Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

2.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62244

⸱

4 Nisan 2021

 ,  ,  ,  , 
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, C. elegans complex I hastalığı gaz-1(fc21)solucanlarında, yani ZebraLab (orta verimli bir test) ve WormScan'da (yüksek verimli bir test) iki yarı otomatik lokomotor aktivite analizi yaklaşımı için protokoller sunar ve nematod davranışını ve entegre nöromüsküler işlevi ölçmek için çok çeşitli araştırma yöntemleri arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.

Özet

Caenorhabditis elegans, çeşitli insan hastalıklarının mekanizmalarını ve tedavilerini verimli bir şekilde sorgulamak için çevirisel bir hayvan modeli olarak merkezi faydası ile yaygın olarak tanınmaktadır. Solucanlar, hızlı gelişim döngüsü, büyük kuluçka boyutu, kısa ömür, mikroskobik şeffaflık, düşük bakım maliyetleri, sağlam genomik araçlar paketi, mutant depoları ve hem in vivo hem de eks vivo fizyolojisini sorgulamak için deneysel metodolojilerinden yararlanarak terapötik hedefler ve tedaviler hakkında daha derin içgörüler elde etmek için özellikle yüksek verimli genetik ve ilaç ekranları için uygundur. Solucan lokomotor aktivitesi, mitokondriyal hastalıkta sıklıkla bozulan, nedenleri ve tezahürleri oldukça heterojen olan ancak hücresel enerji üretme kapasitesinin bozulmasını toplu olarak paylaşan özellikle ilgili bir fenotipi temsil eder. Solucan davranışını sorgulamak için farklı metodolojilerden oluşan bir paket kullanılabilirken, bunlar genomik veya ilaç yüksek verimli ekranlar için deneysel maliyetler, karmaşıklık ve yardımcı programlarda büyük ölçüde değişir. Burada, C. eleganların farklı aşamalarda, yaşlarda ve deneysel sürelerde tek solucan veya solucan popülasyonlarında nematod hareketliliği, kırbaçlama, farengeal pompalama ve/veya kemotasisi ölçen 16 farklı aktivite analizi metodolojisinin göreli verimi, avantajları ve sınırlamaları karşılaştırıldı. ZebraLab (orta verimli bir yaklaşım) ve WormScan (yüksek verimli bir yaklaşım) olmak üzere mevcut yazılım araçlarının yeni uygulamalarını temsil eden nematod lokomotor etkinliğini ölçmek için iki yarı otomatik yöntem için ayrıntılı protokoller gösterilmiştir. Bu yöntemlerin uygulanmasından elde edilen veriler, L4 larva aşamasında benzer derecelerde hayvan aktivitesinin gerçekleştiğini ve mitokondriyal kompleks I hastalığında (gaz-1(fc21)) mutant solucanlarında vahşi tip (N2 Bristol) C. elegans'agöre1. Bu veriler, mitokondriyal hastalığın preklinik hayvan modellerinde solucan davranışı üzerinde yüksek verimli ilaç taramasını desteklemek için değişken kapasite ile solucan lokomotor aktivitesini verimli ve objektif bir şekilde ölçmek için ZebraLab veya WormScan yazılım araçlarını kullanmanın bu yeni uygulamalarının yardımcı programını doğrulamaz.

Giriş

Caenorhabiditis elegans, katı medyada çiftleşme, beslenme, yumurtlama, dışkılama, yüzme ve hareketlilik dahil olmak üzere tüm solucan davranışlarını koordine eden 302 nörona sahip olduğu için nörobilimde olağanüstü bir model olarak kabul edilmektedir1. Bu hermafroditik nematodlar, C. eleganlar ve insanlar arasındaki ~% 80 genlerin iyi karakterize edilmiş genomu ve yüksek homolojisi ile mümkün olan çok çeşitli insan hastalığı mekanizmalarını anlamak için de yaygın olarak kullanılmaktadır2,3,4. C. elegans uzun zamandır insan mitokondriyal hastalığı 5,6,7,8,9,10hücresel enerji üretme kapasitesini paylaşan ve genellikle klinik olarak önemli ölçüde bozulmuş nöromüsküler fonksiyon, egzersiz intoleransı ve yorgunluk ile mevcut olan kalıtsal metabolik bozuklukların son derece genetik ve fenotipik heterojen bir grubudur11 ,12,13,14. Bu amaçla, C. elegans modellerinin kullanımı, mitokondriyal hastalığın farklı genetik alt tiplerinde hayvan aktivitesinin ve nöromüsküler fonksiyonun nicel yönlerinin klinik öncesi modellemesinin yanı sıra nöromüsküler fonksiyonlarını ve genel aktivitelerini iyileştirebilecek aday tedavilere yanıtlarını sağlar.

C. elegans'taki nöromüsküler aktivite, katı veya sıvı ortamda fonksiyonel analizlere izin veren manuel ve yarı otomatik yaklaşımlar da dahil olmak üzere bir dizi deneysel metodoloji ile objektif olarak ölçülebilir (Tablo 1)1,15. C. elegans aktivitesinin doğru niceliği, kas ve sinir sisteminin fonksiyonu ve gelişimi ile ilgili keşifleri etkinleştirmek için önemli olduğu kanıtlanmıştır16,17,18. Bu çalışma, C. elegans hastalıkları modellerinde nöromüsküler fonksiyon ve aktiviteyi değerlendirmek için araştırma laboratuvarlarında gerçekleştirilebilecek 17 farklı testin deneysel gereksinimlerini, avantajlarını ve sınırlamalarını özetler ve karşılaştırır, hem gelişim evrelerinde ve yaşlarında hem de aday tedavilerine yanıt olarak temelde (Tablo 1 ). Nitekim, çalışma, kullanılan deneysel ve analitik metodolojiyi, her yöntemin avantajlarını ve sınırlamalarını, her testi gerçekleştirmek ve analiz etmek için gereken ekipman ve yazılımı, her durumda C. elegans thrashing (dakikada vücut virajları), lokomotor aktivitesi, farengeal pompalama ve kemotaksi oranlarını karakterize etmek için mevcut deneysel yaklaşımların aralığına ayrıntılı bir genel bakış sunmaktadır. ve her yöntemin yüksek verimli genetik veya ilaç tarama amaçları için kullanımını desteklemek için üretilen iş kapasitesi. Her bir analizin aktarım hızı kapasitesi, solucan bakımı, işlem süresi, tek veya çok kuyulu plakaların kullanımı ve/veya deneysel ayarı ve veri analizlerini tamamlamak için gereken deney zamanı da dahil olmak üzere deneysel protokol karmaşıklığına bağlı olarak düşük, orta veya yüksek olarak tanımlanır.

Thrashing19,lokomotor aktivite20,farengeal pompalama17,21ve kemotaksi22,23 manuel analizleri stereomikroskop gerektiren solucan aktivitesini değerlendirmek için iyi kurulmuş metodolojilerdir24. Solucanların hırpalama aktivitesinin ölçülmesi, dakikada vücut bükülme sıklığını belirlemek için sıvı ortamda analiz gerektirirken, solucan lokomotor aktivitesi katı ortamda veya sıvı ortamda ölçülebilir. Bununla birlikte, bireysel solucan aktivitesinin manuel analizleri doğası gereği zaman alıcıdır ve kaçınılmaz kullanıcı tarafından oluşturulan önyargıyı içerir. Solucan aktivite analizlerinin otomasyonu, kullanıcı tarafından oluşturulan önyargıyı en aza indirir ve deneysel aktarım hızını büyük ölçüde artırabilir25. Sıvı ortamda solucan kırbaçlama aktivitesinin video kayıtları wrMTrck, bir ImageJ eklentisi26kullanılarak analiz edilebilir. Bununla birlikte, wrMTrck için geliştirilen orijinal deneysel ayarlar yardımcı programını sınırladı, çünkü tek bir sıvı damlasında çok fazla solucan, doğru izlemeyi zorlaştıran solucanların üst üste binmasına yol açtı. Bu deneysel sınırlama çözülmüş olsa da27, wrMTrck yöntemi yüksek aktarım hızı taramasını destekleyemiyor.

C. elegans mitokondriyal hastalık modellerinde solucan lokomotor aktivitesini temelde ve aday tedavilerine yanıt olarak ölçmek için bir dizi yöntem mevcuttur. Bunlar arasında ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28, geniş görüş alanı nematod izleme platformu (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, Infinity Chip32ve WMicrotracker One33 (Tablo 1) bulunur. Bu yöntemler, genellikle çok kuyulu plakalarda, birden fazla solucan suşunda veya koşullarında eşzamanlı lokomotion analizine olanak tanır ve böylece daha yüksek verimli ilaç tarama uygulamalarını destekler. Bu yöntemlerden bazıları, pahalı ekipmana ve açık erişim yazılımına olan ihtiyaç ve deneysel protokolleri gerçekleştirme kolaylığı gibi genel yardımcı programlarını sınırlandırabilecek veya geliştirebilecek benzersiz hususlara sahiptir. Genel olarak, tek bir deneysel sistem veya protokol tüm C. elegans locomotor aktivite deneyleri için ideal değildir. Bunun yerine, belirli bir araştırmacının deneysel hedeflerine ve gereksinimlerine en uygun yöntemi dikkatlice seçmek önemlidir.

Farengeal pompalama, C. elegans'takinöromüsküler aktiviteyi değerlendirmek için başka bir önemli sonucu temsil eder. C. elegans farenks, solucanın beslenme sistemi34 , 35,36'nın ön ucundaki Escherichia coli'nin (E. coli)yutulmasını sağlayan 20 kashücresi,20 nöron ve20diğer hücreden oluşur. Farengeal pompalama oranlarını belirlemek için çeşitli manuel yöntemler oluşturulmuştur17,21,37,38. Çoğu yöntem, deneysel gözlemci tarafından doğrudan sayım ile farengeal pompalama frekansını görselleştirmek ve kaydetmek için stereomikroskop ve kamera kullanımına dayanmaktadır21. Otomatik farengeal pompalama hızı analizi, her pompanın süresi hakkında ek bilgi sağlayan hücre dışı elektrofiyerngeogram (EPG) kaydı yapılarakmümkündür 39. Farengeal pompalama hızı analizi, bireysel solucanların40 , 41odalarında hapsedildiği mikroakışkan bir sistem olan WormSpa'da da mümkündür. Farengeal pompa oranının analizini kolaylaştırmak için kullanılabilen ticari bir yöntem, özel bir çipte hareketsiz hale getirilen tek bir solucanda beslenme davranışının nöromüsküler yönlerini ölçen, görselleştiren ve analiz eden ScreenChip Sistemidir (InVivo Biosystems). Bu farengeal pompalama nicel yaklaşımı, ilaçlara, yaşlanmaya ve diğer faktörlere hem nöronal hem de fizyolojik yanıtları değerlendirmek için kullanılabilir42,43,44,45.

Kemotaxis, nematod büyüme ortamı (NGM) plakasının tanımlanmış bir alanında solucanlardan uzağa yerleştirilen bir kokuya yanıt olarak C. eleganların hareketini tanımlar. Kemotaksi yanıtının değerlendirilmesi, solucanların odoranta doğru kat ettiği fiziksel mesafeyi belirli bir zaman diliminde gözlemleyerek ve ölçerek ölçülebilen solucan nöronal ve nöromüsküler aktivitesinin entegre bir ölçüsünü sağlar46. Multi-Worm Tracker, solucanların bir çekiciye veya itici47'yedoğru kat ettiği mesafeyi ölçmenin deneysel verimliliğini artırmak için kullanılabilecek otomatik bir yöntemdir.

Burada, solucan aktivitesini ölçmek için oluşturulan iki yeni, yarı otomatik yöntem için ayrıntılı protokol açıklanmıştır. İlk yaklaşım ZebraLab'ı, C. eleganların sıvı ortamlarındaki genel lokomotor aktivitesini hareket sırasındaki piksel değişikliklerine dayanarak ölçmek için yeni bir orta verimli uygulama için Danio rerio'nun (zebra balığı) yüzme aktivitesini incelemek için geliştirilmiş ticari bir yazılım kullanır (Tablo 1, Şekil 1). Veri çıkışı, çok sayıda eşzamanlı koşuldan ve cam slaytta analiz edilen örneklerden hızlı bir şekilde elde edilir, ancak bu yöntem çok kuyulu bir plaka formatına uygun değildir. İkinci yaklaşım, WormScan metodolojisi48,49 ( Şekil2), doğurganlık ve sağkalım gibi entegre fizyolojik sonuçların yarı otomatik nicel analizini sağlamak için açık kaynaklı yazılımla değişken olarak kullanılabilecek iki sıralı taramanın diferansiyel görüntüsünü oluşturmak için düz yataklı bir tarayıcı kullanır. Burada, 96 kuyulu, düz tabanlı bir plakanın kuyusu başına on beş larva evre 4 (L4) solucan popülasyonlarında sıvı ortamda solucan lokomotor aktivitesini ölçmek için WormScan metodolojisinin yeni bir yüksek verimli adaptasyonu geliştirilmiştir. Bu yarı otomatik ve düşük maliyetli WormScan metodolojisi, yüksek verimli ilaç ekranlarına ve çeşitli hayvan evrelerinin ve48,49yaşlarının analizlerine kolayca uyarlanabilir.

Burada, hem ZebraLab hem de WormScan yarı otomatik yöntemlerini kullanarak C. elegans locomotor aktivitesini analiz etme protokolü ve etkinliği, mitokondriyal kompleks I hastalığı, gaz-1(fc21) için iyi kurulmuş bir C. elegans modelinde gösterilmiştir. gas-1 (K09A9.5 geni) insan NDUFS2'nin (NADH: ubiquinone oxidoreductase core (demir-kükürt proteini) alt birliği 2) ortologudur (Şekil 3). C. elegans gas-1(fc21) mutant suşu, NDUFS250'nin insan ortologunda homozigous p.R290K yanlış algı mutasyonu taşır, bu da doğurganlık ve yaşam süresinde önemli ölçüde azalmaya neden olur, bozulmuş solunum zinciri oksidatif fosforilasyon (OKSPHOS) kapasitesi51, ayrıca artan oksidatif stres ile azalmış mitokondriyal kütle ve membran potansiyeli5,8 . Son yirmi yılda mitokondriyal hastalığı incelemek için köklü kullanımına rağmen, gaz-1(fc21) mutantlarının lokomotor aktivitesi daha önce bildirilmedi. Burada ZebraLab ve WormScan yöntemleri, hem yöntemleri doğrulamanın hem de deneysel protokollerin ve bilişim analizlerinin karşılaştırmalı yararlarını ve verimliliğini göstermenin bir yolu olarak, vahşi tip (WT, N2 Bristol) solucanlara kıyasla gaz-1(fc21)lokomotor aktivitesini bağımsız olarak ölçmek için uygulanmıştır. ZebraLab yazılımı, C. elegans mitokondriyal hastalık modellerinde, hedeflenen ilaç taraması veya doğrulama çalışmaları için potansiyel uygulama ile birkaç eşzamanlı solucan lokomotor aktivitesinin hızlı bir şekilde nicelasyonuna izin verdi. Özellikle WormScan analizi, bileşik kütüphanelerin yüksek verimli ilaç ekranlarını kolayca etkinleştirmek ve birincil mitokondriyal hastalığın preklinik C. elegans modellerinde hayvan nöromüsküler fonksiyonunu ve lokomotor aktivitesini geliştiren müşteri adaylarını önceliklendirmek için uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. ZebraLab yazılımını kullanan cam slaytlarda sıvı ortamda solucan lokomotor aktivite analizi

  1. Nematod büyümesi ve elleçleme
    1. Nematod büyüme ortamı (NGM) içeren Petri plakalarında C. elegans yetiştirin ve besin kaynağı olarak Escherichia coli OP50 ile yayılır. Solucan kültürünü daha önce açıklandığı gibi 20 °C'de koruyun8.
    2. Zamanlanmış bir yumurta gerçekleştiren solucanları senkronize edinve solucanları istenen aşamada inceleyin. Bu protokolde L4 evre solucanları analiz edilmiştir.
    3. Ngm plakalarında kontrol ve mutant solucan suşlarını test edilecek veya tampon kontrolü yapılacak ilaç tedavileri ile ve olmadan büyütün. İlaç tedavisi etkilerini değerlendirmek için, S. bazal çözeltisinde istenen ilaç stok konsantrasyonunu hazırlayın; hesaplanan belirli hacmi NGM plakalarına yayın ve kurumasını sağlar. Solucanları belirli bir larva veya yetişkin aşamasında aktarın ve analizden önce istenen süre boyunca ilaç tedavi plakasını koruyun.
  2. Lokomotor aktivite video kaydı ve ZebraLab analizi için solucanların deneysel kurulumu
    1. Solucan çekme kullanarak gerinim ve durum başına 5 senkronize L4 solucanı seçin. Pipet bir kameraya bağlı stereomikroskop altında bulunan cam bir slayda tek bir 20 μL S. bazal çözelti damlası ve içine 5 solucan aktarın (Şekil 1A, B). NGM ve E. coli OP50 içeren Petri kabından 5 solucanı yalnızca kayıttan önceki anda sıvı damlasına aktarın.
      NOT: Önceki video kaydedilene kadar Petri kabındaki diğer solucanları korumaya devam edin. Bu, işlem sırasında 20 μl damlanın kuruması nedeniyle diğer solucanlarda oluşan hasarı önleyecektir (kuru zaman ~15-20 dk).
    2. Birden fazla teknik çoğaltma elde etmek için bir slaytta pipet birden fazla damla (Şekil 1A). Farklı NGM plakalarından solucanları seçin (biyolojik çoğaltma). Kapak fişi kullanmayın.
    3. Tek bir damlanın tüm alanını görselleştirmek için mikroskobun çalışma mesafesini ayarlayın. Dosyaları yazılıma yüklemek için düşük bir video çözünürlüğü (<1024 x 768) ayarlayın ve koruyun.
    4. Solucanların kayıt yapmadan önce 1 dakika boyunca oda sıcaklığında kaydırağa alışmasına izin verin.
    5. Solucan yüzme aktivitesini saniyede 15 karede (fps) 1 dakika boyunca 1 damla olarak kaydedin. Plakadaki her ek damla için görüntülemeyi tekrarlayın.
  3. C. ZebraLab yazılımında elegans lokomotor aktivite kayıt analizi
    1. Yazılıma video yüklemek için ZEBRALAB AVI seçeneğini kullanın. AVI Dosyaları ile Niceleme seçeneğine tıklayın (Şekil 1C).
    2. Yeni bir iletişim kuralı oluşturmak için, Dosya > Protokol Oluştur'u seçin ve analiz için seçilen alan sayısını ekleyin. Konum Sayısı: 1 'iseçin.
    3. Protokol Parametrelerini açın ve Deneme Süresi penceresinde 1 dakika'yı seçin. Farklı deneysel süreler için farklı bir deneysel süre seçin. İstenilen veri çıktısına bağlı olarak Zaman Deposu Yok penceresini seçin veya seçimini kaldırın ve Tümleştirme Dönemi'ni seçin. Bu çalışmada Zaman Kutusu seçilmedi ( Şekil1D).
      NOT: Zaman depo gözü, etkinliğin ortalamasının alacağı zamandır.
    4. Bir iletişim kuralı zaten oluşturulmuşsa, Protokolü Aç'ı seçin ve kaydedilen protokolü seçin (.vte biçiminde).
    5. Daha önce kaydedilmiş her bir video dosyasını karşıya yüklemek için Dosyala ve Film Aç'ı seçin.
    6. Tek bir algılama alanı oluşturmak ve solucanların bulunduğu tüm sıvı damlasının etrafında bir alan oluşturmak için Şekil 1E'de (siyah ok) belirtilen Alan simgesini seçin. Seç'e tıklayın, ardından İşaretleri > Oluştur > Alanlaraltındaki yeşil daire simgesine (gri ok) tıklayın.
      NOT: Tanımlanan damladaki tüm solucanların etkinliği seçilen alanda algılanacaktır (Şekil 1E,F).
    7. Kalibrasyon > Çizim ölçeğine (Şekil 1E) gidin ve video alanının solundan sağuna yatay bir çizgi çizin. Kalibre etmek için gerçek mesafeyi belirtin. Ardından Gruba Uygula 'yıseçin.
    8. Alanı oluşturmak için seçilen simgenin seçimini kaldırın (Şekil 1E'dekiok) ve Saydam'ı seçin veya seçimini kaldırın.
      NOT: Bu çalışmada Saydam seçilmiş ve daha iyi sonuçlar vermiştir.
    9. Analiz edilen tüm farklı C. elegans solucan suşlarının algılanmasına izin vermek için Algılama Duyarlılığını ve Etkinlik Eşiğini ayarlayın.
      NOT: Bu deneyde, Algılama Duyarlılığı sırasıyla 15 ve 2'lik Patlama ve Donma değerleriyle 8 olarak ayarlanmıştır (Şekil 1F).
    10. Aktivite analizi devam ederken hayvan tarafından yapılan parçayı görselleştirmek için Ekran Ölçeğini 70 olarak ayarlayın. Ardından Gruba Uygula 'yı (Şekil 1F) seçin.
    11. Farklı Kaydet > Yürüt > Deneme'yi ve ardından Başlat'ı tıklatın. Bir pencere açılır. Videoyu hızlı bir şekilde analiz etmek için video medyasını maksimum bilgisayar hızında işlemek istiyor musunuz?'u seçin (örneğin, ZebraLab yazılımı tarafından 1 dakikalık bir video kaydı 5 s olarak analiz edilir).
    12. Başka bir pencere açılır: Deneme Çalıştırma; denemeye devam etmek için Başlat'a tıklayın.
    13. Video kaydı tamamlandıktan sonra analiz durur. Deney > Durdur 'atıklayın. Bu, elektronik tablodaki tek bir düşüşten analiz edilen etkinliği kaydeder.
    14. Her bir damla videosu için analizi tekrarlayın. Her damla bir teknik kopyadır.
  4. ZebraLab verilerinin çıktısı ve analizi
    NOT: Denemeden sonra, her videodaki veriler seçilen klasöre ayrı elektronik tablolar olarak ayrı ayrı kaydedilir. Veri çıkış dosyasında, tek bir düşüşte hareket eden tüm solucanların tümleşik etkinlik düzeyi, actinteg altında piksel değiştikçe kaydedilir.
    1. Her videonun analizinden elde edilen her elektronik tabloyu açın. Bunları el ile tek bir dosyada derleyin.
      Mutant ve vahşi tür verilerini denetimin yüzdesine normalleştirin. Burada gruplar arasındaki ortalama aktivite düzeylerini karşılaştırmak için istatistiksel analizler yapıldı.

2. WormScan yazılım analizi ile sıvı ortamda 96 kuyu plakası formatında solucan lokomotor aktivite analizi

  1. Nematod büyümesi ve elleçleme
    1. Bölüm 1.1.1'de açıklandığı gibi C. elegans yetiştirin.
    2. Solucanları bölüm 1.1.2'de açıklandığı gibi eşitleyin.
    3. Bölüm 1.1.3'te açıklandığı gibi, L4 aşamasına veya 1.
  2. WormScan aktivite analizi için 96 kuyu plakasında solucanların deneysel kurulumu
    1. Daha önce açıklandığı gibi 96 kuyulu, net, düz tabanlı, mikro plakanın her kuyusuna S. bazal ortamda sıvı süspansiyonda E. coli OP50 hacmi başına% 2 ağırlıkta50μLekleyin.
    2. Stereomikroskop altında, L4 aşamasında veya 1. Solucanların taramadan önce 20 dakika boyunca sıvı ortama alışmasına izin verin.
      NOT: Diğer hayvan evreleri ve yaşları çalışma için kolayca değiştirilebilir.
  3. WormScan aktivite analizi 96 kuyu plakasında ve veri elektronik tabloya dışa aktarıyor.
    1. Her 96 kuyulu, net, düz tabanlı mikro plakayı, taramalar arasında 10 s'den az olacak şekilde standart bir düz yataklı tarayıcı kullanarak iki kez tarayın.
      NOT: Burada, jpeg görüntüleri üretmek için 1.200 nokta/in ve 16 bit gri tonlamalı fotoğraf tarayıcısı kullanıldı. Fotoğraf tarayıcısını kullanarak dört 96 kuyu plakasını taramak için gereken süre 10 dakikadan azdır.
    2. Açık kaynak yazılım49kullanarak iki sıralı taramayı hizalayın (Şekil 2A).
      NOT: Yazılım, ilgi çekici bir bölge için iki sıralı görüntü (Şekil 2B) ve göreli bir WormScan Puanıarasındaki piksel değişikliklerini değerlendirmek için bir fark görüntüsü oluşturur. Bu WormScan Skoru, tarayıcı tarafından 5 piksel eşiğine ayarlandığında üretilen ışık yoğunluğuna göre lokomotor tepkislerindeki değişikliklere eşdeğerdir (Şekil 2C).
    3. Verileri WormScan'dan elektronik tablo olarak verin. Verileri içeren elektronik tabloyu yerel bilgisayara kaydedin. Verileri kontrol yüzdesi (POC) olarak normalleştirin ve çeşitli mutant veya tedavi koşulları için biyolojik çoğaltma deneyleri arasında karşılaştırın. Mutant karşılaştırmak için istatistiksel analiz yapın ve kontrol öğrenci t-test kullanarak anlamına gelir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sıvı ortamdaki C. elegans locomotor aktivitesinin analizi, katı medyada kolayca ölçülemeyecek mitokondriyal hastalık solucan modellerinin entegre bir fenotipini kolayca yakalayabilir. ZebraLab, L4 larva aşamasında sıvı ortamda WTworms göre iyi kurulmuş mitokondriyal kompleks I hastalığı gaz-1(fc21) suşunun lokomotor aktivitesini ölçmek için kullanılmıştır. Tek bir sıvı damlasında 5 solucanın aktivitesi 1 dakika boyunca kaydedildi ve her suş için toplam 19 video (teknik çoğaltma) kaydedildi ve b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, çalışma, C. elegans nöromüsküler aktivitesini solucan hırpalama, locomotion, farengeal pompalama ve kemotaksi de dahil olmak üzere çeşitli sonuçlar düzeyinde incelemek için ayrıntılı bilgileri ve gerekçeleri özetlemiştir. 16 farklı aktivite analizi metodolojisinin karşılaştırılması, farklı yaş ve deneysel sürelerde tek bir solucan veya solucan popülasyonunda nematod aktivitelerini ölçmenin göreli verimi, avantajları ve sınırlamaları açısından gerçek gerçekleştirildi. Bunlar arasında, L4 larva gelişim aşa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

M.L., N.D.M., N.S., ve E.N.-O. ilgili finansal açıklamaları yoktur. M.J.F., MitoCUREia, Inc.'in kurucu ortağı, RiboNova, Inc.'de özkaynak ilgisi olan bilimsel danışma kurulu üyesi ve Khondrion ve Larimar Therapeutics'te ücretli danışman olarak bilimsel yönetim kurulu üyesidir. M.J.F. daha önce mitokondriyal hastalık terapötik preklinik ve/veya klinik aşama geliştirme çalışmaları yapan çeşitli şirketlerle ücretli danışman olarak (Astellas [eski adıyla Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) ve/veya sponsorlu bir araştırma işbirlikçisi (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics ve Stealth BioTherapeutics).

Teşekkürler

Bu projenin erken hazırlanması için organizasyon desteğiyle doktoralı Anthony Rosner'a ve protokol analizine katkıda bulunan Erin Haus'a minnettarız. Bu çalışma Juliet's Cure FBXL4 Mitokondriyal Hastalık Araştırma Fonu, Jaxson Flynt C12ORF65 Araştırma Fonu ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 ve T32-NS007413) tarafından finanse edildi. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka fon sağlayıcıların veya Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C. elegans yabani izolat  Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)N2 Bristol
KameraOlympusDP73
gaz-1(fc-21)CGCCW152
Mikroskop slaytlarıThermoFisher4951PLUS
Nematod Büyüme Ortamı (NGM)Research Products International Corp.N81800-1000.0
OP50 Escherichia coliCGCUrasil oksotrof, E. coli suşu,
Petri kapları (60 mm)  VWR uluslararası25373-085
S. BazalVWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4 ve 5 mg kolesterol, 1 l H2O VWR101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
TarayıcıEPSONV800
StereomikroskopOlympusMVX10 mikroskop
96 kuyulu düz tabanlı  VWR uluslararası29442-056
WormScan yazılımıMathew et al. 45S1 Bağımsız Java platformuTaranan plakaların fark görüntüsünün otomasyonu için yazılım
ZebraLab yazılımıViewPointYazılımı ve burada C. elegans'a uygulanır. Bu sistem, yüksek verimli davranış analizi için geçerlidir
(http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) tarafından tasarlanan, zebra balığı davranışının otomatik nicelleştirilmesi ve izlenmesi için ViewPoint

Kaynaklar

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085(2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027(2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321(2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12(2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898(2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221(2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561(2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059(2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483(2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058(2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938(2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mitokondriyal Hastalık ModelleriLokomotor AktiviteSolucan Davranış Analiziİlaç TaramaZebraLab YazılımıWormScan YöntemiSıvı Ortam AnaliziStereomikroskop TekniğiYüksek Kapasiteli Tarama
Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.