Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Deniz Örneklerinde Toplam Lipid ve Lipid Sınıflarının Belirlenmesi

4.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62315

⸱

11 Aralık 2021

 , 
1Department of Ocean Sciences and CREAIT Network, Memorial University of Newfoundland

Bu makalede

Özet

Bu protokol deniz suyu ve biyolojik örneklerde lipitlerin belirlenmesi içindir. Filtratlardaki lipitler, katı madde durumunda kloroform veya kloroform ve metanol karışımları ile çıkarılır. Lipid sınıfları, alev iyonizasyon tespiti ile çubuk ince katmanlı kromatografi ile ölçülür ve toplam lipit içeriği verir.

Özet

Lipitler büyük ölçüde karbon ve hidrojenden oluşur ve bu nedenle dendeki diğer organik makromoleküllerden daha fazla spesifik enerji sağlar. Karbon ve hidrojen bakımından zengin olmaları aynı zamanda hidrofobiktir ve organik kirleticiler için bir çözücü ve emilim taşıyıcısı olarak işlev görür ve böylece deniz ekosistemlerinde kirletici biyoakümülasyonun sürücüleri olabilir. Hidrofobik doğaları deniz suyundan veya biyolojik örneklerden izolasyonlarını kolaylaştırır: deniz lipit analizi, kutupsal olmayan organik çözücülerde örnekleme ve daha sonra ekstraksiyon ile başlar ve su matrislerindeki diğer maddelerden ayrılmaları için uygun bir yöntem sağlar.

Deniz suyu örneklenmişse, ilk adım genellikle filtrasyon yoluyla operasyonel olarak tanımlanmış 'çözünmüş' ve 'partikül' fraksiyonlara ayrılmayı içerir. Numuneler toplanır ve lipitler tipik olarak gerçekten çözünmüş madde ve kolloidler için kloroform ve katı maddeler ve biyolojik örnekler için kloroform ve metanol karışımları ile numune matrisinden izole edilir. Bu tür özler biyojenik ve antropojenik kaynaklardan birkaç sınıf içerebilir. Şu anda total lipitler ve lipit sınıfları belirlenebilir. Total lipid, geleneksel olarak kromatografik olarak ayrılmış olan ayrı ayrı belirlenmiş lipit sınıflarının toplanabilir. Deniz örneklerinden elde edilen lipitlerin nicel analizi için alev iyonizasyon algılamalı (FID) ince katmanlı kromatografi (TLC) düzenli olarak kullanılmaktadır. TLC-FID, sinoptik lipid sınıfı bilgilerini ve sınıfları özetleyerek toplam lipid ölçümünü sunmaktadır.

Lipid sınıfı bilgileri, lipid özlerinden salındıktan sonra, yağ asitleri ve / veya steroller gibi bireysel bileşenlerin ölçümleriyle birleştirildiğinde özellikle yararlıdır. Çok çeşitli lipit yapıları ve işlevleri, ekosistem sağlığını ve antropojenik etkilerin etki derecesini değerlendiren ekolojik ve biyojeokimyasal araştırmalarda yaygın olarak kullanıldığı anlamına gelir. Deniz faunasına (örneğin, aquafeeds ve/veya av) diyet değerine sahip maddeleri ölçmek ve su kalitesinin bir göstergesi olarak (örneğin, hidrokarbonlar) istihdam edilmiştir.

Giriş

Burada açıklanan yöntemler, operasyonel olarak deniz lipitleri olarak tanımlanan maddelerle ilgilidir. Bu tanım, polar olmayan organik çözücülerde sıvı-sıvı ekstraksiyonuna uygun olmalarına dayanır ve su matrislerindeki diğer maddelerden ayrılmaları için uygun bir yöntem sağlar. Hidrofobik doğaları, deniz suyundan veya biyolojik örneklerden izole edilmelerini, zenginleşmelerini ve tuz ve proteinlerin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır.

Lipit içeriğinin ve deniz organizmalarındaki bileşiminin ölçülmesi, on yıllardır gıda ağı ekolojisi, su ürünleri beslenmesi ve gıda biliminde büyük ilgi çekmektedir. Lipitler, canlı organizmalarda evrensel bileşenlerdir, hücre zarlarında temel moleküller olarak hareket eder, biyoyararlanımlı enerjinin ana kaynakları olarak, ısı yalıtımı ve yüzdürme sağlar ve sinyal molekülleri olarak hizmet eder. Diğer alanlarda lipit belirleme prosedürleri iyi tanımlanmış olsa da, deniz örnekleriyle kullanımları genellikle alan koşullarına ve örnek tip1'euyum sağlamak için değişiklik gerektirir.

Deniz suyu numuneleri için, ilk adım genellikle normalde filtrasyon yoluyla operasyonel olarak tanımlanmış 'çözünmüş' ve 'partikül' fraksiyonlara ayrılmayı gerektirir (Protokol adım 1). Partikül fraksiyonu filtre tarafından tutulan şeydir ve gözeneklerin boyutu kesme2'yitanımlamada önemlidir. Genellikle partikül madde örneklemesi yaparken, lipit konsantrasyonlarını toplam kütle konsantrasyonlarıyla ilişkilendirmek isteriz, bu durumda bu amaç için ayrı, daha küçük, örnek (örneğin, 10 mL) alınmalıdır (Protokol adım 1, not). Doğru bir kütle tayini elde etmek için filtrasyonun sonuna amonyum format (35 g/L) eklemek önemlidir.

Daha büyük numuneden elde edilen deniz suyu filtratı, numune tipine bağlı olarak 250 mL ile 1 L arasında olmalıdır ve ayrık bir hunide sıvı-sıvı ekstraksiyona tabi tutulur (Protokol adım 2). Lipitlerin hidrofobik doğası, kloroform gibi kutupsal olmayan bir çözücüde ekstraksiyon ile diğer bileşiklerden ayrılabilecekleri anlamına gelir. Suda çözünür bileşenler sulu tabakada kalırken lipitlerin organik tabakaya bölündüğü iki katmanlı bir sistem oluşturulur.

Bir filtre üzerindeki partikül numuneler veya biyolojik numuneler, kloroform içeren değiştirilmiş bir Folch ve ark. ekstraksiyonu3ile çıkarılır (Protokol adım 3). Yine, lipitlerin organik faza bölündüğü, suda çözünür moleküllerin sulu fazda kaldığı ve proteinlerin çöktüğü organik/sulu bir sistem oluşturulur. Aslında, katılar için, çoğu laboratuvar kloroform ve metanol içeren Folch ve ark. ekstraksiyon3 prosedürünün bazı varyasyonlarını kullanır. Filtreler için ilk adım 2 mL kloroform ve 1 mL metanol homojenize etmektir.

Ekstraksiyon sırasında, ester bağı hidrolizini veya karbon-karbon çift bağ oksidasyonunu azaltmak için numuneleri ve çözücüleri buz üzerinde tutarak lipitleri kimyasal veya enzimatik modifikasyondan korumaya özen edilmelidir. Dokular ve hücre lipitleri doğal antioksidanlar ve bölümlere ayırma ile oldukça iyi korunur4; bununla birlikte, örneklerin homojenizasyonunu takiben, hücre içeriği, lipitleri kimyasal veya enzimatik olarak değişime daha fazla atılır. Çoğu sterol gibi bazı lipitler çok kararlıdır, çoklu doymamış yağ asitleri içerenler gibi diğerleri ise kimyasal oksidasyona daha duyarlıdır. Konjuge çift bağlı steroller gibi diğerleri, ışık5ile katalİze edilen oksidasyona eğilimlidir. Ekstraksiyonlardan sonra, lipitler kimyasal oksidasyona karşı çok daha hassastır ve numuneler azot gibi inert bir gaz altında saklanmalıdır. Özleri konsantre etmek için yumuşak bir azot akışı da kullanılır.

Konsantrasyondan sonra, lipitler normalde karbonhidrat ve proteinlerin kJ / g'sinden daha fazla, yüksek konsantrasyonda enerji sağlayan deniz ekosistemlerinin önemli bir bileşeni oldukları için toplu olarak ölçülür. Her zaman bireysel bileşenler olarak ölçülecektir: lipitlerin kapsamlı analizi genellikle kimyasal doğalarına göre daha basit kategorilere ayrılmayı içerir. Bu nedenle, tam bir analiz toplam lipitlerin, lipit sınıflarının ve bireysel bileşiklerin ölçülmesini içerir.

Total lipit, kromatografi ile ayrılmış bireysel ölçülen lipit sınıflarının toplamı alınarak belirlenebilir6. Bir deniz lipit özü biyojenik ve antropojenik kaynaklardan bir düzineden fazla sınıf içerebilir. Lipid yapılarının çok çeşitliliği, yapıların bireysel gruplandırmalarının belirlenmesiyle çok fazla bilgi kazanılması anlamına gelir. Lipid sınıfları bireysel olarak veya belirli gruplarda, belirli organizma türlerinin varlığının yanı sıra fizyolojik durumlarını ve aktivitelerini belirtmek için kullanılmıştır2. Ayrıca, çözünmüş organik madde (DOM) ve hidrofobik kirleticiler de dahil olmak üzere organik malzemenin kökenlerinin bir göstergesi olarak kullanılmıştır.

Triyasikalseroller, fosfolipidler ve steroller daha önemli biyojenik lipit sınıfları arasındadır. İlk ikisi biyokimyasal olarak ilişkilidir, çünkü iki veya üç yağ asidinin estere olduğu gliserol omurgasına sahiptirler (Şekil 1). Triacylglycerols, balmumu esterleri ile birlikte çok önemli depolama maddeleridir, diyalsikalseroller, serbest yağ asitleri ve monoacylglycerols gibi diğer yağ asidi içeren lipit sınıfları genellikle küçük bileşenlerdir. Doymamış olanlar toksik olabileceği için, canlı organizmalarda daha düşük konsantrasyonlarda serbest yağ asitleri bulunur7. Steroller (hem özgür hem de esterleşmiş formlarında) ve yağlı alkoller de daha az polar lipitler arasında yer alırken, glikolipidler ve fosfolipidler polar lipitlerdir. Polar lipitler, hücre zarlarında bulunan lipid bilayerlerinin oluşumunu sağlayan hidrofilik bir gruba sahiptir. Serbest steroller aynı zamanda membran yapısal bileşenleridir ve triyasiller oranında alındığında, yaygın olarak kullanılan bir durum veya beslenme indeksi (TAG : ST) sağlarlar8. Fosfolipidlere (ST : PL) oranla alındığında, tuza karşı bitki hassasiyetini belirtmek için kullanılabilirler: daha yüksek değerler yapısal bütünlüğü korur ve membran geçirgenliğini azaltır9. Bu oranın tersi (PL : ST) sıcaklık adaptasyonu sırasında bivalve dokularda çalışılmıştır10.

Deniz lipid sınıfları silika jel kaplı çubuklar üzerinde ince katmanlı kromatografi (TLC) ile ayrılabilir (Protokol adım 4) ve daha sonra otomatik bir FID tarayıcıda alev iyonizasyon tespiti (FID) ile tespit edilebilir ve ölçülebilir. TLC/FID, küçük örneklerden sinoptik lipit sınıfı verilerini hızla sağladığı için ve tüm sınıfların toplamını alarak, toplam lipitler için bir değer olan deniz numuneleri için rutin olarak kullanılır hale gelmiştir. TLC/FID kalite güvence (QA) değerlendirmesine tabi tutulmuştur ve tutarlı harici kalibrasyon, düşük boşluklar ve hassas çoğaltma analizi11için gerekli standartları karşılar. Değişim katsayıları (CV) veya göreli standart sapmalar% 10 civarındadır ve FID tarayıcı toplam lipid verileri normalde gravimetrik ve diğer yöntemlerle elde edilenlerin yaklaşık%90'ıdır 2. Gravimetri, FID tarayıcısının yalnızca uçucu olmayan bileşikleri ölçmesi ve ayrıca lipid olmayan malzemenin gravimetrik ölçümlere dahil edilmesinin olası bir sonucu olarak daha yüksek toplam lipitler verir.

Lipid sınıf analizi tarafından sağlanan bilgiler, özellikle yağ asitlerinin birey veya sterol veya ikisi olarak belirlenmesiyle birleştirildiğinde yararlıdır. Bu analizlere yönelik ilk adım, lipit özlerindeki sterollerle birlikte tüm bileşen yağ asitlerinin salınır (Protokol adım 5). Çok çeşitli lipit yapıları ve işlevleri, ekosistem sağlığını ve antropojenik ve karasal girdilerden ne ölçüde etkilendiklerini değerlendiren ekolojik ve biyojeokimyasal çalışmalarda geniş kullanım gördükleri anlamına gelir. Diyet değeri olan maddelerin deniz faunasına biyosentezini ölçmek ve su örneklerinin kalitesini belirtmek için kullanılmıştır. Tortu çekirdek örneklerinde lipitlerin ölçülmesi, tortuların kara-deniz marjına yakın insan arazisi kullanımındaki değişikliklere duyarlılığını göstermeye yardımcı olur.

Bireysel lipit bileşiklerini tanımlamak ve ölçmek için birincil araç geleneksel olarak FID ile gaz kromatografisi (GC) olmuştur. Ancak analizden önce, bu bileşikler türetme ile daha uçucu hale getirilir. Yağ asitleri, akil lipit sınıflarından asidik bir katalizör (H2SO4)varlığında salınır (Şekil 1). Organik kimyada, akil grubu (R-C=O) genellikle karboksilik asitten (R-COOH) türetilir. Daha sonra GC sütunlarında daha iyi ayrımlar sağlayan yağ asidi metil esterlerine (FAME) yeniden esterlenirler (Protokol adım 5).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Lipit analizleri için cam eşyaları, aletleri ve filtreleri temizlemek için metanol ile 3 kez yıkayın, ardından kloroform ile 3 yıkama veya en az 8 saat boyunca 450°C'ye ısıtın.

1. Deniz suyunun çözünmüş ve partikül lipitleri için filtrasyon prosedürü

NOT: Faizin belirli bir kısmı filtrasyon prosedürü tarafından operasyonel olarak tanımlanır. Bu durumda gözenek boyutu 1.2 μm'dir.

  1. Filtrasyon manifoldunu filtresiz kurun ve kurulumu filtrelenmiş deniz suyu ile durulayın.
  2. Temiz tokmalar kullanarak, yıkanmış 47 mm cam elyaf (GF/C) filtresini temiz filtrasyon sistemine yerleştirin.
  3. Örneği alın ve toplama kabının altına yerleşmiş olabilecek herhangi bir malzemeyi yeniden depolamak için hafifçe döndürün. Bilinen bir birimi doğru bir şekilde ölçün, bu durumda 1 L ve bunu filtreden geçirin.
    NOT: Hacim, numunedeki partikül malzeme miktarına bağlı olacaktır: mevsime ve konuma bağlı olarak genellikle 250 mL ile 5 L arasındadır.
  4. Numune ölçüldüğünde, filtreyi filtrelenmiş deniz suyu ile hafifçe ıslatın. Numunenin tamamını filtrasyon sistemine yavaşça ekleyin ve tüm parçacıkların filtreye eklenmesini sağlamak için dereceli silindiri filtrelenmiş deniz suyu ile durulayın. Tüm parçacıkların filtreye durulanmasını sağlamak için kurulumu yanlarda filtrelenmiş deniz suyu ile durulayın.
    1. Tüm deniz suyunun filtreden geçmesine izin verin, ancak filtredeki hücreleri bozabileceğinden filtrenin tamamen kurumasına izin vermeyin; son su kayboldukça emmeyi kırın.
  5. Temiz bir tokmak ve temiz bir pipet kullanarak, filtreyi bir tüpe yuvarlamak için önce ikiye, sonra üçte bire ve sonra yarı uzunlamasına katlayın. Temiz, etiketli 10 mL cam şişeye yerleştirin.
  6. Filtreyi 2 mL kloroformla örtün. Baş boşluğunu nitrojenle doldurun ve PTFE bandı ile kapatın. -20 °C dondurucuda bir rafa yerleştirin. Numuneler bu sıcaklıkta bir yıla kadar stabil olacak.
    NOT: Lipit konsantrasyonlarını toplam kütle konsantrasyonları ile ilişkilendirmek için kuru ağırlık ölçümüne de ihtiyaç vardır. Bu, 24 mm önceden tartılmış bir filtreyi kuru ağırlık filtrasyon kurulumuna koymayı, numuneyi karıştırmayı ve küçük filtreye filtrelenmiş küçük bir alt örneklemeyi içerir. Filtre neredeyse kurudığında, filtreye yaklaşık 10 mL% 3.5 amonyum formatında eklenir. Filtre ikiye katlanır, etiketli bir Petri kabına geri döndürülür ve bir dondurucuya yerleştirilir.

2. Deniz suyu veya sıvı numunelerinin sıvı-sıvı ekstraksiyonu

  1. Örneği hazırlama
    1. Bilinen bir filtrat hacmini lipid temiz cam mezunu bir silindire ölçün. Bu örneği temiz bir 1 L ayırıcı huni içine yerleştirin. Daha sonra numuneye 20 mL kloroform ekleyin ve sık sık aylak alıkonarak 2 dakika çalkalayın.
  2. İlk ayırmadan sonra ilk özün çıkarılması ve asit eklenmesi
    1. Huniyi alüminyum folyoya sarın ve ayırmanın gerçekleşmesi için 5 ila 10 dakika bekleyin. İki katmanı görmek için folyonun altını soyun. Alt, organik tabakayı stopcock boyunca temiz yuvarlak bir dipli şişeye toplayın, üst tabakanın hiçbirini içermemeye dikkat edin. Yuvarlak tabanlı şişeyi azot altına yerleştirin ve dondurucuya yerleştirin.
    2. Her bir numune litresi için0,25mL konsantre H 2 SO4 ekleyin, ayırıcı hunideki örneğe ekleyin ve huniyi hafifçe sallayın.
    3. 10 mL kloroform ekleyin ve sık sık havalandırma yaparken 2 dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. Ayrılığın gerçekleşmesine izin verin.
  3. İkinci ve üçüncü ayrılıklar
    1. Ayrımı bekleyin ve alt katmanı yuvarlak dipli şişeye ekleyin.
    2. Üçüncü bir 10 mL kloroform ekleyin ve tekrar sık sık alıkonun, 2 dakika çalkalayın. Ayırmadan sonra, alt katmanı yuvarlak dipli şişeye ekleyin.
    3. Yuvarlak tabanlı şişedeki özü bir döner evaporatöre aktarın, buharlaştırın ve 2 mL'lik bir şişeye aktarın.

3. Katı maddeler için ekstraksiyon protokolü (modifiye Folch ve ark.3 ekstraksiyon)

  1. Kurulum
    NOT: Ekstraksiyon kurulumu buzla dolu yalıtımlı bir kap gerektirir. Çözücüler metanol, kloroform çıkarılmış su ve 2:1 kloroform:metanol içerir. Tüm çözücüler, ekstraksiyonlar başladığında soğuk olacak şekilde buza yerleştirilmelidir. Örnekler de buza gider, böylece her şey soğuk kalır.
    1. Tüm tüpleri ve PTFE astarlı kapakları 3 kez metanol ve ardından 3 kez kloroform ile durulayın. Her ekstraksiyon için bir santrifüj tüpü ve kapaklı bir 15 mL şişe gereklidir.
    2. Numuneyi 2 mL kloroform içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Örneğin büyüklüğü, mevcut lipit miktarına bağlıdır, yaklaşık 5 ila 10 mg lipit tercih edilir.
  2. Taşlama ve ekstraksiyon
    1. Yaklaşık 1 mL buz gibi metanol ekleyin ve numuneyi temiz bir homojenizatör veya PTFE/ metal uçlu çubukla hızlı bir şekilde bir hamur haline getirin.
    2. Çubuğu yaklaşık 1 mL buz gibi 2:1 kloroformla tüpe geri yıkayın: metanol ve ardından 1/2 mL buz gibi kloroform ekstraktlı su ile. Gerekirse, yıkamadan önce parçacıkları şişeye geri zorlamak için temiz bir küme toka kullanın. Tüpü kaplayın ve karışımı ultrasonik bir banyoda (35 - 42 kHz) 4 dakika boyunca sonicate yapın.
  3. Çift pipetleme:Numuneyi 1800 × g'da2 dakika santrifüj. Ampulü gevşek bir şekilde açık olan 5 3/4" pipetlerin iki katmandan hafifçe itilirken, ampulü sıkarak kabarcıkların çıkmasına neden olduğu çift pipetleme tekniğini kullanarak tüm organik tabakayı (alt katman) toplayın.
    1. İkinci katmanın altına ulaşıldığında, organik tabakayı pipete çekmeden ampulü çıkarmak için başparmağı kullanın. 5 3/4" birin içine 9" pipet yerleştirin ve alt katmanı 5 3/4" pipetten çıkarın.
    2. Özü temiz bir şişeye yerleştirin. Hepsi kaldırılana kadar alt katmanı çıkarmaya devam edin.
  4. Pipetlerin yıkanması: Pipetlerin dışını yıkamak için 1,5 mL buz gibi kloroform ve içini yıkamak için 1,5 mL kullanarak 9" pipetleri organik tabakayı içeren şişeye durulayın. Yıkarken pipeti hafifçe çevirin ve tüm kloroformun pipetten şişeye doğru akmasını sağlamak.
    1. 5 3/4" pipetini sulu tabakayı içeren tüpe aynı şekilde durulayın.
  5. Her seferinde yeni pipetler kullanarak, ayrıldığında numuneleri ve çift pipetleri sonicate ve santrifüj. En az üç kez tekrarlayın ve tüm organik katmanları birleyin. Organik tabakayı üçüncü kez çıkardıktan sonra, her iki pipet de organik tabakayı içeren şişeye yıkayın.
  6. Hafif bir azot akışı kullanarak, hacme kadar konsantre olun, ardından PTFE bandı ile kapatın ve bir dondurucuda saklayın.

4. Deniz lipit sınıflarının çubuk TLC ayrımı için sistemler ve adımlar geliştirmek

  1. ÇUBUKLARIN TLC için hazırlatır
    1. Otomatik FID tarayıcıdaki çubukları üç kez boş tarama
    2. Bir numuneyi tespit etme: Menşein altındaki veya hemen altındaki çubuklara şırınna ile numuneler ve standartlar uygulayın. 0,5 μL dağıtın ve damlayı çubuğa dokunun. Bir sonraki damlayı aynı noktaya yerleştirmeden önce kurumaya bırakın. Tüm örnekleri çubuklar üzerinde bir çizgide tespit edin.
    3. Asetonda odaklama: Numuneleri 70 mL asetonda iki kez (numuneler çok konsantreyse üç kez) odaklayın. Noktanın altı üst kısımla birleşene kadar çubukta tırmanırken çözücü ön tarafına dikkat edin. Çubukları çıkarın, yaklaşık 5 s kurutun, ardından çubuğun altına yakın dar bir lipit malzemesi bandı üretmek için prosedürü tekrarlayın.
    4. Çubukları kurutun ve 5 dakika boyunca sabit bir nem odasında koşullayın. Sabit bir nem odası, plakanın altında doymuş bir kalsiyum klorür çözeltisine sahip bir kurutucudur.
  2. İlk kromatograma giden dizi (ketona hidrokarbon)
    1. İlk geliştirme sistemi: İlk geliştirme sistemi heksane:dietil eter:formik asit, 98.95:1:0.05'tir. Formik asidi eklemek için bir şırınna kullanın, ancak önce şırınd 3× formik asitle durulayın. Formik asidi hemen ardından şırınnadan kloroform ile durulayın. Kağıdı ıslatmak ve tankı durulamak için karışımın 30 mL'lik kısmını kullanın. Durulama çözeltisini atın ve kalan 70 mL'yi tanka ekleyin.
      1. Rafları alın ve yavaşça tanka diriltin. Çözücü ön örnek noktalara ulaşana kadar izleyin, ardından zamanlayıcıyı başlatın. 25 dakika sonra, çubukları geliştirme odasından çıkarın, sabit nem odasında 5 dakika kurutun ve aynı çözeltide 20 dakika daha yeniden geliştirin.
    2. Çubukları otomatik FID tarayıcıda 5 dakika kurutun ve ardından 25 PPS taraması kullanarak keton zirvesinin arkasındaki en düşük noktaya kadar tarayın.
  3. İkinci kromatograma giden sıra (triacylglycerol'den diacylglycerol'e):
    1. Çubukları sabit nem odasında 5 dakika koşullandırılmıştır.
    2. İkinci geliştirme sistemi: İkinci geliştirme sistemi heksane:dietil eter:formik asit, 79:20:1'dir. Kağıdı ıslatmak ve tankı durulamak için geliştirme tankına ~30 mL ekleyin. Daha sonra çubukları kalan 70 mL'de 40 dakika boyunca atın ve geliştirin. TAG (doymuş) ve TAG (çoklu doymamış) tepeler arasındaki en iyi ayrım için 79.9:20:0.1 karışımını kullanın, ancak ST ve DAG tepelerinin ayrılması için 79:20:1 karışımını kullanın.
    3. PPS taraması 11 kullanarak ikinci bir kısmi taramada diacylglycerol zirvesinin arkasındaki en düşük noktaya kurutun ve tarayın.
  4. Üçüncü kromatograma giden dizi (aseton-mobil polar lipid ve fosfolipid)
    1. Çubukları sabit nem odasında 5 dakika koşullayın.
    2. Çubukları 70 mL asetonda 15 dakika boyunca iki kez geliştirin. Gelişmeler arasında çubukları yaklaşık 30 saniye boyunca kurutun.
    3. Çubukları sabit nem odasında 5 dakika koşullayın.
    4. Üçüncü geliştirme sistemi: Üçüncü geliştirme sistemi kloroform, metanol ve kloroform eklenmiş su karışımıdır, 50:40:10. Çubukları karışımın 70 mL'sinde 10 dakika boyunca iki kez geliştirin. Gelişmeler arasında, çubukları yaklaşık 30 saniye boyunca havayla kurutun.
    5. Çubukların tüm uzunluğunu kurulayın ve tarayın.

5. MeOH'da H2SO4 ile ŞÖHRET türetme

  1. Hilditch reaktifini yapma
    1. Metanol hazırlama: Temiz bir hacimsel şişeye 100 mL MeOH yerleştirin ve ardından şişenin altı kaplanana kadar susuz NaSO4'e hafifçe serpin. Kaplandıktan sonra, metanoldeki herhangi bir suyun NaSO4tarafından emilebilmesi için iki kez ters çevirin. Ters çevirip salladıktan sonra, en az 5 dakika bekletin.
    2. Asit ekleme: Metanol yavaşça bir cam kavanoz içine dekonjeans (şimdiye kadar NaSO4 şişenin dibinde sert bir yumrudur) ve H2SO4 eklenir. Yavaşça bir pipet kullanarak metanol içine 1.5 mL sülfürik asit ekleyin. Bir seferde birkaç damla ekleyin ve tüm asit eklendikten sonra, kapak ve karıştırmak için hafifçe karıştırın. Çözüm artık türev ürünler için kullanılmaya hazırdır, ancak haftalık olarak yapılmalıdır.
  2. Türevleri yapmak
    1. Hacmi bilinen bir miktara kadar getirmiş bir özü şişesinden yaklaşık 200 μg lipitleri temiz, 15 mL şişeye aktarın ve azot altında kurumaya buharlaşın. Çıkarılan miktar, numunenin TLC/FID'den konsantrasyonuna göre belirlenecektir. Örneği çıkarmak için temiz bir pipet kullanın.
    2. Numune kuruduğunda, 1,5 mL diklorometan ve yeni yapılan Hilditch reaktifinin 3 mL'si ekleyin.
    3. Örneği vortex ve cam şişeye yapışmış lipitleri çıkarmak için 4 dakika boyunca ultrasonik bir banyoda sonicate. Şişeyi azot, kapakla doldurun ve 100 °C'de PTFE bant ve ısı ile 1 saat boyunca kapatın.
  3. Reaksiyonu durdurma
    1. Numunelerin fırından çıkarıldıktan sonra 10 dakika boyunca oda sıcaklığına tamamen soğumasını bekleyin, ardından şişeleri dikkatlice açın.
    2. Yavaşça yaklaşık 0,5 mL doymuş sodyum bikarbonat çözeltisi (9 g/100 mL kloroform ekstraktlı su), ardından 1,5 mL heksam ekleyin. Şişeyi sallayın veya girdaplayın, ardından 2 katmana ayıracak şekilde bekletin.
  4. FAME'leri toplamak
    1. Üst tabakanın çıkarılması: Derivatizasyon durdurulduktan ve net bir ayırma olduğunda, üst, organik fazı çıkarın ve bir lipid temiz 2 mL şişeye yerleştirin.
    2. 2 mL'lik şişedeki çözücüyü kurumaya buharlaştırın ve heksan ile yaklaşık 0,5 mL'ye doldurun.
    3. Şişenin baş boşluğunu azot, kapakla doldurun ve şişeyi PTFE bandı ile kapatın, yağ asitlerini yeniden askıya almak için 4 dakika daha sonicate yapın ve ardından GC'ye gitmeye hazırdır.
      NOT: Yağ asidi konsantrasyonları gerekiyorsa, sulu tabaka heksan ve tüm organik tabakalar 2 mL şişeye birikmiş olarak üç kez yıkanmalıdır. Bu, 2 mL hekzan eklemeyi, numuneyi girdaplamayı, santrifüjüjü ve organik tabakayı çıkarmayı içerir, hepsi 3 kez tekrarlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

En hızlı büyüyen gıda üretim sektörü olan su ürünleri, değişen gereksinimleri karşılayacak teknolojik yenilikler ve adaptasyonlar açısından gelişmektedir. Bunlardan biri, birçok su ürünleri türü için yem bileşenleri sağlayan yabani kaynaklı balık unu ve balık yağına bağımlılığı azaltmaktır. Karasal bitki yağları, su beslemelerinde balık yağının sürdürülebilir ve ekonomik yedekleri olarak araştırılmaktadır ve karaciğer, lipid metabolizmasının birincil bölgesi olduğu için analiz için bir hedef dokudur12

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

TLC-FID sisteminin küçük örneklerden sinoptik lipid sınıfı bilgileri sağlama hızı, TLC-FID'yi daha ilgili analitik prosedürler üstlenmeden önce deniz örneklerini taramak için mümkün bir araç haline getirir. Bu tür analizler genellikle lipid özlerinden bileşen bileşiklerinin salınmasını ve gaz kromatografisi durumunda volatiliteyi artırmak için derivatizasyon gerektirir. GC-FID ile birlikte TLC-FID'nin deniz ürünleri ve diğer gıda maddelerinin özleri için güçlü bir kombinasyon olduğu bulunmuştur14....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların rakip finansal çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, C.C. Parrish'e 105379 Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) hibe numarası tarafından finanse edildi. Memorial Üniversitesi'nin Temel Araştırma Ekipmanları ve Enstrüman Eğitimi (CREAIT) Ağı bu yayının finansesine yardımcı oldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 ml şişelerVWR66009-560
1-hekzadekanolSigma258741-1G
1-Monopalmitoil-rak-gliserolSigmaM1640-1g
2 ml şişelerVWR46610-722
25 mm cam elyaf filtrelerFisher09 874 32A
2ml pipet ampulleriVWR82024-554
47 mm cam elyaf filtrelerFisher09 874 32
5 3/4" pipetlerFisher1367820A
9" pipetlerFisher1367820C
AsetonVWRCAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890Agilent
Kalsiyum Klorür ANHS 500gmVWRCACX0160-1
2 ml'lik şişeler için kapaklarVWR46610-712
kloroformVWRCACX1054-1
Kolesteril palmitatSigmaC6072-1G
Chromarod S5Shell USA3252
DiklorometanVWRCADX0831-1
DL-a-fosfatidilkolin, dipalmotoylSigmaP5911-1g
Etil Eter, ACS sınıfı anhidr 4LVWRCAEX0190-4
Gliseril tripalmitatSigmaT5888-100MG
Hamilton Şırınga 702SNR 25 & mikro; lSigma58381
HelyumHava SıvısıA0492781
HekzanVWRCAHX0296-1
Hidrojen regülatörüVWR55850-484
Iatroscan MK6Shell USA
KimwipesFisher066662
Tıbbi HavaHava SıvıA0464563
Orta nitril eldivenFisher191301597C
Nitril eldiven LVWRCA82013-782
AzotHava SıvıA0464775
Azot RegülatörüVWR55850-474
AdekanOlmayan Sigma74158-1G
Palmitik asitSigmaP0500-10G
Tekrarlayan dağıtıcıSigma20943
Sodyum Bikarbonat 1kgVWRCA97062-460
Sodyum Sülfat Anhy ACS 500grVWRCA71008-804
Sülfürik asitVWRCASX1244-5
Teflon bantFisher14610120
doku ustası 125 115V w/7mm homojenatörOMNI InternationalTM125-115
TLC geliştirme tankıShell USA3201
UHP hidrojenHava SıvısıA0492788
VWR solvent repippetterVWR82017-766
VWR zamanlayıcı Yanıp sönen LED 2 kanalVWR89140-196
Zebron ZB-Wax GC sütunuPhenomenex7HM-G013-11

Kaynaklar

  1. Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
  2. Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045(2013).
  3. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  4. Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
  5. Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
  6. Parrish, C. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. Arts, M. T., ainman, B. C. , Springer-Verlag. New York. 4-20 (1999).
  7. Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
  8. Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
  9. Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49(2016).
  10. Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
  11. Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
  12. Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
  13. Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
  14. Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024(2013).
  15. Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178(2017).
  16. Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
  17. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
  18. Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
  19. Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
  20. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
  21. Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
  22. Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
  23. Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Deniz Lipid AnaliziLipid EkstraksiyonuToplam Lipid Tayiniİnce Tabaka KromatografisiAlev İyonizasyon DeteksiyonuKloroform Metanol EkstraksiyonuDeniz Suyu FiltrasyonuLipid BiyoakümülasyonuSucul Ekosistemler
Deniz Örneklerinde Toplam Lipid ve Lipid Sınıflarının Belirlenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.