Yöntem makalesi

Santral Sinir Sistemi Metastazının Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Kurulması ve Kullanılması

4.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62264

⸱

7 Mayıs 2021

 , 
1Department of Translational Genomics, Keck School of Medicine, University of Southern California

Bu makalede

Özet

Santral sinir sistemi metastazı PDX modelleri, insan metastazının fenotipik ve moleküler özelliklerini temsil eder ve bu da onları klinik öncesi çalışmalar için mükemmel modeller haline getirir. Burada PDX modellerinin nasıl oluşturulacağı ve klinik öncesi çalışmalar için en iyi kullanılan aşılama yolları açıklanmaktadır.

Özet

Merkezi sinir sistemi (MSS) metastazı için yeni tedavilerin geliştirilmesi, hastalığı doğru bir şekilde temsil eden preklinik modellerin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. CNS metastazının hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modellerinin, insan hastalığının fenotipik ve moleküler özelliklerini daha iyi temsil ettiği ve aynı zamanda insan hasta tümörlerinin heterojenliğini ve klonal dinamiklerini tarihsel hücre hattı modellerine kıyasla daha iyi yansıttığı gösterilmiştir. Preklinik çalışmalar kurarken hasta kaynaklı dokuyu implante etmek için kullanılabilecek, her biri kendi avantaj ve dezavantajlarına sahip olan ve her biri metastatik kaskadın farklı yönlerini incelemek için uygun olan birden fazla bölge vardır. Burada protokol, PDX modellerinin nasıl oluşturulacağını ve CNS metastazı PDX modellerinin klinik öncesi çalışmalarda kullanılması için üç farklı yaklaşımın nasıl sunulacağını, uygulamalarının ve sınırlamalarının her birinin tartışılmasını açıklamaktadır. Bunlar arasında yan implantasyon, beyinde ortotopik enjeksiyon ve intrakardiyak enjeksiyon bulunur. Subkutan yan implantasyon, izlenmesi en kolay olanıdır ve bu nedenle klinik öncesi çalışmalar için en uygun olanıdır. Ek olarak, yan implantasyondan beyne ve diğer dokulara metastazlar gözlendi, bu da tümörün intravazasyon, ekstravazasyon ve kolonizasyon dahil olmak üzere birçok metastaz adımından geçtiğini gösterdi. Beyindeki ortotopik enjeksiyon, beyin tümörü mikroçevresini özetlemek için en iyi seçenektir ve biyolojiklerin kan-beyin bariyerini (BBB) geçme etkinliğini belirlemek için yararlıdır, ancak metastatik kaskadın çoğu adımını atlar. İntrakardiyak enjeksiyon beyne metastazı kolaylaştırır ve ayrıca organ tropizmini incelemek için de yararlıdır. Bu yöntem metastatik kaskadın daha önceki adımlarından vazgeçerken, bu hücreler hala dolaşımda hayatta kalmak, ekstravazasyon yapmak ve kolonize olmak zorunda kalacaklar. Bu nedenle, bir PDX modelinin faydası, tümör aşılama yolundan etkilenir ve hangisinin kullanılacağının seçimi, bilimsel soru ve deneyin genel hedefleri tarafından belirlenmelidir.

Giriş

Santral sinir sistemine (SSS) metastaz insidansı son yıllarda artmıştır 1,2,3. Tümör rezeksiyonu, tüm beyin radyoterapisi ve stereotaktik radyocerrahi gibi CNS metastazı için geleneksel tedaviler büyük ölçüde palyatif ve nadiren iyileştirici olmuştur ve bilişsel bozulma gibi zayıflatıcı yan etkilere yol açabilir1. Son zamanlarda, CNS metastazlarının tedavisi için, daha az yan etkiye sahipken, daha etkili tedaviler olma konusunda umut vaat eden birçok yeni hedefe yönelik ve immünolojik tedavi geliştirilmektedir4.

Preklinik sonuçları anlamlı klinik sonlanım noktalarına çevirmek genellikle etkili ve tahmine dayalı modelleme stratejileri gerektirir. Tarihsel olarak, hücre hattı ksenograft modelleri, CNS metastazı araştırmalarında klinik öncesi araştırmalar için standarttı. Bununla birlikte, bu hücre hattı modelleri, konakçı tümörün gerçek tümör davranışını yansıtmaz veya hastalığın histolojik veya moleküler heterojenitesini temsil etmez. Ayrıca, hücre hattı modelleri in vitro büyüme koşullarına uyum sağlayabilir ve bu nedenle konakçı tümörün orijinal özelliklerini kaybedebilir. Bir hastanın tümörünü immün yetmezlikli veya insanlaştırılmış bir fareye aşılayan hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX'ler), translasyonel kanser araştırmalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır. Araştırmacılar, PDX modellerinin genellikle tümör büyümesini, histolojik özellikleri, tümör heterojenitesini, metastatik potansiyelini ve moleküler genetik özelliklerini koruyabildiğini göstermiştir. Ek olarak, PDX modelleri prognostiktir, bu sayede PDX tümör gecikme süresi hastanın genel sağkalımı ile ilişkilidir ve ayrıca hasta çalışmalarında terapötik yanıtı doğru bir şekilde öngördükleri gösterilmiştir 5,6.

Çoğunlukla, bunlar küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC)7, meme kanseri8,9 ve melanom 10,11 gibi tek bir kökenden kaynaklanan tümörleri temsil eden tümörleri temsil eden geliştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, sekiz farklı histolojik alt tipi temsil eden geniş ve çeşitli PDX modelleri koleksiyonu geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir12. SSS metastazı için PDX modellerinin hem histolojik hem de moleküler olarak orijinal hasta tümörlerine çok benzediği ve ayrıca histolojik benzersiz farklılıklar ve benzerlikler gösterdiği gösterilmiştir10,12. Ayrıca, çoğu CNS metastazı PDX modeli, insan tümörlerinin klonal heterojenitesini korurken, bazıları klonal ardışık12 kanıtı göstermiş ve bu da onları tedaviden sonra klonal değişiklikleri izleyerek tedavilere direnci incelemek için ideal hale getirmiştir.

Burada açıklanan protokoller, PDX oluşturma yöntemlerini ve CNS metastazının klinik öncesi çalışmalarında kullanılan çeşitli aşılama yollarını özetlemektedir (Şekil 1). Bu implantasyon yöntemleri, büyüme ve metastazı taklit etme yeteneklerine göre değişir. Burada, protokol her implantasyon yolu için uygulamaları vurgulamakta ve CNS metastazının incelenmesi için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Protokol

Aşağıdakiler, hem deri altı kanat implantasyonu ile PDX modellerinin oluşturulması hem de biyolojik değişikliklerin ve metastatik kaskadın çeşitli adımlarının değerlendirilmesine yardımcı olabilecek tedavilerin test edilmesini sağlayan preklinik çalışmaların kurulması için kullanılan bir dizi adım adım protokoldür. Tüm çalışmalar ve modeller 3-8 haftalık dişi NOG fareleri kullandı. Tüm doku örnekleri, Kurumsal Gözden Geçirme Kurulu (IRB) tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak bilgilendirilmiş onam altında toplanmıştır. Tüm hayvan deneyleri, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) onaylı bir protokole uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. PDX modellerinin yan implantasyon ile oluşturulması ve çoğaltılması

  1. PDX modellerinin oluşturulması
    1. Ameliyathanede hastadan tümörün cerrahi rezeksiyonunu takiben, taze tümör dokularını uygun bir solüsyonda (DMEM gibi) saklayın ve hemen buz üzerine yerleştirin. Dokunun tamamen suya batırıldığından emin olmak için fazla miktarda depolama çözeltisi (>10 mL) kullanın.
    2. Dokuyu doku kültürü kabına aktarın ve 5 mL DPBS ile durulayın.
      NOT: Bu adım, aseptik teknikler kullanılarak bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Olası insan bulaşıcı ajanlarına karşı korunmak için uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilerek önlemler alınmalıdır.
    3. Nekrotik bölgeleri tümörden çıkarın.
      NOT: Bu, dokunun merkezine doğru beyaz yumuşak bir bölge olarak tanınabilir.
    4. Kalan dokuyu yaklaşık 2 x 2 x 2 mm parçalara ayırın.
    5. Dokuları, büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisini içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde saklayın. Her doku parçasını tamamen suya batırmak için yeterli bazal membran matrisinin (>200 μL) kullanıldığından emin olun.
    6. Adım 1.3'te açıklanan protokole göre implante edilmeyecek kalan dokuları kriyoprotekte edin.
    7. Hayvanı% 2-5 izofluran ve oksijen içeren bir indüksiyon odasında uyuşturun. Anestezi uygulandıktan sonra, anesteziyi sürekli oksijen kaynağı ile% 1.5-2.5 izofluranda tutmak için hayvanı bir burun konisine aktarın. Pedal refleksi eksikliği ile anestezi derinliğini onaylayın. Ameliyat sırasında göz kuruluğunu önlemek için veteriner oftalmik merhemi uygulayın. Hayvan iyileşene kadar prosedür boyunca hayvana termal destek sağlayın.
    8. Fare üzerindeki implantasyon bölgesini tanımlayın.
      NOT: Bu, farenin sağ veya sol kanadında, genellikle karın bölgesinin yan tarafında yanal olarak işaretlenmiş, göğüs kafesine kaudal olmalıdır.
    9. Cerrahi alanı hazırlamak için kürkü tıraş edin ve üç alternatif povidon iyot ve% 70 etanol ovma ile dezenfekte edin.
    10. Forseps kullanarak, farenin derisini kaldırın ve cilt üzerinde 0,5-1 cm'lik bir kesi yapın.
    11. Deri altı boşluğunda bir cep (0.5-1 cm derinliğinde) oluşturmak için kesi yerinde cildin altına yavaşça bir çift cerrahi makas yerleştirin.
    12. Bir tümör parçasını dikkatlice cebe yerleştirin ve itin, tümörün kaymasını önlemek için cebin altına itin.
    13. 4-0 naylon cerrahi dikiş kullanarak kesiyi kapatın.
      NOT: Emilemeyen veya emilemeyen dikişler ve yara klipsleri gibi diğer yara kapatma yöntemleri de kullanılabilir.
    14. Fareyi kafese geri aktarın ve hayvanın anesteziden iyileşmesini, ambulatuar olana kadar izleyin.
      NOT: Analjezikler gerekli değildir, ancak farelerde ağrı gözlenirse uygulanabilir.
    15. Tümör büyümesini haftalık olarak izleyin. Fare başına bir tümör beklenir.
      NOT: Tümörün transplantasyondaki hacmi başlangıçta azalmış gibi görünecektir, ancak bu endişe nedeni değildir. Bir tümörün elle tutulur hale geldiğinde ve logaritmik bir büyüme fazına girdiğinde aldığı kabul edilir. Bu ilk pasaj F0 neslini temsil ediyor.
    16. Tümörler büyümeye başladığında, tümörleri haftada üç kez ölçün. Tümörlerin uzunluğunu ve genişliğini bir kumpas ile ölçün. Tümörün hacmini hesaplamak için şu formülü kullanın: uzunluk x genişlik x genişlik / 2.
    17. PDX tümörleri ile implante edilen fareleri, tümörün en uzun tarafını kullanarak tümörlerin çapı 15 mm'den büyük olduğunda ötenazi yapın. Ötanaziyi bir CO2 indüksiyon odasında CO2 inhalasyonu ile gerçekleştirin, ardından ikincil bir yöntem olarak servikal çıkığı izleyin.
    18. Bir kesi yaparak tümörü hayvanın kanadından rezeke edin. Eksize edilen tümörü künt makas ve forsepslerle nazikçe diseke edin. Bunu yapmak için, önce tümörün üstündeki cildi kesin, sonra tümörü altındaki kas tabakasından uzaklaştırın.
    19. Tümör dokusunu uygun bir depolama çözeltisinin >10 mL'sine (DMEM gibi) aktarın. Hemen buzun üzerine yerleştirin. Bu tümör kriyokorunabilir veya başka bir fare grubuna geçirilebilir. Bu pasajı F1 olarak düşünün.
      NOT: Tekrar geçiş, tümör geçişini F2 vb. Yapar.
  2. PDX modellerinin yayılması
    1. Adım 1.1.19'dan itibaren depolama solüsyonunda tutulan rezeke edilmiş tümör ile başlayın.
    2. Dokuyu bir doku kültürü kabına aktarın ve 5 mL DPBS ile durulayın.
    3. Nekrotik bölgeleri tümörden çıkarın.
    4. Dokuyu yaklaşık 2 x 2 x 2 mm parçalara ayırın.
    5. Dokuları, büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi (>200 μL) içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde saklayın.
    6. Adım 1.3'te açıklanan protokole göre yayılma için kullanılmayan kalan dokuyu kriyoprotekte edin.
    7. Hayvanı% 2-5 izofluran ve oksijen içeren bir indüksiyon odasında uyuşturun. Anestezi uygulandıktan sonra, anesteziyi sürekli oksijen kaynağı ile% 1.5-2.5 izofluranda tutmak için hayvanı bir burun konisine aktarın. Pedal refleksi eksikliği ile anestezi derinliğini onaylayın. Ameliyat sırasında göz kuruluğunu önlemek için veteriner oftalmik merhemi uygulayın. Hayvan iyileşene kadar prosedür boyunca hayvana termal destek sağlayın.
    8. Fare üzerindeki implantasyon bölgesini tanımlayın.
      NOT: Bu, farenin sağ veya sol kanadında, genellikle karın bölgesinde, göğüs kafesine kaudal olmalıdır.
    9. Cerrahi alanı hazırlamak için kürkü tıraş edin ve üç alternatif povidon iyot ve% 70 etanol ovma ile dezenfekte edin.
    10. Farenin bir kanadında 0,5-1 cm'lik bir kesi yapın.
    11. Deri altı boşluğunda bir cep (0.5-1 cm derinliğinde) oluşturmak için insizyonda derinin altına yavaşça bir çift cerrahi makas yerleştirin.
    12. Bir tümör parçasını dikkatlice cebe yerleştirin ve tümörün kaymasını önlemek için cebin altına doğru itin.
    13. Kesi 4-0 naylon cerrahi dikişler veya diğer yara kapatma yöntemlerini kullanarak kapatın.
    14. Fareyi kafese geri aktarın ve ambulatuar olana kadar anesteziden iyileşmesini izleyin.
      NOT: Analjezikler gerekli değildir, ancak farelerde ağrı gözlenirse uygulanabilir.
    15. Gecikme sırasında (büyüme olmayan faz), tümör büyümesini haftalık olarak izleyin. Fare başına bir tümör beklenir.
      NOT: Tümörün transplantasyondaki hacmi başlangıçta azalmış gibi görünecektir, ancak bu endişe nedeni değildir. Bir tümörün elle tutulur hale geldiğinde ve sürekli büyümeye başladığında alındığı düşünülür.
    16. Tümörler büyümeye başladığında, tümörleri haftada üç kez ölçün. Tümörlerin uzunluğunu ve genişliğini bir kumpas ile ölçün. Formülü kullanarak tümörün hacmini hesaplayın: uzunluk x genişlik x genişlik / 2.
    17. PDX tümörleri ile implante edilen fareleri, tümörün en uzun tarafını kullanarak tümörlerin çapı 15 mm'den büyük olduğunda ötenazi yapın. Bir CO2 indüksiyon odasında CO2 inhalasyonu ile ötenazi uygulayın, ardından ikincil bir yöntem olarak servikal çıkık uygulayın.
    18. Bir kesi yaparak ve tümörü künt makas ve forsepslerle nazikçe diseke ederek tümörü hayvanın yanından rezeke edin.
    19. Tümör dokusunu uygun bir depolama çözeltisinin >10 mL'sine (DMEM gibi) aktarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin.
  3. PDX tümörlerinin kriyoprezervasyonu
    1. PDX tümörleri ile implante edilen fareleri, tümörün en uzun tarafını kullanarak tümörlerin çapı 15 mm'den büyük olduğunda ötenazi yapın. Bir CO2 indüksiyon odasında CO2 inhalasyonu ile ötenazi uygulayın, ardından ikincil bir yöntem olarak servikal çıkık uygulayın.
    2. Bir kesi yaparak ve tümörü künt makas ve forsepslerle nazikçe diseke ederek tümörü hayvanın yanından rezeke edin.
    3. Tümör dokusunu uygun bir depolama çözeltisinin >10 mL'sine (DMEM gibi) aktarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin.
    4. Dokuyu bir doku kültürü kabına aktarın ve 5 mL DPBS ile durulayın.
    5. Nekrotik bölgeleri tümörden çıkarın.
    6. Dokuyu yaklaşık 2 x 2 x 2 mm parçalara ayırın.
    7. Dokuyu% 20 DMEM,% 70 FBS ve% 10 DMSO içeren kriyotüplere aktarın.
    8. Kriyotüpleri bir kriyoprezervasyon kabına aktarın ve -80 ° C'lik bir dondurucuya koyun.
    9. Kriyotüpler -80 ° C'ye soğutulduğunda, bunları sıvı azot deposuna aktarın.

2. Preklinik çalışmalar için aşılama yolları

  1. Subkutan kanat implantasyonu.
    NOT: Subkutan kanat implantasyonu kolaylık sağlamak için kullanılabilir ve metastatik kaskadın tüm adımlarını incelemek için yararlı olabilir.
    1. İlk yan implantasyonu için büyüyen PDX tümörleri veya kriyokorunmuş PDX tümörleri kullanın.
    2. Büyüyen PDX tümörleri için, tümörler 15 mm'den büyük olduğunda IACUC onaylı bir yöntem kullanarak fareleri ötenazi yapın; tümörü rezeke edin ve tümör dokusunu uygun bir depolama çözeltisine (DMEM gibi) aktarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin.
    3. Kriyokorunmuş PDX tümörleri için, kriyokorunmuş PDX dokusunu 37 ° C su banyosuna daldırarak hızlı bir şekilde çözün.
    4. 1.2.2-1.2.19 adımlarını izleyin.
  2. Beyne intrakraniyal enjeksiyon ile ortotopik implantasyon.
    NOT: Bu model, ilaçların BBB'yi geçme etkinliğini test etmek ve tümör kolonizasyonunu incelemek için kullanılabilir. Bu bölüm öncelikle tümör ayrışma kitinin kullanımına atıfta bulunmaktadır (bkz. Malzeme Tablosu). Farklı doku tipleri farklı ayrışma protokolleri gerektirir. Ayrışma verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için kullanıcının protokolü test etmesi ve optimize etmesi önerilir.
    1. PDX tümörleri ile implante edilen fareleri, tümörler 15 mm'den büyük olduğunda IACUC onaylı bir yöntem kullanarak ötenazi yapın.
    2. Bir biyogüvenlik kabininde steril koşullar altında, PDX tümörlerini cerrahi olarak rezeke edin ve DDEM'de buz üzerinde saklayın.
    3. Enzim karışımını üreticinin protokolünde belirtildiği gibi DDEM'ye ekleyerek ayrışma çözeltisini uygun tüpte hazırlayın.
    4. Tümörü bir doku kültürü kabında 5 mL DPBS'de yıkayın.
    5. Nekrotik bölgeleri tümörden çıkarın.
    6. Tümörü 2-4 mm uzunluğunda küçük parçalara ayırın.
    7. Tümör parçalarını enzim karışımını içeren tüpe aktarın.
    8. Tüpü doku ayrıştırıcısına takın ve doku tipine uygun programı çalıştırın. Uygun programın çalışması ve gereken ayrışma süresi için üreticinin protokolüne başvurun.
    9. Programın tamamlanmasından sonra, hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
    10. Hücre süzgecini 20 mL DMEM ile yıkayın.
    11. Ayrışmış hücreleri 7 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin.
    12. Süpernatantı aspire edin ve DPBS'deki hücreleri yeniden askıya alın.
    13. Hücreleri sayın ve gerekli konsantrasyona seyreltin.
    14. Stereotaksik çerçeveyi üreticinin talimatlarına göre ayarlayın ve fareler için bir ısıtma yastığı hazırlayın. Tüm alanları% 70 etanol ile sterilize edin.
    15. Hayvanı% 2-5 izofluran ve oksijen içeren bir indüksiyon odasında uyuşturun. Anestezi uygulandıktan sonra, anesteziyi sürekli oksijen kaynağı ile% 1.5-2.5 izofluranda tutmak için hayvanı bir burun konisine aktarın. Pedal refleksi eksikliği ile anestezi derinliğini onaylayın. Ameliyat sırasında göz kuruluğunu önlemek için veteriner oftalmik merhemi uygulayın. Hayvan iyileşene kadar prosedür boyunca hayvana termal destek sağlayın.
    16. Kafa derisini açığa çıkarmak için farenin kafasındaki kürkü tıraş ederek cerrahi alanı hazırlayın.
    17. Fareye, deri altı enjeksiyonu ile uygulanan bir doz 1 mg/kg Buprenorfin sürekli salınımı (SR) gibi uygun analjezik sağlayın.
    18. Fareyi stereotaksik çerçeveye aktarın. Farenin ısırık bloğunu ısırdığından emin olun. Farenin kafasını sıkıca sabitlemek için kulak çubuklarını kullanın.
      NOT: Forseps ile hafifçe itildiğinde kafa hareket etmezse fare düzgün bir şekilde sabitlenir.
    19. Tıraş edilen bölgeyi üç alternatif povidon-iyot ovma ve% 70 etanol ile dezenfekte edin.
    20. Kafatasını açığa çıkarmak ve kafa derisini geri çekmek için kafa derisinde 5-7 mm uzunlamasına bir kesi yapın.
    21. Periosteumü forseps gibi künt bir cerrahi aletle kazıyın.
    22. Kafatasındaki bregma'yı bulun.
    23. Stereotaktik çerçevenin iğnesini bregma'nın üstüne yerleştirin ve koordinatları 0'a sıfırlayın veya koldaki koordinatı not edin.
    24. Kolu orta çizginin sağında 1 mm posterior (kaudal) ve 1 mm lateral olarak hareket ettirin.
    25. Bu konumu kalıcı bir işaretleyiciyle işaretleyin. Kolda şırınga için bir yuva varsa, konumu işaretlemek için şırınga yuvasına bir işaretleyici takın.
    26. Bu yerde kafatasında küçük bir çapak deliği açın. Beyne delinmeyi önlemek için çok fazla baskı uygulamayın.
    27. 5-10 x 104 hücreli 5 μL, 26 G Hamilton şırıngasını 1-2 μL hacimde yükleyin ve stereotaksik kola takın.
    28. Hamilton şırınga iğnesini yavaşça 2 mm beyne yerleştirin.
    29. Hücreleri istenen hızda, genellikle 0.2-0.5 μL / dak enjekte etmeye başlayın.
    30. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, iğneyi beyinden yavaşça geri çekin.
    31. Çapak deliğini kemik mumu ile doldurun.
    32. Kesi cerrahi dikişler veya cerrahi yapıştırıcı ile kapatın.
    33. Fareyi kafese geri aktarın ve anesteziden iyileşmesini izleyin.
    34. Hayvanların durumunu düzenli olarak izleyin ve onaylanmış protokolde insancıl son nokta kriterlerine ulaşıldığında onları ötenazi yapın.
      NOT: Beyindeki başarılı tümör büyümesi, hayvanın durumunun kötüleşmesine neden olur, bu da genellikle baş eğikliği, kaba saç mantosu, kambur vücut, kısık gözler, azalmış aktivite ve düşük vücut kondisyon skoru ile kendini gösterir (BCS < 2).
    35. Ötanazi yapılan hayvanlar üzerinde bir nekropsi yapın, ardından beyindeki tümörlerin varlığını doğrulamak için histolojik analiz yapın. İmplantasyondan ötenaziye kadar geçen süreyi kaydedin.
  3. PDX modellerinin intrakardiyak enjeksiyon ile implantasyonu
    NOT: Bu model, tümör hücreleri dolaşıma girdikten sonra organ tropizmini incelemek için kullanılabilir. Bu bölüm ayrıca Tümör Dissosiyasyon Kitini kullanır ve doku tipine göre optimizasyon gerektirir.
    1. 2.2.1-2.2.13 adımlarını izleyin.
    2. Hayvanı% 2-5 izofluran ve oksijen içeren bir indüksiyon odasında uyuşturun. Anestezi uygulandıktan sonra, anesteziyi sürekli oksijen kaynağı ile% 1.5-2.5 izofluranda tutmak için hayvanı bir burun konisine aktarın. Pedal refleksi eksikliği ile anestezi derinliğini onaylayın. Ameliyat sırasında göz kuruluğunu önlemek için veteriner oftalmik merhemi uygulayın. Hayvan iyileşene kadar prosedür boyunca hayvana termal destek sağlayın.
    3. Ardından, fareyi sırtüstü pozisyonda konumlandırın.
    4. Göğüsteki cerrahi alanı hazırlamak için, kürkü tıraş edin ve üç alternatif povidon-iyot ve% 70 etanol ovma ile dezenfekte edin.
    5. 0.5-10 x 105 hücreyi, 100 μL'lik bir hacme kadar, 28 G'lik bir iğne üzerinde bir şırıngaya çizin.
      NOT: Gerekli hücre sayısı, modelin agresifliğine bağlı olarak değişir ve her model için en uygun hücre sayısı ampirik olarak belirlenmelidir.
    6. Enjeksiyon bölgesini bulun (farenin sternumunun biraz solunda ve sternal çentik ile ksifoid işlemin yarısı arasında).
    7. İğneyi enjeksiyon bölgesinde fareye dikey olarak yerleştirin.
    8. Şırıngaya giren kanın geri akışı yoluyla sol ventriküle başarılı bir şekilde girdiğini gözlemleyin. İğneyi hareket ettirmeden hücreleri yavaşça sol ventriküle dağıtın.
    9. İğneyi yavaşça fareden dikey olarak çekin.
    10. Enjeksiyon bölgesine bir parça steril gazlı bez uygulayın ve kanama durana kadar yaklaşık 1 dakika boyunca basınç uygulayın, aynı zamanda solunum için göğüs hareketine izin verin.
    11. Fareyi anesteziden çıkarın ve ısıtılmış bir ped üzerinde iyileşmesine izin verin.
      NOT: Başarılı tümör büyümesi, hayvanın durumunun kötüleşmesine neden olur, bu da genellikle karıştırılmış saç mantosu, kambur vücut, kısık gözler, azalmış aktivite ve düşük vücut kondisyon skoru ile kendini gösterir (BCS < 2).
    12. Hayvanların durumunu düzenli olarak izleyin ve onaylanmış protokolde insancıl son nokta kriterlerine ulaşıldığında onları ötenazi yapın.
    13. Ötanazi yapılan hayvanlarda metastazları tanımlamak için bir nekropsi yapın, ardından hedef organdaki tümörlerin varlığını doğrulamak için histolojik analiz yapın. İntrakardiyak enjeksiyondan ötenaziye kadar geçen süreyi kaydedin.

Sonuçlar

Kanatla yayılan PDX tümörleri implante edilmesi, izlenmesi ve rezeke edilmesi en kolay olanlardır ve genellikle PDX tümörlerinin ilk yerleşimi ve yayılımı için önerilir (Şekil 1). PDX tümörlerini oluştururken veya çoğaltırken, tümör alım hızı değişebileceğinden ve her tümör parçası her zaman fareleri almayacağından, tümörleri birden fazla hayvana implante etmek akıllıca olacaktır. CNS metastazı PDX'lerinin doğrudan beyinde kurulması ve çoğaltılması için yöntemler geliştirilmiştir13. Bununla birlikte, bu yöntemler daha düşük alım oranları ile hala daha zordur ve tümörlerin yayılması ve izlenmesi yan implantasyondan önemli ölçüde daha zordur.

Hasta tümörleri kolayca bulunamıyorsa, CNS metastazı PDX tümörleri, akademik laboratuvarların veya ticari şirketlerin depoları da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan da elde edilebilir. Tümörleri elde ettikten sonra, ilk öncelik, çok sayıda düşük pasajlı tümörün korunmasını sağlamak için mümkün olduğunca fazla materyali çoğaltmak ve kriyoproteksiyon yapmak olacaktır. Bu, PDX modelleriyle belirsiz sayıda sonraki çalışma için yeterli malzemenin mevcut olmasını sağlar. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları gibi, PDX tümörleri de kriyokorunmalı ve düşük geçiş sayılarında kullanılmalıdır, çünkü genetik sürüklenme zamanla PDX'lerin fenotipinde ve genotipinde değişikliklere neden olur12,14,15. PDX tümörlerinin kaynağından bağımsız olarak, insanlar için HIV ve hepatit ve fareler için Corynebacterium bovis gibi hem insan hem de fare patojenleri için PDX ve fare kolonilerinin sık sık taranması önemlidir. Bu, istenmeyen patojenlerin PDX'ten yayılmasını hem onları ele alan kişiye hem de çalışmadaki ve vivaryumdaki diğer farelere sınırlayacaktır.

Burada açıklanan implantasyon yöntemleri, tümör biyolojisini incelemek, metastatik kaskadın birçok yönünü değerlendirmek ve klinik öncesi çalışmalar için kullanılabilir. Kanat implantasyonunun temel avantajı, tümörler görünür olduğu için zaman içinde tümör izlemenin kolaylığıdır ve büyümesi bir kumpas kullanılarak kolayca ölçülebilir. Bu yöntem, bir ilaç hedefinin fizibilitesini belirlemek için başlamak için iyi bir yer olabilir. İntrakraniyal implantasyon, beyin mikroçevresinin varlığı önemliyse ve tümörün büyümesini veya moleküler profilini değiştirebiliyorsa tercih edilir. Ek olarak, intrakraniyal implantasyon, tümörü kan beyin bariyerinin (BBB) arkasına yerleştirir ve BBB'yi geçmek için gereken ilaçların etkinliğini inceleyen klinik öncesi çalışmalar için gerekli kılar. Bununla birlikte, PDX tümörlerinin büyümesini izlemek zordur ve hücreler etiketlenmişse radyolojik görüntüleme veya biyolüminesan görüntüleme gerektirir. İlaç tedavisine preklinik olarak ne zaman başlanacağını bilmek, büyümeyi izlemek için görüntüleme verilerini veya belirli bir PDX tümörü taşıyan farelerin ortalama sağkalım bilgilerini gerektirir. Ayrıca, intrakraniyal implantasyon, metastatik kaskadın tüm temel adımlarını atlar, bu da onu sadece beyindeki ilaç etkinliğini ve tümör mikroçevresini incelemek için uygun hale getirir. Tümör mikroortamındaki farklılıklara rağmen, PDX tümörlerinin morfolojisi, küçük hücreli akciğer kanseri primer tümöründen kaynaklanan bir beyin metastazından türetilen bu PDX tümöründe (CM04) görülebileceği gibi, implantasyon bölgesinden bağımsız olarak benzerdir (Şekil 2). Küçük çekirdekli ve yetersiz sitoplazmaya sahip tümör hücrelerinin küçük hücreli akciğer kanseri morfolojisi yan tümör, intrakraniyal tümör ve intrakardiyak enjeksiyona bağlı abdominal metastazlarda görülebilir. Ayrıca, kanatta implante edilen tümörlerden spontan metastaz daha önce gözlenmiştir12, bu da intravazasyon, ekstravazasyon ve kolonizasyon gibi metastatik süreçlerin, beyindeki ortotopik tümörlerle aksi takdirde mümkün olmayacak olan yan tümörlerde özetlenebileceğini ve çalışılabileceğini düşündürmektedir. Genel olarak, yan implantasyonunun CNS metastaz biyolojisini incelemek ve klinik öncesi çalışmalar yapmak için uygun bir yöntem olduğu gözlenmiştir.

İntrakardiyak enjeksiyon en sık organ tropizmini ve tümörlerin metastatik potansiyelini incelemek için kullanılır. Enjekte edilen tümör hücreleri, hayatta kalan dolaşım, ekstravazasyon ve metastatik bölgenin kolonizasyonu dahil olmak üzere metastatik kaskadın birkaç adımından geçmek zorunda kalacaktır. Beyne ortotopik enjeksiyon gibi, radyolojik görüntüleme veya hücre etiketleme olmadan tümör metastazının ilerlemesini izlemek zor olabilir. Bununla birlikte, ortotopik implantasyonda olduğu gibi, başarılı aşılama, tümör yayıldıkça zamanla hayvanların durumunun bozulmasına neden olur. Şekil 3A , bir melanomdan kaynaklanan CNS metastazı PDX modelinde, M2'de intrakardiyak enjeksiyondan sonra beyne metastazı göstermektedir. PDX tümörünün (CM04) intrakardiyak enjeksiyonu karın boşluğuna ve karaciğere metastaz ile sonuçlandı (Şekil 3B). Akciğer, böbrek ve yumurtalıklar gibi değerlendirilen diğer organların görünür metastazı yoktu.

figure-results-1
Şekil 1: Klinik öncesi çalışmalar için PDX'in kurulması, yayılması ve kullanılmasının genel iş akışını gösteren akış şeması. Her aşılama yöntemi için, ilgili metastatik kaskadın adımları her yöntemin altında listelenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Farklı aşılama yöntemleri izlenerek PDX tümörlerinin histolojisi. İmmün sistemi baskılanmış farelere üç yöntemle implante edilen küçük hücreli akciğer kanserinden (CM04) köken alan bir CNS metastazı PDX tümörünün hematoksilin ve eozin (H&E) boyaması, küçük çekirdekli ve yetersiz sitoplazma ile küçük hücreli akciğer kanserlerinin benzer tümör patohistolojik ve morfolojik özelliklerine sahiptir. İntrakardiyak enjeksiyon paneli abdominal metastaz gösterir. Küçük boyutlu hücrelerin yuvaları ve yüksek nükleer-sitoplazmik oran her üç görüntüde de belirgindir. Görüntüler bir slayt tarayıcıda çekildi ve 10x'e kadar büyütüldü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İntrakardiyak enjeksiyon sonrası gözlenen metastazlar. (A) M2 ve (B) CM04 intrakardiyak enjeksiyonu sonrası nekropsi ile değerlendirme sırasında görünür metastazı olan dokuların H&E boyaması. Görüntüler (A) bir slayt tarayıcıda alındı ve 10x büyütmede normal bir mikroskopta 1x (sol) veya 20x (sağ) veya (B) olarak büyütüldü. Bu rakam önceki yayınımız12'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu yazıda PDX'in kurulması ve yaygınlaştırılması için yöntemler ayrıntılı olarak ele alınmıştır. CNS metastazını değerlendirirken preklinik çalışmaların kurulmasında kullanılabilecek üç farklı aşılama yöntemi de gösterilmiştir. Seçim yöntemi, deneyin hedeflerine bağlı olmalıdır. Bazı durumlarda birden fazla aşılama yolu kullanılması faydalı olacaktır. Örneğin, deri altı yan implantasyonu, bir ilacın tümör büyümesi üzerindeki etkinliğini incelemek ve ilacı hedefinde değerlendirmek için basit bir yaklaşım sağlar ve ayrıca kolayca izlenen ve ölçülen tümör boyutu için bir görsel sağlar. Bununla birlikte, hedef fizibilite ve anti-tümör büyüme özellikleri belirlendikten sonra, biyolojinin BBB'yi geçme etkinliğini değerlendirmek ve beyin tümörü mikroçevresi içindeki etkisini incelemek için ortotopik bir çalışma başlatılabilir. Ayrıca, sağkalım ortotopik ve intrakardiyak enjeksiyon çalışmalarında daha iyi değerlendirilmektedir.

Beyin metastazı PDX modellerinin intrakraniyal enjeksiyonu, beyin mikroçevresinin ve BBB'nin varlığı nedeniyle sıklıkla tercih edilen preklinik modeldir. Bununla birlikte, çalışmalar beyin metastazlarının, moleküllerin tümöre geçirgenliğini etkileyen BBB'yi modifiye etme yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir16. BBB'deki bu değişiklikler intrakraniyal implante tümörler tarafından yansıtılmayacaktır ve bu nedenle preklinik ilaç çalışmaları hasta tümörlerinin yanıtını tam olarak yansıtmayabilir. Bu uyarıyla bile, intrakraniyal enjeksiyon, preklinik modellerde BBB'yi geçmek için ilaçların geçirgenliğini ve etkinliğini test etmek için en iyi yöntem olmaya devam etmektedir. İntrakraniyal modellerle ilgili bir diğer zorluk, tümör büyümesini izlemek için zor olmaları ve görüntüleme tekniklerinin kullanılmasını gerektirmeleridir. PDX'lerin floresan veya biyolüminesan belirteçlerle viral transdüksiyonu geleneksel olarak kullanılmıştır, ancak gerçekleştirilmesi zor olabilir. Bununla birlikte, belirteçlerin kullanılmasını gerektirmeyen farelerde kullanılmak üzere çeşitli görüntüleme teknikleri geliştirilmektedir, bu da klinik öncesi çalışmalar için bu ortotopik beyin tümörlerinin izlenmesinin kolaylığını artırabilir. Bunlar arasında manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme ve mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) gibi görüntüleme teknolojileri bulunmaktadır. Son olarak, kafa içi enjeksiyon, leptomeningeal metastazda olduğu gibi, beynin dışındaki CNS metastazlarının mikro ortamını doğru bir şekilde yansıtmayabilir. Bu durumda, leptomeningeal metastazları daha doğru bir şekilde temsil etmek için cisterna magna'ya enjeksiyon yapılabilir17.

PDX modelinin hem fenotipik hem de moleküler özelliklerinin karakterizasyonu, klinik öncesi çalışmalar için en iyi modellerin seçilmesinde önemlidir. Tümör gecikmesi 7-140 gün arasında değişebilir ve alım oranları da oldukça değişkenolabilir 12. İmplant edilecek en uygun hayvan sayısı ve tedaviye başlama zamanlaması, her PDX modelinin özelliklerine dayanmalı ve ampirik olarak belirlenmelidir. Ayrıca, PDX tümörlerinin moleküler profili, preklinik çalışmalar için en temsili PDX modellerinin seçimi için de önemlidir. Model moleküler olarak donör dokuyu ne kadar yakın temsil ederse, klinik yanıtın o kadar öngörücü olması muhtemeldir. Ayrıca, insan verilerinden seçilen hedeflerin, çalışmalar için seçilen PDX'lerde mevcut olmasını ve klonal ardıllığın, görevdeki baskın klonun farklı bir genomik profili ile ilişkili olduğu gösterildiği gibi, birkaç nesil boyunca sürdürülmesini sağlamak çok önemlidir. Bunun ışığında, CNS metastazı PDX tümörlerinin fenotipik ve moleküler profilleri, çoklu nesiller boyunca kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir12.

CNS metastazı PDX modellerini kullanmanın birçok avantajına rağmen, kullanımlarıyla ilgili çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, alternatif bir tümör mikroçevresi ve özellikle bir bağışıklık sisteminin eksikliği, PDX modellerinin iyi belgelenmiş sınırlamalarıdır18. Bir insan tümörünün farelere ksenogrefti, insan stromasının sonraki her pasajda fare stroması ile değiştirilmesine neden olur ve insan stroması genellikle birkaç pasajdan sonra tamamen değiştirilir19. Bununla birlikte, tümör mikroortamındaki farklılıklar, orijinal hasta tümörü12'ye kıyasla kanat implante PDX tümörlerinin moleküler profilinde büyük farklılıklara neden olmamakta, bu da yan modellerin CNS metastazını incelemek için hala iyi deneysel modelleri temsil ettiğini göstermektedir. İkincisi, bağışıklık sistemi baskılanmış hayvanların kullanımı, tümörde bağışıklık hücresi infiltrasyonu eksikliği ve konakçı tarafından genel bir bağışıklık tepkisi ile sonuçlanır ve konakçının kanser büyümesiyle mücadele etmeye çalıştığı temel bir yolu sınırlar12. İnsan bağışıklık hücreleri ile aşılanmış insanlaştırılmış fareler, spesifik bağışıklık hücrelerinin tümörle etkileşimlerini incelemek için mevcut olsa da, bu sonuçların yaklaşımları, yöntemleri ve yorumlanması hakkında hala birçok soru ve tartışma vardır20.

PDX'lerin çoğunluğunun genetik olarak stabil olduğu gösterilmiş olsa da, biz ve diğerleri, nadir durumlarda, tedavilerin veya diğer dış seçici basınçların yokluğunda bile, tümörlerin klonlarında, minör klon devralma12,14,15 gibi değişiklikler olabileceğini göstermiştir. Bu, moleküler profilde dramatik değişikliklere neden olabilir, bu da sonuçta tümörün hasta tümöründeki baskın klonları yansıtmamasına neden olur12. Klonal ardıllık gösteren PDX'ler klinik öncesi çalışmalarda kullanılabilirken, hedeflemeye yönelik birçok gen (örneğin, Her2) klonal ardıllık ile kaybolabilir. Bu nedenle, istenen klonun moleküler profilini hala koruyup korumadıklarını belirlemek için PDX modellerinin sık sık taranması teşvik edilir.

Özetle, PDX modelleri sadece CNS metastazlarının değil, diğer tümör tiplerinin de incelenmesi için mükemmel bir model sistemini temsil etmektedir. Bu modellerin geliştirilmesi, insan CNS metastazının fenotipik, moleküler profilini ve heterojenliğini büyük ölçüde yansıttığını göstermiştir 8,9,10,12. Hem CNS metastaz biyolojisini incelemek için etkili modeller olarak hizmet ederler hem de tarihsel olarak CNS metastazının in vivo çalışmaları için kullanılan aşırı kullanılmış hücre hattı modellerinin yerini alan fizyolojik olarak ilgili klinik öncesi modellerin yanı sıra hizmet ederler. Kuşkusuz PDX ile donör hasta tümörü arasındaki farklar12,18'dir. Bu farklılıkların ne olduğunu bilmek, klinik öncesi çalışmaların doğru planlanması ve yürütülmesi için önemlidir. Son olarak, birkaç aşılama yolu arasından seçim yaparak, PDX modelleri, hastalığın birçok yönünün incelenmesine izin veren kullanımlarında çok yönlüdür. PDX'lerin modelleri şüphesiz CNS metastazı anlayışımızı ilerletmede ve yeni tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir rol oynayacaktır.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

Şekil 3A, önceki yayınımız12'den alınmıştır ve Dr. Jann Sarkaria'nın Mayo Clinic'teki laboratuvarında oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
25G iğneVWRBD305122
70 ve mikro; m Hücre süzgeciVWR21008-952
%70 etanol mendilVWR470106-486
Kemik mumuMedVetW31G-RL
CIEA NOG fareTaconicNOG-F
DMEMThermoFisher11965092
Ethiqa XR (buprenorfin SR)MWI072117
FBSThermoFisher
gentleMACS C TüpMiltenyi130-093-237
gentleMACS Octo DissosiatorMiltenyi130-095-937
Hamilton şırıngaSigma20919
Matrigel büyüme faktörü azaltılmış (GFR)Corning354230
Oftalmik merhemMedVetPH-PURALUBE-VET
PBS/DPBSThermoFisher14040133
Povidone iyot çubuklarıVWR15648-906
Stereotaksik çerçeveÇalma51730
Cerrahi matkapÇalma58610
Cerrahi yapıştırıcıMedVetVG3
Cerrahi sütürlerMedVetMMV-661-V
ŞırıngaVWR53548-001
Tümör ayrışma kitiMiltenyi130-095-929
16000044

Kaynaklar

  1. Cruz-Munoz, W., Kerbel, R. S. Preclinical approaches to study the biology and treatment of brain metastases. Seminars in Cancer Biology. 21 (2), 123-130 (2011).
  2. Owonikoko, T. K., et al. Current approaches to the treatment of metastatic brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 11 (4), 203-222 (2014).
  3. Salhia, B., et al. Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis. PLoS One. 9 (1), 85448(2014).
  4. Kotecha, R., Gondi, V., Ahluwalia, M. S., Brastianos, P. K., Mehta, M. P. Recent advances in managing brain metastasis. F1000Research. 7, 1000(2018).
  5. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  6. Klinghammer, K., et al. A comprehensively characterized large panel of head and neck cancer patient-derived xenografts identifies the mTOR inhibitor everolimus as potential new treatment option. International Journal of Cancer. 136 (12), 2940-2948 (2015).
  7. Lee, H. W., et al. Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy. Clincal Cancer Research: An Official journal of the American Association of Cancer Research. 21 (5), 1172-1182 (2015).
  8. Ni, J., et al. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nature Medicine. 22 (7), 723-726 (2016).
  9. Oshi, M., et al. Novel breast cancer brain metastasis patient-derived orthotopic xenograft model for preclinical studies. Cancers (Basel). 12 (2), 444(2020).
  10. Garman, B., et al. Genetic and genomic characterization of 462 melanoma patient-derived xenografts, tumor biopsies, and cell lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
  11. Krepler, C., et al. A comprehensive patient-derived xenograft collection representing the heterogeneity of melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
  12. Tew, B. Y., et al. Patient-derived xenografts of central nervous system metastasis reveal expansion of aggressive minor clones. Neuro-Oncology. 22 (1), 70-83 (2020).
  13. Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).
  14. Davies, N. J., et al. Dynamic changes in clonal cytogenetic architecture during progression of chronic lymphocytic leukemia in patients and patient-derived murine xenografts. Oncotarget. 8 (27), 44749-44760 (2017).
  15. Eirew, P., et al. Dynamics of genomic clones in breast cancer patient xenografts at single-cell resolution. Nature. 518 (7539), 422-426 (2015).
  16. Arvanitis, C. D., Ferraro, G. B., Jain, R. K. The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases. Nature Reviews. Cancer. 20 (1), 26-41 (2020).
  17. Choi, S., et al. In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models. BMC Cancer. 16 (1), 723(2016).
  18. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
  19. Bradford, J. R., et al. Whole transcriptome profiling of patient-derived xenograft models as a tool to identify both tumor and stromal specific biomarkers. Oncotarget. 7 (15), 20773-20787 (2016).
  20. Yip, H., Haupt, C., Maresh, G., Zhang, X., Li, L. Humanized mice for immune checkpoint blockade in human solid tumors. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (5), 313-320 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MSS MetastazFlank mplantasyonuOrtotopik Enjeksiyonntrakardiyak EnjeksiyonT m r Mikro evresiPreklinik ModellerT m r nok lasyonuMetastatik KaskadHistolojik Analiz

İlgili makaleler