Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/62311

Bu protokol, tek bir deneyde dört ilaç arasında elde edilebilen tüm olası kombinasyonların nasıl incelanacağını açıklar. Bu yöntem, sonuçları değerlendirmek için standart 96 kuyu plakası mikro seyreltme testine ve fraksiyonel inhibitör konsantrasyonların (FIC) hesaplanmasına dayanmaktadır.

Abstract

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/62311

İlaç kombinasyon tedavisi kavramı, esas olarak ilaçlara karşı direncin artmasıyla çok önemli hale gelmektedir. Q-checkerboard olarak da adlandırılan Dörtlü dama tahtası, diğer protokollerle aynı sonuçları elde etmek için gereken zamanı ve çalışmayı en aza indirmek için bir deneyde dört ilaç arasında elde edilebilen olası kombinasyonların sayısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır. Bu protokol, ilaçların seyreltildiği ve birkaç 96 kuyu plakasında birleştirildiği basit mikro seyreltme tekniğine dayanmaktadır.

96 kuyulu tabakların ilk setinde, Muller-Hinton suyu seri olarak seyreltmek için ilk gerekli ilaç (örneğin, buradaki Cefotaxime) eklenir. İlk adım yapıldıktan sonra, belirli bir ilaç 2 hacmini çıkararak aktarılacak ve ilaç içeren ilk 96 kuyu plakaları kümesinde karşılık gelen kuyulara konulacak ikinci ilacı (örneğin Amikaci) seyreltmek için başka bir 96 kuyu plakası seti kullanılır. Üçüncü adım, üçüncü ilacın gerekli konsantrasyonları (örneğin, Levofloksasin), ilaç 1 ve 2 kombinasyonunu içeren ilk sette uygun plakalara eklenerek yapılır. Dördüncü adım, dördüncü ilacın gerekli konsantrasyonları (örneğin, Trimethoprim-sulfamethoxazol) ilk sette uygun plakalara eklenerek yapılır. Daha sonra E. coli ESBL bakteriyel inoculum hazırlanarak eklenecektir.

Bu yöntem, tüm olası kombinasyonları değerlendirmek için önemlidir ve in vivo test için daha fazla test edilmesi gereken daha geniş bir olasılık yelpazesine sahiptir. Çok fazla odaklanma gerektiren yorucu bir teknik olmasına rağmen, sonuçlar dikkat çekicidir ve tek bir deneyde birçok kombinasyonun test edilebildiği zaman tasarrufu sağlar.

Introduction

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/62311

Antibiyotiklerin aşırı kullanımı ve yanlış kullanımı nedeniyle direncin artmasıyla^1,2, bakteriyel enfeksiyonları tedavi etmek için yeni ilaçlar ve ajanlar geliştirme ihtiyacı çok önemli hale gelmiştir. Direnç krizinin üstesinden gelmek için yeni ilaçlar geliştirmek gibi yeni yaklaşımlar çok önemlidir. Bununla birlikte, ilaç endüstrisi yeni antimikrobiyal ajanlar geliştirmekle ilgilenmiyor. Ayrıca, yeni ilaçlar geliştirilirse, bakteriler bu yeni ilaçlara karşı gelişmeye ve direnç geliştirmeye devam edecektir^3,4. Böylece, direnç sorunu çözülmeyecek ve bakteri direncinin üstesinden gelmek için başka bir yaklaşıma duyulan ihtiyacı dikkate alınması ve çalışılması gereken bir zorunluluk haline getirecektir.

İlaç kombinasyonu, bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde çok önemli bir kavramdır, esas olarak çokdrojenlere dirençli patojenlerin neden olduğu^5,6. Tedavinin seyrini azaltır, verilen dozu azaltır; böylece, verilen ilacın toksisitesini azaltmak, direnç gelişme hızını azaltmaya yardımcı olur ve bir şekilde, teminat duyarlılığı^kavramındaaçıklandığı gibi bakterileri verilen ilaçlara duyarlı hale verir 5^,7,8,9.

Bir ilaca direnç gelişimi tek bir mutasyon gerektirir; bununla birlikte, birden fazla yolu hedefleyen ilaçların bir kombinasyonuna direnç gelişimi, bu kombinasyon tarafından yavaşlatılan birkaç bağımsız mutasyon gerektirir. Kombinasyon tedavisi kullanırken direncin azalmasına bir örnek, Mycobacterium Tuberculosis^10’daRifampin’e karşı direncin azalmasıdır. Başka bir örnek Gribble ve ark. tarafından yapılan bir çalışma, piperacillin alan hastalarda dirençli suşların ortaya çıkış oranının karboksipenisilin ve aminoglikozin kombinasyonunu alanlardan daha yüksek olduğunu göstermiştir¹⁰. Çalışmalar, gelişen bakterilerde aminoglikozinlere karşı direnç gelişiminin bu suşları diğer çeşitli ilaçlara duyarlı hale getirdiğini^{göstermiştir 5}. Beta-laktam sınıfı ilaç amoksisilin ve laktamaz inhibitörü clavulanic asit arasındaki kombinasyon dirençli bakteri suşlarının tedavisinde başarı göstermiştir⁸.

Tedavi süresini azaltmak, ilaç kombinasyonlarından kaynaklanan iyi bir avantajdır. Örneğin, 2 hafta boyunca gentamisin ile kombine penisilin veya seftriakson tedavisi, 4 hafta boyunca verildiğinde sadece penisilin veya sedtriakson tarafından verilen etkinliğin aynısını verecektir¹¹. İlaçların birleştirilmesi, Sub-MIC’ler gibi tek başına verildiğinde etkili olmayan ilaçların daha düşük dozajlarının kullanımına izin verir. Sülfonamidler örneği, üçlü sülfonamidlerin kullanımının en aza indirildiği yerlerde, daha düşük dozlarda, çözünmeyen sülfonamidleri tam dozlarda kullanırken kristal oluşumu veya kristalüri olan toksisite^{verilebilir 12}.

Böylece verilen dozajın ve tedavi süresinin azaltılması sonunda ilaçların vücuttaki toksisitesini azaltacaktır. Kombine ilaçlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için yöntemler geliştirme fikri çok önemlidir. Bir çalışmada, sonuçlar kombinasyon tedavisinin dirençli Acinetobacter ve P. aeruginosa8 türlerinin tedavisinde daha etkili olduğunu^{göstermiştir.}

İlaçların birlikte verilmesi
Dama tahtası yöntemi, zaman öldürme eğrisi yöntemi ve E-test yöntemi¹³gibi ilaç kombinasyonlarını inceleyebileceğimiz farklı yöntemler vardır. Dama tahtası yöntemi, söz konusu iki ilaç arasındaki tüm olası kombinasyonları bir deneyin kendisinde inceleyebilir. Ek olarak, üç ilacın bir kombinasyonunu incelemek için geliştirilmiştir¹⁴. Şimdi, bunu esas olarak multidrug dirençli patojenlerin tedavisi için dört ilacın bir kombinasyonunu incelemek için genişletiyoruz.

Zaman öldürme eğrisi testi genellikle belirli bir ilacın bakterisidal etkisini test etmek için gerçekleştirilir. Ayrıca, belirli konsantrasyonlarda birkaç ilacın birleştirildiği ilaç kombinasyonlarının etkisini test etmek için de kullanılmıştır. Bu protokol, her fincanda et suyunu, ilaçların kombinasyonunu ve gerekli bakteri suşunu eklediğimiz birkaç steril tüpün veya bardağın hazırlanmasını gerektirir. Optik yoğunluğun birkaç zaman noktasında inkübasyonu ve kaydedilmesi sonrasında, büyüme hızının artıp artmadığını veya değişmediğini görmek için kullanılan suşun normal büyüme hızı ile karşılaştırılmıştır¹³.

E-test yöntemi genellikle söz konusu ilacın gradyan konsantrasyonu içeren bir şeridin aşılanmış bir plakaya konulduğu minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) test etmek için yapılır. Ayrıca, plakaya iki şeridin MIC^13’lerindekesişen dik bir şekilde eklendiği iki ilaç arasındaki kombinasyonu test etmek için de kullanıldı.

Literatüre göre sinerjiyi tanımlamak ve incelemek için altın bir standart yoktur; bu nedenle, kombinasyonu incelemek için kullanılan yöntemlerden hangisinin daha iyi olduğunu ve hangisinin daha iyi ve daha güvenilir sonuçlar ürettiğini değerlendirmek zordur esas olarak¹³. Bununla birlikte, Time-kill testi emek yoğun, zaman alıcı ve pahalı^15,16, E-test yöntemi sadece iki ilaç arasındaki bir kombinasyonu incelemek için geliştirilmiştir. Dama tahtası test edilen iki ilaç arasındaki tüm olası kombinasyonları inceleyebilir ve bu yüzden bu teknik geliştirilmek üzere seçilmiştir.

Protocol

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/62311

1. Hazırlık adımları

1. 1 L damıtılmış suya 25 g MH suyu ekleyerek Muller-Hinton suyu (MHB) hazırlayın ve karıştırın. 2,5 saat boyunca 121 °C’de otoklav. Ardından, otomatik kapatılmış ortamı oda sıcaklığında veya buzdolabında saklayın.
2. Söz konusu bakterileri(E. coli ESBL) dört çeyrek çizgi yöntemini kullanarak agar medyasında alt kültüre koyun ve 37 °C’de bir gecede kuluçkaya yatırın.
   1. Steril bir döngü kullanarak, bir koloni alın ve yakın paralel çizgiler yaparak MacConkey agar plakasının ilk yarısına yayın.
   2. Döngüyü kullanarak, bakterileri ilk çeyrekten itibaren çizgileyerek ikinci çeyrekte yayın.
   3. İkinci çeyrekten itibaren, yakın paralel çizgiler kullanarak üçüncü çeyrekteki çizgileri genişletin.
   4. Bakterileri dördüncü çeyreğin ortasına üçüncü çeyrekten itibaren çizerek yayarlar.

2. Panel hazırlığı

1. Bir kare oluşturmak için yan yana dört 96 kuyu plakası yerleştirin. Bir bant kullanarak, altlarını birbirine bantlayın.
2. Her biri 4 plaka içeren dört panel elde etmek ve bunları A1, A2, A3 ve A4 olarak adlandırmak için bu adımı yineleyin.
3. Dört panelin 16 adet 96 kuyu plakasındaki sütun 2 ile sütun 11 arasındaki kuyulara 50 μL MH suyu ekleyin.
4. Dört panelin 16 adet 96 kuyu plakasında negatif kontrol kuyusu olarak hizmet veren kuyu H12’ye 200 μL MH suyu ekleyin.
5. Dört panelin 16 adet 96 kuyu plakasında pozitif kontrol kuyusu görevi gören A1 ve H1 kuyularına 150 μL MH suyu ekleyin.

3. İlaç 1, Cefotaxime, seri seyreltme

1. Konik bir tüpe 15 mL steril dH₂O ekleyin.
   1. C 1 V 1 = C 2 V₂formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V₁ = (C₂ x 15 mL) / C₁.
      NOT: Bizim durumumuzda, Cefotaxime stok çözeltisi 10^{5 μg} / mL ve C_{2 2} 256 μg / mL’dir; böylece V₁ = 38,4 μL.
2. Hesaplanan hacmi 15 mL steril dH₂O’dan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.
3. H12 hariç sütun 11 ve sütun 12’deki her kuyuya hazırlanan ilaç çözeltisinin pipet 50 μL’si.
4. Sütun 11’den 50 μL çıkararak ve sütun 10’daki ilgili kuyulara koyarak seri seyreltmeye başlayın ve ardından sütun 2’den alınan 50 μL’nin atılacağı sütun 2’ye ulaşana kadar.
5. Dört panelin tüm 16 96 kuyu plakası için 3.4 ve 3.5 adımlarını yineleyin.

4. İlaç 2, Amkacin, seri seyreltme

1. Konik bir tüpe 10 mL steril dH₂O ekleyin.
2. C 1 V 1 = C 2 V₂formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V₁ = (C₂ x 10 mL) / C₁.
   NOT: Bizim durumumuzda, Amikacin stok çözeltisi 10^{3 μg} / mL ve C₂ 64 μg / mL’dir; böylece V₁ = 64 μL.
3. Hesaplanan hacmi 10 mL steril dH₂O’dan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.
4. Sekiz ayrı 96 kuyu plakası alın.
5. Her tabağa, G ve B sıraları arasındaki kuyulara 100 μL MHB ekleyin.
6. Daha önce hazırlanmış ilaç 2 çözeltisinin 100 μL’lik kısmını G sırasının kuyularına ekleyin.
7. Her kuyudan 100 μL alarak G satırından B satırına seri olarak seyreltin ve son olarak 100 μL’yi B satırının kuyularından atın.
8. Sekiz plaka hazırlamak için 4.5, 4.6 ve 4.7 adımlarını yineleyin.

5. İlaç 2’nin dört panele aktarılması

1. Pipet 50 μL ilaç 2, G ve B sıraları arasındaki kuyulardan dört paneldeki her plakadaki ilgili kuyulara. Hazırlanan bir 96 kuyu plakası, bir panelde iki plaka için yeterli olan 100 μL ilaç 2 içerir.

6. İlaç 3, Levofloksasin, ilave

1. Dört farklı konik tüpe 14 mL steril dH₂O ekleyin.
2. C 1 V 1 = C 2 V₂formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V₁ = (C₂ x 14 mL) / C₁.
   NOT: Bizim durumumuzda, Levofloksasin 5 x 10³ μg / mL’lik bir stok çözeltisinden dört farklı konsantrasyonda hazırlanır.
   C₁ = 2 μg/mL, V₁ = 5,6 μL
   C₂ = 4 μg/mL, V₁ = 11,2 μL
   C₃ = 8 μg/mL, V₁ = 22,4 μL
   C₄ = 16 μg/mL, V₁ = 44,8 μL
3. Hesaplanan hacmi her tüpten 14 mL steril dH₂O’dan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.
4. Üçüncü ilacın gerekli konsantrasyonlarını hazırladıktan sonra, 50 μL alın ve B ve G satırları ile C1’in dört paneldeki dört P1 plakasına karşılık geldiği her panelde ilgili plakadaki 2 ve 12 sütunları arasındaki ilgili kuyulara ekleyin, C2 dört paneldeki dört P2 plakasına karşılık gelir. , C3 dört paneldeki dört P3 plakasına, C4 ise dört paneldeki dört P4 plakasına karşılık gelir.

7. İlaç 4, Trimethoprim-sulfamethoxazole, ilave

1. Konik bir tüpe 14 mL steril dH₂O ekleyin.
2. C 1 V 1 = C 2 V₂formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V₁ = (C₂ x 14 mL) / C₁.
   NOT: Bizim durumumuzda trimethoprim-sulfamethoxazole, 48 x 10³ μg/mL’lik bir stok çözeltisinden dört farklı konsantrasyonda hazırlanır.
   C₁ = 512 μg/mL, V₁ = 149,33 μL
   C₂ = 1024 μg/mL, V₁ = 298,66 μL
   C₃ = 2048 μg/mL, V₁ = 597,33 μL
   C₄ = 4096 μg/mL, V₁ = 1 194,66 μL
3. Hesaplanan hacmi her tüpün 14 mL steril dH₂O’sundan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.
4. Dördüncü ilacın gerekli konsantrasyonlarını hazırladıktan sonra, 50 μL alın ve C1’in panel 1’e, C3’ün panel 3’e ve C4’ün panel 4’e karşılık geldiği ilgili paneldeki dört plakadaki 2 ve 12 sütunları arasındaki ilgili kuyulara ekleyin.

8. Bakteriyel inoculum E. coli ESBL hazırlanması ve eklenmesi

1. Steril bir döngü kullanarak, daha önce bir plaka üzerinde kültürlenmiş bakteriyel izole E. coli ESBL’nin bir kolonisini 2 mL steril MHB ve girdap içine aktarın.
2. Bir densitometre kullanarak 0.5 McFarland olması gereken yerde bulanıklığı kontrol edin.
3. Steril bir idrar kabına 80 mL steril MH suyu ekleyin.
4. C 1_V 1 = C 2 V_2‘yitakiben idrar kabına_0,5McFarland inokülüsten bakteriyel inokülum ekleyin, burada V 1 =₍₁₀ ⁶ x 80 mL) / 10⁸ = 800 μL.
5. Pipet 50 μL inoculum çözeltisi 10⁶ CFU/mL sterilite kontrolü iyi olan H12 hariç her kuyuya.
6. Panelleri gece boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatırın.
7. Kuluçkadan sonra, kuyulardaki büyümeyi kaydetmek için 50 μL Iodotetrazolium ekleyin.

9. FIC şablonu için protokol (Ek Dosya)

1. A panelinde sarı hücreye en yüksek ilaç 1 (Cefotaxime) konsantrasyonu yazın.
2. B panelinde sarı hücreye en yüksek ilaç 2 (Amikacin) konsantrasyonu yazın.
3. C panelinde sarı hücreye en yüksek ilaç 3 konsantrasyonu (Levofloksasin) yazın.
4. En yüksek ilaç konsantrasyonu 4’ü (Trimethoprim-sulfamethoxazole) panel D’ye yazın.
5. Kırmızıda büyüme olan kuyuları vurgulayarak Redline’ı (Büyüme/Büyüme yok arayüzü) takip edin.
6. İlaç 1’in MIC’ini ilaç 1 (ATB1) tablosuna yazın.
7. İlaç 2’nin MIC’ini ilaç 2 (ATB2) tablosuna yazın.
8. İlaç 3’ün MIC’ini ilaç 3 (ATB3) tablosuna yazın.
9. İlaç 4’ün MIC’ini ilaç 4 (ATB4) tablosuna yazın.
10. ATB1 için FIC hesaplamak için
    1. Büyüme/Büyüme yok arabirimindeki kuyuları belirleyin.
    2. Atb1 tablosunda, FIC1’in yanındaki hücreye çift tıklayın ve A panelinin solundaki sarı hücreyi seçilen ilk kuyuya sürükleyin.
    3. 9.10.2 adımlarını, kuyu 1’in FIC1’e karşılık geldiği, 2’nin FIC2’ye karşılık geldiği ve benzeri her kuyu için tekrarlayın.
11. ATB2 için FIC’yi hesaplamak için
    1. ATB2 tablosunda, FIC1’in yanındaki hücreye çift tıklayın ve B panelinin solundaki sarı hücreyi önceden seçilmiş ilk kuyuya sürükleyin.
    2. Önceden seçilmiş her kuyu için 9.11.1 adımlarını yineleyin.
12. ATB3 için FIC’yi hesaplamak için
    1. Tablo ATB3’te, FIC1’in yanındaki hücreye çift tıklayın ve C panelinin solundaki sarı hücreyi önceden seçilmiş ilk kuyuya sürükleyin.
    2. Önceden seçilmiş her kuyu için 9.12.1 adımlarını yineleyin.
13. ATB4 için FIC’yi hesaplamak için
    1. Atb4 tablosunda, FIC1’in yanındaki hücreye çift tıklayın ve D panelinin solundaki sarı hücreyi önceden seçilmiş ilk kuyuya sürükleyin.
    2. Önceden seçilmiş her kuyu için 9.13.1 adımlarını yineleyin.
14. ATB1+2+3+4 etiketli tabloda, her ATB’nin FIC1’ini otomatik olarak toplar. Aynı durum diğer FIC’ler (FIC2, FIC3 vb.) için de geçerli olacaktır.
    1. FIC içeren ve sarı ile vurgulanan hücrede, üzerine çift tıklayın ve TABLO ATB1 +2+3+4’ten toplam ΦFIC’leri seçin.
15. Dokuz plakayı temsil eden dokuz sayfanın her biri için bu adımları yineleyin.
    NOT: Tüm FIC sayfasında, tablo elde edilen değerin yorumlanmasıyla son toplamlı FIC’yi gösterecektir.

10. Dört ilaç için mikrodilütion testini kullanarak MIC tayini

1. Test edilen her ilacın kısaltmasıyla dört farklı satırı etiketle. Örneğin, Cefotaxime için CTX, Amikacin için, Levofloksasin için LEVO ve Trimethoprim-sulfamethoxazole için SXT.
2. Pipet 200 μL steril Muller Hinton suyu, kullanılan her satırda kuyu numarası 1 ve kuyu numarası 12’ye. 12 numara negatif kontrol kuyusu olarak hizmet edecek.
3. Pipet 100 μL steril Muller Hinton suyu kuyulara 2 ila 11 kullanılan her satırda.
4. C₁V 1 = C 2 V₂ formülünü kullanarak eklenecek her ilacın hacmini hesaplayın. Böylece, V₁ = (C₂ x 4 x V₂) / C₁. V_2, 200 μL olan kuyulardaki son hacimdir, C₁ stok çözeltisinin konsantrasyonudur ve C₂ ilk kuyuda sahip olmamız gereken ilk konsantrasyondur.
   NOT: Burada aşağıdakileri kullanırız:
   Cefotaxime: C₁ = 10⁵ μg/mL, burada 10⁴ μg/mL, C 2 =₂₅₆ μg/mL’ye seyreltiyoruz; böylece, V₁ = 20,48 μL
   Amikacin: C₁ = 10³ μg/mL, C₂ = 64 μg/mL; böylece, V₁ = 51.2 μL
   Levofloksasin: C₁ = 5 x 10³ μg/ mL, burada 5 x 10^{2 μg} / mL, C₂ = 16 μg / mL’ye seyreltiyoruz; böylece, V₁ = 25,6 μL
   Trimethoprim-Sulfamethoxazole: C₁ = 48 x 10³ μg/mL, C₂ = 4096 μg/mL; böylece, V₁ = 68,26 μL
5. Pipet, ilacın eklenmesinden sonra toplam 200 μL hacim elde etmek için 200 μL et suyundan aynı hacmi çıkardıktan sonra ilgili satırın ilk kuyusundaki her ilaç için gerekli hacmi sağlar.
6. 100 μL’yi kuyudan 1’den kuyu 2’ye çıkararak seri olarak seyreltin ve böylece kuyudan çıkarılan 100 μL’nin atılacağı kuyu 10’a ulaşana kadar. 11’in pozitif kontrol olarak iyi hizmet ettiğini unutmayın.
7. Pipet 100 μL 10⁶ negatif kontrol görevi gören 12 numara hariç kullanılan her bir kuyuya bakteriyel inoculum hazırladı.
8. Gece boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatır.

Representative Results

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/62311

Şekil 2A, Cefotaxime ve Amikacin’in belirli Levofloksasin ve Trimethoprim-sulfamethoxazole konsantrasyonlarıyla birleştirilmesiyle elde edilen sonuçları temsil eder. Şeklin sol kısmında, şeklin sağ kısmındaki ilaçların konsantrasyonları ile şematik olarak sunulan dört plakayı görebiliriz. Oklar Büyüme/Büyüme yok arabirimindeki kuyuları temsil eder. Renkli kuyular büyüme içeren kuyulardır. Dördüncü plakanın kombinasyonu içeren kadranda büyüme içermediğini …

Discussion

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/62311

Dörtlü Dama Tahtası yöntemi, protokolündeki dama tahtasına ve üç boyutlu dama tahtasına benzer. Ancak, deneme sırasında hataları önlemek için bazı önemli adımlar dikkate alınmalıdır.

Plakalarda seri olarak seyreltilmesi gereken ilaç 1 ve ilaç 2 için seyreltmeleri başlatmak için gereken konsantrasyonların ne olduğunu bilmek için protokole başlamadan önce test edilen izoleye karşı her ilacın MIC’ını test etmeyi unutmayın. İlaç 3 ve ilaç 4 ile ilgili olarak,…

Materials

1000 µL tips	Citotest	4330000402
200 µL tips	Citotest	4330-0013-17
50 mL centrifuge tube	corning	430828	For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube	Falcon	352058	For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes	JRZ Plastilab		As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates	corning	3596	For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole	By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France	10177403	Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime)	PHARCO Pharmaceuticals	24750/2006	Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain	Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon		Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar	BIO-RAD	64169508	For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)	HIKMA Pharmaceuticals	2BXMIA56N-AEF	Drug 2
Muller-Hinton Broth	BIO-RAD	69444	For making bacterial media
Multichannel Pipette	Thermo Scientific	GJ54761	For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes	Thermo Scientific	OH19855 HH40868	For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)	sanofi aventis	221937/2009	Drug 3