Bu rapor, sülfatlı glikozaminolikanları (GAG) biyolojik örneklerden izole etme ve arındırma tekniklerini ve yaklaşık boyutlarına yönelik bir poliakrilamid jel elektroforez yaklaşımını açıklar. GAG'ler proteinlerle elektrostatik etkileşim yoluyla doku yapısına ve etki sinyalizasyon süreçlerine katkıda bulunur. GAG polimer uzunluğu, konyak ligandları için bağlayıcı yakınlıklarına katkıda bulunur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Glikozamid Jel Elektroforez ve Gümüş Boyama ile Glikozaminolikanların Tespiti
Bu makalede
Özet
Özet
Heparan sülfat (HS) ve kondroitin sülfat (CS) gibi sülfatlı glikozaminojenler (GAG' ler) canlı organizmalarda her yerde bulunur ve çeşitli temel biyolojik yapılarda ve süreçlerde kritik bir rol oynar. Polimerler olarak, GAG'ler 4000 Da ile 40.000 Da arasında değişebilen polisakkarit zincirleri içeren bir polidisperz karışımı olarak bulunur. Bu zincirlerde, kognate protein ligandlarının pozitif yüklü kalıntılarıyla etkileşimi kolaylaştıran bir negatif yük deseni veren sülfatlama alanları vardır. GAG'lerin sülfatlı etki alanları, bu elektrostatik etkileşimlere izin vermek için yeterli uzunlukta olmalıdır. GAG'lerin biyolojik dokulardaki işlevini anlamak için, araştırmacı GAG'lerin boyutunu izole edebilmeli, arındırabilmeli ve ölçebilmelidir. Bu rapor, çeşitli biyolojik doku tiplerinden izole edilen GAG'ler arasındaki nispeten küçük boyut farklılıklarını çözmek için yararlanılabilen pratik ve çok yönlü poliakrilamid jel elektroforez bazlı bir tekniği açıklar.
Giriş
Glikozaminogllikanlar (GAG'lar), canlı organizmalarda her yerde bulunan ve birçok temel fizyolojik işleme katkıda bulunan doğrusal polisakkaritlerin çeşitli bir ailesidir1. Heparan sülfat (HS) ve kondroitin sülfat (CS) gibi GAG'ler polisakkarit zinciri boyunca farklı konumlarda sülfatlanabilir ve negatif yük coğrafi etki alanları verebilir. Bu GAG'ler, proteoglikanlar olarak bilinen hücre yüzeyi proteinlerine bağlandığında, hücre dışı alana yansıtır ve konyak ligandlarına bağlanır, hem cis- (aynı hücreye bağlı ligand) hem de trans- (komşu hücreye bağlı ligand) sinyal işlemlerinin düzenlenmesine izin verir2. Ayrıca, GAG'l....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokolde analiz edilen tüm biyolojik örnekler, Colorado Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında farelerden elde edildi.
1. Heparan sülfat izolasyonu
- Doku örneklerinin delipidasyonu
NOT: Delipidasyon yağ bakımından zengin dokular için isteğe bağlı bir adımdır.- Metanol ve dikloromethane karışımı 1:1 yapın. Numune başına yaklaşık 500 μL hazırlayın; daha büyük doku parçaları 1 mL'ye kadar sürebilir.
- Her doku örneğini, delipidasyon için kapaklı küçük bir cam kaba yerleştirin.
NOT: Örnek kitle, ilgi çekici doku ve deneysel ihtiyaçl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Alcian mavisi sülfatlı GAG 10'ulekelemede kullanılır; bu sinyal, sonraki gümüş leke 11kullanılarak yükseltilir. Şekil 1, gümüş boyama geliştirme sürecinin görsel bir gösterimini sağlar. Gösterildiği gibi, elektroforez ile ayrılmış GAG'leri temsil eden Alcian mavi sinyali, gelişen ajan poliakrilamid jeline nüfuz ettikçe yükseltilir. Tipik olarak, gelişen süreç gümüş ve Alcian mavi lekeli GAG'leri yoğunluğa bağlı bir şekilde azaltacak, her bandın.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
GAG'ler birçok farklı biyolojik proseste merkezi bir rol oynar. Sülfatlı GAG'lerin (HS ve CS gibi) temel işlevlerinden biri, aşağı akış sinyal fonksiyonlarını değiştirebilen ligandlarla etkileşime girmek ve ligandlara bağlanmaktır. Gag bağlama benzeşiminin konyak ligandlarına önemli bir belirleyicisi GAG polimer zincirinin uzunluğu 8,9,14. Bu nedenle, araştırmacıların biyolojik ilgi örneklerinden izole edilen GAG zincirlerinin b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ve EPS) tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Accuspin Micro17 tezgah üstü mikrosantrifüj | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | 14000 xG kapasiteli herhangi bir tezgah üstü mikrosantrifüj/rotor kombinasyonu uygundur |
| Akrilamid (katı) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Elektroforez sınıfı |
| Aktinaz E | Sigma Aldrich | P5147 | S. griseus |
| Alcian Blue 8GX'ten proteaz karışımı (katı) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Amonyum asetat (katı) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Amonyum hidroksit (sıvı) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | sertifikalı ACS |
| Amonyum persülfat (katı) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | elektroforez sınıfı |
| Barnstead GenPure Pro Water Arıtma Sistemi | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Herhangi bir su deiyonize / saflaştırma sistemi kabul edilebilir bir alternatiftir |
| Borik asit (katı) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Bromfenol mavisi (katı) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Kalsiyum asetat (katı) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Kalsiyum klorür (katı) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| CHAPS deterjan (3-((3-kolamidopropil) dimetilamonya)-1-propansülfonat) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Kondroitinaz ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| PAGE için kriter boş kaset (1.0 mm kalınlığında, 12+2 kuyu) | Bio-Rad | 3459901 | 1.0 mm kalınlığındaki herhangi bir PAGE döküm kaset sistemi yeterli olacaktır |
| Criterion PAGE Hücre sistemi (hücre ve güç kaynağı) | Bio-Rad | 1656019 | karşılaştırılabilir herhangi bir dikey jel PAGE sistemi çalışacaktır) |
| Diklorometan (sıvı) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | sertifikalı ACS |
| EDTA disodyum tuzu (katı) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Buzul asetik asit (sıvı) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Sertifikalı ACS |
| Glisin (katı) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Elektroforez sınıfı |
| Heparanaz I / III | Sigma Aldrich | H3917 | Flavobacterium heparinum |
| Heparin türevi dekaskarit (dp10) | galen bilimsel | HO10 | |
| Heparin türevi hekzasakkar (dp6) | Galen bilimsel | HO06 | |
| Heparin türevi oligosakkarit (dp20) | galen bilimsel | HO20 | |
| Hidroklorik asit (sıvı) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Liyofilizatör | Labconco | 7752020 | -40C ve 0.135 Torr'a ulaşabilen herhangi bir liyofilizatör çalışacaktır; ayrıca rotasyonel vakum yoğunlaştırıcı ile değiştirilebilir |
| Metanol (sıvı) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Sertifikalı ACS |
| Moleküler Görüntüleyici Jel Doc XR Sistemi | Bio-Rad | 170-8170 | Karşılaştırılabilir herhangi bir jel görüntüleme sistemi kabul edilebilir bir ikamedir |
| N,N'-metilen-bis-akrilamid (katı) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Elektroforez sınıfı |
| Fenol kırmızısı (katı) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Serbest asit |
| Q Mini H İyon Değişim Kolonu | Vivapure | VS-IX01QH24 | İyon değişim kolonu, minimum 0,4 mL yükleme hacmine, çalışma pH'ı 2-12 ve pKa'sı 11 olan iyonik gruplar için seçiciliğe sahip olmalıdır |
| Gümüş nitrat (katı) | thermoFisher Scientific | S181-25 | sertifikalı ACS |
| Sodyum Asetat (katı) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Sodyum klorür (katı) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Sodyum hidroksit (katı) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sükroz (katı) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| TEMED (N,N,N',N'-tetrametilendiamin) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Elektroforez sınıfı |
| Tris bazlı (katı) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Ultra Santrifüj filtreler, 0.5mL, 3000 Da moleküler ağırlık kesme | Amicon | UFC500324 | Numune boyutuna bağlı olarak daha büyük hacimli filtre üniteleri kullanılabilir. |
| Üre (katı) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Herhangi bir rotasyonel vakum yoğunlaştırıcı çalışacaktır; liyofilizatör ile değiştirilebilir |
| Vakum filtre ünitesi, tek kullanımlık, 0.22uM gözenekli PES, 500mL hacim | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternatif hacimler ve filtre malzemeleri kabul edilebilir |
Kaynaklar
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
