-seq numune çoklaması, başlangıçta düşük maliyetli bir fenotipleme testine olanak tanırken, scRNA-seq ve scATAC-seq için numunelerin eşleştirilmiş toplanması ve sabitlenmesi daha derinlemesine araştırmaya olanak tanır (Şekil 1).

MULTI-seq barkodlaması, birden fazla numunenin birleşik dizilenmesini ve ardından hesap...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MULTI-seq'in gücü, birden fazla deneysel koşuldan veya modelden gelen verilerin sorunsuz entegrasyonundan ve maliyet ve parti etkilerini sınırlama açısından muazzam faydadan kaynaklanmaktadır. MULTI-seq'in kullanılması, laboratuvara benzeri görülmemiş bir fenotipleme derinliği sunar. Hücre karması veya çekirdek karması gibi genetik olmayan çoklama yöntemleri, barkodlu antikorların kullanımı yoluyla çoklanmış örneklere kapı açtı 7,19,20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklayacak bir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Johns Hopkins Transkriptomik ve Derin Sıralama Çekirdeği'nden Linda Orzolek'e, üretilen kütüphanelerin sıralanmasına yardımcı olduğu için ve Lizhi Jiang'a ex vivo retinal eksplantları gerçekleştirdiği için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 ve mikro; L, 200 ve mikro; L, 1000 ve mikro; L pipet filtre uçları
%10 Tween 20Bio-Rad1662404
100 & Gartner laboratuvarındanhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
=gerçek
%100 EtanolMillipore SigmaE7023-500ML
%100 MetanolMillipore Sigma322415-100ML
10x Çip Tutucu10x Genomik1000195
10x Chromium denetleyici ve Aksesuar Kiti10x GenomikPN-120263
15mL Santrifüj TüpüKalite BiyolojikP886-229411
40 & mikro; m FlowMi Hücre SüzgeciBel-ArtH13680-0040
50 & M Anchor SolutionSigma veya Gartner lab'den talephttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
=gerçek
50 &mikro; M Co-Anchor SolutionSigma veya Gartner lab'den talephttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer sistemiAgilentM5310AA
70 um FlowMi hücre süzgeciBel-ArtH13680-0070
Allegra X-12R SantrifüjVWRBK392302
Sığır Serumu AlbüminiSigma-AldrichA9647
Krom Sonraki GEM Çip G10x GenomikPN-1000120
Chromium Next GEM Chip H10x GenomicsPN-1000161
Chromium Next Gem Tek Hücreli ATAC Reaktif Kiti v1.110x GenomikPN-1000175
Krom Tek Hücreli 3' GEM, Kütüphane ve Jel Boncuk Kiti v3.110x GenomikPN-1000121
DigitoninFisher ScientificBN2006
Diseksiyon mikroskobuLeica
DNA LoBind Tüpleri, 1.5 mLEppendorf22431021
Kuru Buz
EVA Köpük Buz TavasıTequipment04393-54
FA 12-Kılcal Dizi Kısa, 33 cmAgilentA2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp SuBanyosu Fisher Scientific15-460-20Q
Forma CO2 Su Ceketli İnkübatörThermoFisher Scientific3110
Gliserol %50 Sulu çözeltiRicca Chemical Company3290-32
Hausser Scientific Parlak Çizgi Sayma OdasıFisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq veya NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
Düşük TE Tampon KalitesiBiyolojik351-324-721
Magnezyum Klorür Çözeltisi 1 MSigma-AldrichM1028
1.5 mL tüpler için Manyetik Ayırıcı RafMillipore Sigma200 ve mikro için 20-400
Manyetik Ayırıcı Raf; L tüpler10x GenomikNC1469069
MULTI-seq PrimerSigma veya IDTDizi listesine
MyFuge Mini SantrifüjBenchmark ScientificC1008
Nonidet P40 İkameSigma-Aldrich74385
Nükleaz içermeyen suFisher ScientificAM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 mikropipetlerEppendorf
Papain Ayrışma SistemiWorthington Biochemical CorporationLK003150
PBS pH 7.4 (1X)Fisher Scientific10010-023
Qiagen Tampon EBQiagen19086
Buzdolabına Dayanıklı Santrifüj 5424 REppendorf2231000655
RNaz İçermeyen Tek Kullanımlık Pelet HavaneliFisher Scientific12-141-368
RNasin Plus RNase İnhibitörüPromegaN2615
RPI primerSigma veya IDTDizi listesine
Tek İndeks Kiti N, Set A10x GenomikPN-1000212
Tek İndeks Kiti T Set A10x GenomikPN-1000213
Sodyum Klorür Çözeltisi 5 MSigma-Aldrich59222C
SPRIselect Reaktif KitiBeckman CoulterB23318
Standart Tek Kullanımlık Transfer PipetleriFisher Scientific13-711-7M
TempAssure PCR 8 tüplü şeritUSA Scientific1402-4700
Trizma Hidroklorür Çözeltisi, pH 7.4Sigma-AldrichT2194
Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4 (a/h)Corning25-900-CI
Universal I5 astarSigma veya IDTSıra listesine
Veriti Thermal CyclerUygulamalı Biyosistemler4375786
Vorteks KarıştırıcıVWR10153-838
M Barkod Çözüm Talebi bakınbakınbakın

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96(2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224(2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345(2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598(2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907(2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell RNA SeqSingle Cell ATAC SeqRetinal Gene ExpressionChromatin AccessibilityGene Regulatory NetworksMULTI Seq BarcodingCell Type IdentificationCell ClusteringSample BarcodingRetinal Development

Related Articles