Hasta Kaynaklı Glioma Kök Hücreleri Kullanarak GBM için Potansiyel Kombinasyon Tedavisini Belirlemek için Hızlı Tarama İş Akışı

Özet

Glioma kök hücreleri (GSC' ler), en yaygın ve yıkıcı primer beyin tümörü olan glioblastomda (GBM) tümör başlatma, anjiogenez ve ilaç direncinde önemli roller oynayan kanser hücrelerinin küçük bir kısmıdır. GSC'lerin varlığı GBM'yi hedeflenen ajanların çoğu için çok refrakter hale getirir, bu nedenle potansiyel etkili kombinasyon terapötiklerini tanımlamak için yüksek verimli tarama yöntemleri gerekir. Protokol, sinerjik etkileşim ile potansiyel kombinasyon tedavisi için hızlı tarama sağlamak için basit bir iş akışını açıklar. Bu iş akışının genel adımları luciferaz etiketli GSC'lerin kurulması, matrigel kaplamalı plakaların hazırlanması, kombinasyon ilaç taraması, analiz ve sonuçların doğrulaştırılmasından oluşur.

Özet

Glioma kök hücreleri (GSC' ler), en yaygın ve yıkıcı primer beyin tümörü olan glioblastomda (GBM) tümör başlatma, anjiogenez ve ilaç direncinde önemli roller oynayan kanser hücrelerinin küçük bir kısmıdır. GSC'lerin varlığı GBM'yi hedeflenen ajanların çoğu için çok refrakter hale getirir, bu nedenle potansiyel etkili kombinasyon terapötiklerini tanımlamak için yüksek verimli tarama yöntemleri gerekir. Protokol, sinerjik etkileşim ile potansiyel kombinasyon tedavisi için hızlı tarama sağlamak için basit bir iş akışını açıklar. Bu iş akışının genel adımları luciferaz etiketli GSC'lerin kurulması, matrigel kaplamalı plakaların hazırlanması, kombinasyon ilaç taraması, analiz ve sonuçların doğrulaştırılmasından oluşur.

Giriş

Glioblastoma (GBM) primer beyin tümörünün en sık görülen ve agresif tipidir. Şu anda, maksimal tedavi (cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi kombinasyonu) alan GBM hastalarının genel sağkalımları hala 15 aydan kısadır; bu nedenle GBM için yeni ve etkili tedaviler acilen gereklidir.

GBM'de glioma kök hücrelerinin (GSC) varlığı, bu kök benzeri hücreler tümör mikroçevrimi, ilaç direnci ve tümör nüks^1'insürdürülmesinde pivot roller oynadığından geleneksel tedavi için önemli bir zorluk oluşturmaktadır. Bu nedenle, GSC'leri hedeflemek GBM tedavisi için umut verici bir strateji olabilir². Bununla birlikte, GBM'deki ilaç etkinliğinin en büyük dezavantajı, genetik mutasyonlar, karışık alt tipler, epigenetik regülasyon ve tümör mikroçevrimi arasındaki fark dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere heterojen doğasıdır ve bu da onları tedavi için çok refrakter hale getirir. Birçok başarısız klinik çalışmadan sonra, bilim adamları ve klinik araştırmacılar, tek ajan hedefli tedavinin muhtemelen GBM gibi yüksek heterojen kanserlerin ilerlemesini tam olarak kontrol edemediğini fark ettiler. Oysa özenle seçilmiş ilaç kombinasyonları, sinerjik olarak birbirlerinin etkisini artırarak etkinliği için onaylanmıştır, böylece GBM tedavisi için umut verici bir çözüm sağlanmıştır.

Bir ilaç kombinasyonunun ilaç-ilaç etkileşimlerini değerlendirmenin birçok yolu olmasına rağmen, CI (Kombinasyon İndeksi), HSA (En Yüksek Tek Ajan) ve Saadet değerleri^vb. Gerçekten de, bu yöntemler ilaç-ilaç etkileşiminin olumlu değerlendirmesini sağlayabilir, ancak yüksek verimli taramada uygulanırsa çok zahmetli olabilir. Süreci basitleştirmek için, hasta GBM'nin cerrahi biyopsilerinden kaynaklanan GSC'lerin büyümesini engelleyen potansiyel ilaç kombinasyonlarını hızlı bir şekilde tanımlamak için bir tarama iş akışı geliştirilmiştir. Her ilacın sinerjik etkisini ölçmek için bu yönteme beklenen kombine etkinin ve gözlenen kombine etkinin farkını yansıtan bir duyarlılık Endeksi (SI) getirilmiştir, böylece potansiyel adaylar SI sıralaması ile kolayca tanımlanabilir. Bu arada, bu protokol, 20 küçük moleküler inhibitör arasında GBM tedavisi için birinci basamak kemoterapi olan temozolomid ile anti-glioma etkisini sinerjiye sokabilecek potansiyel aday(lar) tanımlamak için örnek bir ekran göstermektedir.

Protokol

GBM örneği, Nanjing Tıp Üniversitesi İlk Bağlı Hastanesi'nin insan araştırma etik komitesi tarafından tam olarak bilgilendirilmiş onay aldıktan sonra rutin bir operasyon sırasında bir hastadan alındı.

1. Hasta kaynaklı GSC'lerin izolasyonu ve kültürü

1. Cerrahi olarak resected glioblastoma dokusunu steril PBS ile dolu 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin ve bir sonraki operasyona kadar dokuyu buzda saklayın.
2. GBM dokusunu diseksiyon makası kullanarak yaklaşık 0,5 ila 1 mm çapında parçalar halinde kıyma ve biyogüvenlik kabinindeki hücresel kalıntıları gidermek için doku örneklerini nöronal bazal ortamla yıkayın.
3. Doku parçalarını 30 dakika boyunca 37 °C'de 1 mg/mL kollajenaz A ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj ile sindirin.
4. Süpernatantı çıkarın ve peleti boş nöronal bazal ortamla askıya alın ve buza tekrarlayan pipetleme yaparak peleti mekanik olarak ayrıştırın.
5. Karışımı, nörosfer oluşumuna kadar 37 °C'de% 5 CO₂ ve% 90 neme sahip steril bir hücre inkübatöründe GSC kültür ortamıyla dolu ultra düşük ek 6 kuyulu kültür plakalarında (tarif için Tablo 1'e bakın) kültür edin.
6. Yeterli nörosfer oluşumunda, 1,5 mL mikrotüpte bir pipet ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüj kullanarak toplayın.
7. Peletin yeniden kullanılabilir ve birincil GSC'lerin bakımı için yukarıdaki kültür ortamıyla dolu birkaç şişeye bölün.
   NOT: Örnekte kullanılan hasta kaynaklı GSC'ler, WHO sınıf IV tekrarlayan GBM'li 34 yaşındaki bir erkek hastanın cerrahi biyopsilerinden elde edilmiştir. GSC'ler gelecekteki deneyler için XG387 olarak adlandırıldı. Yukarıdaki GSC'ler için mycoplasma kontaminasyon olmadığını doğrulamak için PCR tabanlı mikoplazma testleri yapıldı. Bu protokolde kullanılan GSC'leri içeren tüm deneyler <15 pasajla gerçekleştirildi.

2. Luciferaz etiketli GSC'lerin hazırlanması

1. GSC'leri orta kültürden toplayın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 70 x g'da santrifüj edin.
2. Üstnatantı çıkarın, hücreleri 37 ° C'de 4 dakika boyunca ivme ile sindirin. Hücre peletini ayrıştırmak ve yeniden canlandırmak için 200 μL'lik bir uç ve pipet kullanın.
3. Hücreleri 12 kuyulu bir kültür plakasında kuyu başına 2 x^{10 5} hücreye seyreltin ve hücreleri bir gecede kültüre edin.
4. Plakadaki her kuyuya 30 μL luciferaz-EGFP virüs süpernatantı (titer >10⁸ TU /mL) ekleyin ve ardından hücreleri 25 °C'de 2 saat boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri bir gecede kültüre edin.
5. Ertesi gün ortamı yenileyin ve hücreleri 48 saat daha kültürleyin.
6. GFP pozitif hücrelerinin görünümünü doğrulamak için hücreleri floresan mikroskop altında gözlemleyin.
7. Hücreleri daha fazla kültüre etmek için yüksek GFP floresanlı GSC'leri sıralamak ve seçmek için bir akış hücresi sıralayıcısı kullanın.

3. Hücre canlılığının biyo-lüminesans bazlı ölçümü

1. Hücre dışı matris (ECM) karışımına sahip kaplama plakaları (örneğin Matrigel): Her kuyuya 40 μL 0,15 mg/mL ECM karışımı ekleyin ve plakayı 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Fazla ECM karışımını çıkarın ve PBS ile bir kez hafifçe durulayın.
2. 15.000 içeren 100 μL kültür ortamı ekleyin, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 ve 500 XG387-Luc hücreleri ile birlikte 100 μL boş ortam ve 96 kuyulu optik alt plakada 6'şar kez kontrol ve 37 °C'de bir gecede hücreleri kültüre edin.
3. Süpernatant çıkarın, her kuyuya 150 ng/μL D-luciferin içeren 50 μL kültür ortamı ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
4. IVIS spektrum görüntüleme sistemini kullanarak plakadaki hücresel biyo-lüminesans görüntülerini alın. İlgi alanının (ROI) birden fazla dairesel alanını oluşturmak ve hücresel biyo-lüminesansı ölçmek için yerleşik yazılımı kullanın.

4. Temozolomid tedavisi ve kombinasyon taraması

1. Tedaviden önce yukarıda açıklandığı gibi dört adet 96 kuyu plakası ön kaplama.
2. Tohum XG387-Luc hücreleri 100 μL kültürde 1.000 hücre yoğunluğunda 96 kuyulu optik alt plakanın her kuyusuna orta ve bir gecede hücreleri kültür.
3. Temozolomid ve hedeflenen ajanları stok çözeltisinden önceden hazırlayın. Tek ajanlı tedavi için kültür ortamında 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM ve 50 μM temozolomidden oluşan bir konsantrasyon serisi hazırlayın. Temozolomid ve hedeflenen ajanları kültür ortamında stok çözeltisinde seyrelterek kombinasyon ilaç taraması için 200 μM ve 2 μM nihai konsantrasyonları elde edin (Tablo 2).
4. GSC'lerin çoğu plakaların altına yapışdığında kültür ortamını çıkarın; tedavi başına üç teknik çoğaltma için her kuyuya temozolomid içeren yukarıda hazırlanmış ortamı ekleyin.
5. Temozolomid'i tedavi etmek ve ilaç kombinasyonlarını taramak için boş ortamı çıkarın ve 200 μM temozolomid veya 2 μM hedefli ajan içeren yukarıda hazırlanmış ortamı ekleyin veya tedavi başına üç teknik çoğaltma için her iki kuyuya da bir kombinasyon ekleyin.
6. Tüm plakaları 37 °C'de kuluçkaya yatır, 3 gün boyunca %5 CO2.
7. İlaç içeren ortamı çıkarın, her kuyuya 150 ng/μL D-luciferin içeren 50 μL boş ortam ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
8. IVIS spektrum görüntüleme sistemini kullanarak plakadaki hücresel biyo-lüminesans görüntülerini alın. Birden fazla dairesel ROI oluşturmak ve hücresel biyo-lüminesansı ölçmek için yerleşik yazılımı kullanın.

5. XG387-Luc ve XG328-Luc hücre hatlarında temozolomid ve UMI-77 kombinasyon tedavisi

1. Tedaviden önce yukarıda açıklandığı gibi üç adet 96 kuyu plakası ön kaplama.
2. Tohum XG387-Luc ve XG328-Luc hücreleri sırasıyla 1.000 hücre yoğunluğunda 100 μL kültür ortamı 96-well optik alt plakanın her kuyusuna ve bir gecede hücreleri kültür.
3. 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM'den oluşan bir konsantrasyon serisi hazırlayın, 100 μM, 50 μM ve 0 μM temozolomid ve altıya altı doz titrasyon matrisi tedavileri için kültür ortamında 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM ve 0 μM UMI-77'den oluşan bir konsantrasyon serisi.
4. GSC'lerin çoğu plakanın altına yapışdığında boş ortamı çıkarın; tedavi başına üç teknik çoğaltma için yukarıda hazırlanmış ortamı her kuyuya ekleyin.
5. Bu plakaları 3 gün boyunca 37 °C, %5 CO_2'dekuluçkaya yatır.
6. İlaç içeren ortamı çıkarın; her kuyuya 150 ng/μL D-luciferin içeren 50 μL boş ortam ekleyin ve biyolüminesans ölçümü için hücreleri 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.

6. Veri analizi

1. Şekil 2A'dakiformüle göre temozolomid ve hedeflenen ajanın duyarlılık Endeksi (SI) puanını hesaplayın.
   NOT: SI puanı, başka bir ilacın eklenmesinin etkisini ölçmektir. Temozolomid sinerjik etkileri gösteren pozitif değerlerle -1 ile +1 arasında değişmektedir.
2. Kombine etkileşimlerini analiz etmek için CompuSyn yazılımını kullanarak temozolomid ve UMI-77 arasındaki kombinasyon dizini (CI) değerlerini hesaplayın. CI değeri <1 sinerjiyi gösterir; CI değeri >1 düşmanlığı gösterir.
3. Combenefit yazılımını kullanarak temozolomid ve UMI-77 arasındaki yüksek tek aracı (HSA) değerlerini hesaplayın. HSA değeri kombine inhibitör etkiyi gösterir. HSA değeri >0 sinerjiyi, HSA değeri <0 ise düşmanlığı gösterir.

Sonuçlar

XG387 hücreleri, Tablo 1'de ultra düşük ekli 6 kuyulu bir kültür plakasında veya kaplamasız bir plakada açıklanan kültür ortamında nörosferler oluşturmuştur⁽ Şekil 1A). İlk olarak, XG387-Luc hücrelerinden gelen biyo-lüminesans yoğunluğunun hücre sayısıyla orantılı olup olmadığını kontrol etmek için bir test yapıldı. Şekil 1B'degösterildiği gibi, biyo-lüminesans yoğunluğu hücre yoğunluğu ile orantılı olarak artmış ve arala...

Tartışma

Bu çalışmada, hasta kaynaklı GSC'ler kullanılarak GBM için potansiyel kombinasyon tedavisini tanımlamak için uygulanabilecek bir protokol tanımlanmıştır. Loewe, BLISS veya HSA yöntemleri gibi standart sinerji/ekleme ölçüm modelinin aksine, bir ilaç çiftinin geleneksel yöntemler olarak tam bir faktöryel şekilde birden fazla konsantrasyonda birleştirilmesini gerektirmeyen basit ve hızlı bir iş akışı kullanılmıştır. Bu iş akışında, iki küçük moleküler inhibitörün sinerjik ilaç etkisini ölçmek için siRNA'ların duyarlılık etk...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco		35050061 100X
Nörobazal	Gibco	21103049	1X
Penisilin-Streptomisin	HyClone	SV30010	P: 10.000 birim / ml & nbsp;       S:  10.000 ug/ml
Sodyum Piruvat	Gibco	2088876	100 mM
Tablo 1. İçindekiler  Formülasyon  GSC  tam kültür ortamı.
ABT-737	MCE		Selektif ve BH3 taklitçi  Bcl-2,  Bcl-xL  ve  Bcl-w  inhibitör
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1  inhibitör
Axitinib	MCE		Çok hedefli tirozin kinaz inhibitörü
AZD5991	MCE		Mcl-1  inhibitör
A 83-01	MCE		Güçlü TGF inhibitörü-β tip I reseptör  ALK5 kinaz
CGP57380	Selleck		Potent  MNK1  inhibitör
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-rekabetçi  PI3K  ve  mTOR  inhibitör
Dasatinib	MCE		Dual  Bcr-Abl ve Src ailesi tirozin kinaz   inhibitör
Erlotinib	MCE		EGFR  tirozin kinaz inhibitörü
Gefitinib	MCE		EGFR tirozin kinaz ve nbsp; inhibitör
Linifanib	MCE		Çok hedefli inhibitörü  VEGFR  ve  PDGFR  aile
Masitinib	MCE		İnhibitörü  c-Kit
ML141	Selleck		Rekabetçi olmayan inhibitör  Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Kit, KDR ve CSF-1R 'nin çok hedefli inhibitörü;
Palbociclib	MCE		Seçici  CDK4  ve  CDK6  inhibitör
SB 202190	MCE		Seçici  p38 MAP kinaz  inhibitör
Sepantronyum bromür (YM-155)	MCE		Hayatta Kalma ve nbsp; inhibitör
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitörü
UMI-77	MCE		Seçici   Mcl-1  inhibitör
4-Hidroksitamoksifen (Afimoksifen)	Selleck		Seçici & östrojen reseptörü (ER)  modülatör
Tablo 2. Test ekranında kullanılan 20 hedefli ajanın bilgileri. Bunların hepsi hedef seçici küçük moleküler inhibitörlerdir. Sağlayıcı, isim ve hedefler tabloda verilmiştir.