Burada, olgun insan retinal organoidleri üretmek ve bunları yaşa bağlı retinal dejeneratif hastalık maküler telanjiektazi tip 2 (MacTel) için farmasötik adayları tanımlamak için bir fotoreseptör toksisite testinde kullanmak için adım adım bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farmasötik Keşif için İnsan Retinal Organoidlerinde Toksisite Taramaları
Bu makalede
Özet
Özet
Organoidler, hücre kültürünün çok yönlülüğü ve verimi ile doğrudan insan dokusu bağlamında hastalık mekanizmasını ve tedavilerini incelemek için umut verici bir platform sağlar. Olgun insan retinal organoidleri, yaşa bağlı retinal dejeneratif hastalık maküler telanjiektazi tip 2 (MacTel) için potansiyel farmasötik tedavileri taramak için kullanılır.
Son zamanlarda MacTel'in atipik bir lipit türü olan deoksisfingolipidlerin (deoksiSL'ler) yüksek seviyelerinden kaynaklanabileceğini gösterdik. Bu lipitler retina için toksiktir ve MacTel hastalarında meydana gelen fotoreseptör kaybına neden olabilir. İlaçları deoksiSL fotoreseptör toksisitesini önleme yetenekleri açısından taramak için, MacTel kaynaklı olmayan bir pluripotent kök hücre (iPSC) hattından insan retinal organoidleri ürettik ve bunları fonksiyonel olarak olgun fotoreseptörler de dahil olmak üzere retinanın tüm nöronal soy türevi hücrelerini geliştirdikleri mitotik bir yaşa olgunlaştırdık. Retinal organoidler deoksiSL metaboliti ile tedavi edildi ve immünohistokimya kullanılarak fotoreseptör tabaka içinde apoptoz ölçüldü. Bu toksisite modeli kullanılarak, deoksiSL kaynaklı fotoreseptör ölümünü önleyen farmakolojik bileşikler tarandı. Hedeflenen bir aday yaklaşım kullanarak, yüksek kolesterol ve trigliseritlerin tedavisi için yaygın olarak reçete edilen bir ilaç olan fenofibratın, retina hücrelerinde deoksiSL toksisitesini de önleyebileceğini belirledik.
Toksisite taraması, fotoreseptör ölümünü önleyebilen FDA onaylı bir ilacı başarıyla tanımladı. Bu, test edilen hastalıkla ilgili yüksek model nedeniyle doğrudan eyleme geçirilebilir bir bulgudur. Bu platform, retina hastalıklarında gelecekteki tedavi keşfi için herhangi bir sayıda metabolik stresörü ve potansiyel farmakolojik müdahaleleri test etmek için kolayca değiştirilebilir.
Giriş
İnsan hastalığının hücre kültüründe ve hayvan modellerinde modellenmesi, farmakolojik terapötiklerin keşfi, modifikasyonu ve doğrulanması için paha biçilmez araçlar sağlamış ve aday ilaçtan onaylanmış tedaviye ilerlemelerini sağlamıştır. İn vitro ve insan dışı in vivo modellerin bir kombinasyonu uzun zamandır ilaç geliştirme boru hattının kritik bir bileşeni olmasına rağmen, yeni ilaç adaylarının klinik performansını tahmin etmekte sıklıkla başarısız olmaktadırlar1. Basit insan hücresel monokültürleri ile klinik çalışmalar arasındaki boşluğu dolduran teknolojilerin geliştirilmesine açık bir ihtiyaç vardır. Kendi kendini organize eden üç boyutlu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. iPSC'leri/ESC'leri çözme, geçirme ve genişletme
NOT: Tüm hücre kültürü adımlarında, steril bir hücre kültürünü korumak için en iyi uygulamaları kullanın.
- 6 delikli bir hücre kültürü plakasını bazal membran matris ortamı ile kaplayın.
- Bu ortamın 1x'ini hazırlamak için ürün spesifikasyonlarını takip edin veya 75 μL soğuk matris ortamını 9 mL DMEM/F12 ile seyreltin. 6 delikli bir plakaya kuyucuk başına 1,5 mL taze hazırlanmış 1x ortam ekleyin. 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Bazal membran matris ortamını aspire edin ve her bir kuyucuğu 3 mL DMEM / F12 ile durulayın. 2 mL DMEM/F12 ekleyin ve kullanıma kad....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Retinal organoidler MacTel olmayan bir kontrol iPSC hattından üretildi. Organoidler kültürde 26 haftaya ulaştıktan sonra seçildi ve deney gruplarına ayrıldı. Organoidler, deoksiSA'nın fotoreseptörler için toksik olup olmadığını belirlemek için değişen konsantrasyonlarda deoksiSA ile muamele edildi. Dört deoksiSA konsantrasyonu, 0 ila 1 μM arasında test edildi (Şekil 2) ve organoidler her geçen gün medya değişiklikleri ile 8 gün boyunca tedavi edildi. DeoksiSA'ya yanıt olarak hücre ölümü kons.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Farklılaştırma protokolü varyasyonları
Yoshiki Sasai'nin grup 20 tarafından kendi kendini oluşturan optik kapların icadından bu yana, birçok laboratuvar neredeyse her adımdadeğişebilen retinal organoidler üretmek için protokoller geliştirmiştir 5,18,19,21. Protokollerin ayrıntılı bir listesi Capowski ve ark.22'de bulunabilir. B.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Lowy Tıbbi Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenmektedir. MacTel projesine verdikleri destek için Lowy ailesine teşekkür ederiz. Mari Gantner, Mike Dorrell ve Lea Scheppke'ye entelektüel katkıları ve makalenin hazırlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Şişeleri | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoksisfinganin | Avanti | 860493 | |
| B27 Takviyesi, eksi A vitamini | Gibco | 12587010 | |
| Kunduz 6900 Mini Bıçaklı | Kunduz-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sükroz | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, toz | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, yüksek glikoz, piruvat | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Eşek anti-tavşan Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| eşek serumu | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Isı ile İnaktive | Edilmiş Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrat | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Kök Hücre Teknolojileri | 7980 | |
| Yerinde Hücre Ölümü Tespit Kiti, Floresan | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, Büyüme faktörü azaltılmış | Corning | 356230 | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Kök Hücre Teknolojileri | 85850 | |
| N2 Takviyesi | Gibco | 17502048 | |
| Penisilin-Streptomisin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce %16 Formaldehit | Thermo-fisher | 28906 | |
| Tavşan anti-Recoverin antikoru | Millipore | AB5585 | |
| Sodyum Sitrat | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Steril Tek Kullanımlık Vakum Filtre Üniteleri | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurin | Sigma | T0625 | |
| Doku Artı-OCT bileşiği | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra Düşük Ataşman 6 kuyulu Plakalar | Corning | 29443-030 | |
| Ultra Düşük Ataşman 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vakum Filtrasyon Sistemi | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield montaj ortamı | vektör Labs | H-1000 | |
| balmumu kalemi-ImmEdge | vektör Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihidroklorür (Kaya inhibitörü) | Sigma | Y0503 |
Kaynaklar
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
