Escherichia coli, yenidoğan Gram-negatif bakteriyel menenjitin önde gelen nedenidir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında, nötrofiller tarafından üretilen reaktif oksijen türleri önemli bir bakterisidal rol oynar. Burada, menenjit E. coli'yeyanıt olarak nötrofillerdeki reaktif oksijen türlerini tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Escherichia coli (E. coli) yenidoğan menenjite neden olan en yaygın Gram-negatif bakteridir. Kan-beyin bariyeri yoluyla bakteriyemi ve bakteriyel penetrasyon oluşumu E. coli menenjit gelişimi için vazgeçilmez adımlardır. Reaktif oksijen türleri (ROS), istila edilen patojenleri yok etmek için nötrofillerin başlıca bakterisidal mekanizmalarını temsil eder. Bu protokolde, meningitik E. coli ile enfekte olan nötrofillerde zamana bağımlı hücre içi ROS üretimi, gerçek zamanlı bir floresan mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen floresan ROS probları kullanılarak ölçüldü. Bu yöntem, patojen konak etkileşimleri sırasında memeli hücrelerinde ROS üretiminin değerlendirilmesine de uygulanabilir.
Giriş
Yenidoğan bakteriyel menenjit yaygın bir pediatrik bulaşıcı hastalıktır. Bir K1 kapsülü ile Escherichia coli (E. coli), yenidoğan bakteriyel menenjite neden olan en yaygın Gram negatif patojendir ve toplam insidansin yaklaşık% 80'ini oluşturur1,2,3. Antimikrobiyal kemoterapi ve destekleyici bakımdaki gelişmelere rağmen, bakteriyel menenjit hala yüksek morbidite ve mortalite ile en yıkıcı durumlardan biridir4.
Yenidoğan bakteriyel menenjitin oluşumu genellikle patojenik bakterilerin yenidoğanların lokal lezy....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu araştırmada uygulanan gönüllülerden alınan periferik kan, ilk Çin Tıp Üniversitesi Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (#2020-2020-237-2).
1. Reaktiflerin ve kültür ortamının hazırlanması
- Kırmızı kan hücresi liziz tamponunu 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO 3 ,37,2mg Na2EDTA'yı 1 L çift damıtılmış suya ekleyerek hazırlayın ve pH'ı 7,2-7,4'e ayarlayın. 0,22 μm filtreler kullanarak bakteriyi filtrasyonla çıkarın.
- RPMI 1640 ortamına %5 fetal sığır serumu ekleyerek nötrofiller için deneysel kültür ortamı hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına dengeyi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu makalede özetlenen protokol kullanılarak, nötrofiller insan periferik kanından izole edildi ve E44 enfeksiyonuna yanıt olarak ROS seviyelerinin değişikliklerini tespit etmek için floresan probu DHE ile yüklendi. Burada, bir mikro plaka okuyucu tarafından gerçek zamanlı olarak belirlenen E44 suşu tarafından uyandırılan ROS üretimini gösteren temsili veriler sunuyoruz. 100 MOI'de E44 suşları eklenerek, ROS seviyeleri hemen arttı ve zamana bağlı bir şekilde sürekli bir yükseliş eğilimi gösterdi (Şeki.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Nötrofiller, insan kan dolaşımındaki beyaz kan hücrelerinin en bol bileşeni olarak işlev görür. Patojenlerin istilasına karşı ilk savunma hattını oluşturan doğuştan gelen insan bağışıklık sisteminde önemli efektör hücrelerdir11. ROS'un üretimi, fagositoz11'itakiben nötrofillerin önemli bakterisidal mekanizmalarından birini temsil eder. Son çalışmalar, nötrofil hücre dışı tuzak (NET) adı verilen bir nötrofil tarafından salınan net benzeri bir yapının bakteri öldürme işlemi
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarlar veya diğer çıkar çatışmaları beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31670845, 31870832, 32000811) ve Liaoning Eyaleti Seçkin Profesör Programı (LJH2018-35) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 15 mL polipropilen konik santrifüj tüpleri | KIRGEN | KG2611 | |
| 96 oyuklu plaka | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Otomatik hücre sayacı | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biyolojik Güvenlik Karabina | Şangay Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Beyin kalp infüzyonu | BD | 237500 | |
| CD16 Mikro boncuklar, insan | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Santrifüj | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Sütunları | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihidroetidyum (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal sığır serumu | Cellmax | SA211.02 | |
| İnkübatör | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS ayırma tamponu | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mikroplaka Okuyucu | Moleküler Cihazlar | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS ayırma Ünitesi | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampisin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 orta | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Termostatik çalkalayıcı | Şangay Zhicheng | ZWY-100D | |
| Tripton | OXOID | LP0042 | |
| Maya özü | OXOID | LP0021 |
Kaynaklar
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11(2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
