Method Article

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

DOI:

10.3791/62330

⸱

March 23rd, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1STEMCELL Technologies Ltd., 2STEMCELL Technologies Inc., 3Terry Fox Laboratory, BC Cancer

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bağırsak apikal spesifik etkileşimlerin modellenmesine izin veren iki protokol sunuyoruz. Organoid türevli bağırsak monolayerleri ve Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) kültürleri, hem aydınlık hem de bazolateral taraflardan erişilebilen iyi ayırt edilmiş epitellerin üretilmesini kolaylaştırırken, polarite ters bağırsak organoidleri apikal yanlarını ortaya çıkarır ve yüksek verim testlerine uygundur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak epitelinin astarı, apikal taraflarını lümene maruz bırakan ve dış ipuçlarına yanıt veren basit bir özel epitel hücre tabakasından oluşur. İn vitro kültür koşullarının son optimizasyonu, bağırsak kök hücre nişinin yeniden oluşturulmasına ve hücre bileşimini ve epitelin düzenlenmesini yeniden sağlayan gelişmiş 3 boyutlu (3D) kültür sistemlerinin geliştirilmesine izin verir. Hücre dışı matrise (ECM) gömülü bağırsak organoidleri, iç lümeni ve dış maruz bazal tarafı kapsayan iyi tanımlanmış, polarize bir epitel oluşturmak için uzun süreli ve kendi kendine organize edilebilir. Bağırsak organoidlerinin bu kısıtlayıcı doğası, epitel in vitro'nun apikal yüzeyine erişimde zorluklar sunar ve besin alımı ve konak-mikrobiyota/konak-patojen etkileşimleri gibi biyolojik mekanizmaların araştırılmasını sınırlar. Burada, organoid epitelin apikal tarafına erişimi kolaylaştıran ve spesifik bağırsak hücre tiplerinin farklılaşmasına destek olan iki yöntemi açıklıyoruz. İlk olarak, ECM çıkarılmasının epitel hücre polaritesinin tersine çevrilmesine nasıl neden olduğunu ve apikal-out 3D organoidlerin üretilmesine izin verdiğini gösteriyoruz. İkinci olarak, olgun ve farklılaştırılmış hücre tiplerinden oluşan bağırsak organoidlerinden elde edilen tek hücreli süspansiyonlardan 2 boyutlu (2D) monolayerlerin nasıl üretilmediğini açıklıyoruz. Bu teknikler, epiteliumun dış ipuçları in vitro ile apikal spesifik etkileşimlerini incelemek ve hassas tıbbı kolaylaştırmak için organoidlerin bir platform olarak kullanılmasını teşvik etmek için yeni araçlar sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak epitel, insan vücudundaki en büyük ikinci epiteldir ve besin alımını kolaylaştıran ve çevresel hakaretlere karşı bir bariyer görevi gören gelen polarize bir hücre tabakasından oluşur1. Apikal ve bazolateral taraflar arasındaki bu ayrım, epitel hücrelerinin çeşitli işlevlerini yerine getirmelerini sağlar. Apikal bölme lümene maruz kalır ve çevresel uyaranlar ve mikroorganizmalarla epitel etkileşimlerine aracılık ederken, besin alımını da kolaylaştırır. Bazolateral yüzey hücreler arası kavşaklara ve hücre matrisi yapışıklıklarına ev sahipliği yaparken, bağışıklık sistemi ve diğer dokuların hücreleriyleetkileşime 2. Bu kavşaklar, bodrum zarı bağlı geçirimsiz bir monolayer oluşturur, bu da bir bariyer görevi görür ve emilen besinleri çevredeki vücut dokusuna ulaştırıyor.

Bu bağırsak fonksiyonlarını in vitro olarak yeniden sağlayabilen kültür sistemlerinin kurulması3. Geleneksel in vitro modeller, 2D monolayer kültürleri oluşturmak için Caco-2 gibi dönüştürülmüş insan kolorektal kanser hücre çizgilerini kullanır. Absorptif bölmenin birden fazla işlevini modelleyebilen olmasına rağmen, bu modeller temel fonksiyonel özellikleri ve uygulamaları sınırlayan bağırsak epitel bileşimini ve işlevini tam olarak yeniden yakalayamaz4,5.

Organoidlerin, kök hücrelerden üretilen ve organa özgü hücre tiplerine göre kendini organize edebilen ve ayırt edebilen gelişmiş bir 3D kültür sistemi olarak ortaya çıkması, bağırsak epitelinin in vitro çalışmasında bir atılım oldu6. Bağırsak organoidleri bazal lamina benzeyen hücre dışı bir matrise (ECM) gömülür ve bu kültürlerin epitelin apikobakal polaritesini korumasını sağlayan hücre matrisi kavşakları oluşturur. Organoidler, apikal tarafın luminal bölmeye maruz kaldığı, böylece bağırsağın yapısını taklit eden kapalı bir mimari sergiler. Bu kapalı kuruluş oryantasyona özgü işlevleri inceleme fırsatı sunsa da, epitelimin apikal tarafına erişim gerektiren araştırmaları sınırlar. Organoid parçalanma, organoid mikroenjeksiyon ve monolayer kültürlerin üretimi dahil olmak üzere hem 2D hem de 3D'de bu sınırlamaların üstesinden gelmek için farklı yaklaşımlar alınmıştır7. Organoid parçalanması, yapısal organizasyonun kaybına ve epiteliumun apikal yüzeyinin ortama maruz kalmasını sağlayan hücre bağlantılarının tahrip olmasına neden olur. Bu teknik, hücre dışı bir matrise tohumlandığında organoidleri reforme etmek için parçaların rejeneratif kapasitesinden yararlanır ve bulaşıcı hastalık ve konak-patojen etkileşimlerini modellemek için kullanılmıştır8,9. Bununla birlikte, hem apikal hem de bazal yüzeye eşzamanlı erişim, enfeksiyona spesifik olmayan yanıtlar da verebilir.

Apikal yüzeye erişime izin veren ve hem yapısal mimariyi hem de hücre bağlantılarını koruyan alternatif bir yaklaşım, faktörlerin organoidlerin lümenine mikroenjeksiyonu ile temsil edilir. Bu yöntem, konak-patojen etkileşimlerini incelemek ve Cryptosporidium10 , H. pylori11ve C. difficile12'nin gastrointestinal epitel in vitro üzerindeki etkilerini modellemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Benzer teknikler kullanılarak, pks+ E. coli suşunun bağırsak epitel üzerindeki mutajenik potansiyeli belirlendi13. Etkili olmasına rağmen, organoid mikroenjeksiyon, ölçülebilir etkiler elde etmek için enjekte edilmesi gereken yüksek sayıda organoid göz önüne alındığında zahmetli ve verimsiz bir iştir ve bu nedenle yüksek verim tahlilleri için uygulamasını sınırlar.

Bağırsak organoidleri ile son gelişmeler de 2D monolayer organoid kültürlerinin kurulması için yöntemler sağlamıştır, böylece apikal yüzeylerini açığa çıkararak14 , 15,16,17. Bu organoid türevli monolayerler, bağırsak epitelinin in vivo özelliklerini yeniden kapsüller. Hem farklılaşmış hem de kök hücre popülasyonlarını içeren fizyolojik olarak ilgili bir hücre bileşimi sergilerler ve crypt-villus ekseni boyunca çeşitliliği modellerler. Apikobasal polarite korunduğu için, doğal monolayer özellikleri hem apikal hem de bazolateral tarafların kolay erişimine izin verir ve medya borsaları bağırsak akışını taklit edebilir ve uzun vadeli kültüre izin verir. Bu özellikler organoid türevli monolayerleri ışık etkileşimlerine odaklanan çalışmalar için uygun hale getirir ve epitel bariyer bütünlüğü ve geçirgenliği için üstün bir model sağlar18,19.

Çalışmalar epitel hücre polaritenin MDCK sferoidleri20,21 ve son zamanlarda insan bağırsak organoidlerinde ECM proteinleri tarafından sıkı bir şekilde düzenlendiğini göstermiştir22. ECM bileşenlerinin çıkarılması veya hücre-matris kavşaklarına aracılık eden integrin reseptörün inhibisyonu, bağırsak organoidlerinin polarite tersine dönmesine ve epiteliumun apikal tarafının orta22'yemaruz kalmasına neden olur. Bu yaklaşım, apikal tarafa 3D olarak kolay erişim sağladığı ve yüksek verim testlerine uygun hale getirdiği için bulaşıcı hastalıklar üzerinde çalışan araştırmacıların ilgisini çekmiştir. Burada, değiştirilmiş bir protokolü açıklıyoruz Amieva lab22tarafından yapılan son çalışmalara dayanarak, apikal taraflarını kolayca açığa çıkaran 3D bağırsak organoidlerinin üretilmesini kolaylaştıran. Ayrıca, bağırsak organoidlerinden elde edilen bağırsak 2D monolayerlerini verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde üretebilen bir protokol özetliyoruz.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan bağırsak organoid kültürlerinin türetme başka bir yerde açıklandığı gibigerçekleştirildi 23. Organoidler, Bağırsak Organoid Genleşme Ortamı için Ürün Bilgi Sayfası (PIS) tarafından açıklandığı gibi kültürde sürdürülmektedir (Malzeme Tablosunabakın).

1. Bağırsak organoid polaritesinin tersine çevrilmesi

NOT: Bu bölümde 3D bağırsak organoidlerinin polaritesini tersine çevirme protokolü özetlenecektir. Bu protokol, bir kültür plakasında süspansiyonda açıkta kalan apikal yüzeye sahip polarize organoidlerin kurulması için ayrıntılı bir prosedür sağlar. Bu protokol bir son nokta tahlil olarak tasarlanmıştır, ancak organoidler bu konformasyonda 2 haftadan fazla tutulabilir ve geçiş sırasında apikal-in organoidleri yeniden kurmalarını sağlayan küçük bir kök hücre popülasyonunu koruyabilir.

  1. Yapışma önleyici çözelti ile kaplama kültür gereçleri ve tüpleri
    NOT: Apikal-out bağırsak organoidlerinin sayısını en üst düzeye çıkarmak ve kültür yazılımına istenmeyen bağlanmayı önlemek için genellikle kültür yazılımlarının ön kaplaması gerekir. Aşağıda özetlenen bölümde, kültür ve plastik eşyaların yapışma önleyici çözelti ile kaplanması açıklanmaktadır.
    1. Protokolün süspansiyon kısmında kullanılacak coat kültür plakaları aşağıdaki gibidir.
      1. 24 kuyulu doku kültürü plakasının her kuyusuna 0,5 mL yapışmaya karşı çözelti ekleyin.
      2. Çözeltiyi yüzeye ve kuyuların duvarlarına eşit olarak yaymak için plakayı döndürün.
      3. Plakayı 10 dakika boyunca 1.300 x g'da santrifüj edin.
      4. Bir aspiratör veya 1 mL pipet kullanarak her kuyudan yapışma önleyici çözeltiyi çıkarın.
      5. Kuyuları 15m HEPES (DMEM/F12) ile 1 mL DMEM/F-12 ile yıkayın.
      6. İyice yıkanmış her birini 0,5 mL DMEM/F-12 ile doldurun ve plakayı kullanıma kadar 37 °C ve% 5 CO2'de saklayın.
        NOT: Hemen kullanılmadığı takdirde, kaplamalı plakalar en az 1 hafta kuvözde tutulabilir.
    2. Bu protokolde kullanılan 15 mL konik boruları aşağıdaki gibi kaplar.
      1. 15 mL konik boruya 4 mL yapışmayan çözelti ekleyin.
      2. Çözeltiyi duvarların yüzeyine eşit olarak yaymak için tüpü döndürün.
      3. Tüpü 10 dakika boyunca 1.300 x g'da santrifüj edin.
      4. Yapışma önleyici çözeltiyi tüpten çıkarın.
      5. Tüpü 1x 5 mL DMEM/F-12 ile yıkayın ve DMEM/F-12'yi aspire edin. Tüpler kullanıma hazır.
        NOT: Hemen kullanılmazsa, 5 ml DMEM/F12 ekleyin ve 4 °C'de saklayın. Kaplamalı tüpler en az bir hafta boyunca 4 °C'de tutulabilir.
  2. Bağırsak organoidlerinin süspansiyon kültürü ile polarite inversiyonu
    NOT: Aşağıdaki adımlar, daha önce standart ECM kubbe koşulları altında kültürlenmiş bağırsak organoidlerinin tersine çevrilmesidir. Burada açıklanan prosedürler 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusu içindir. Diğer kültür yazılımlarını kullanıyorsanız, birimleri buna göre ayarlayın.
    1. Bodrum membran hücre dışı matris kubbesini bozmadan, organoid içeren her kuyudan ortamı dikkatlice çıkarın ve atın. İnversiyon protokolüne başlamadan önce organoidlerin boyutunun 150-250 μm çapında (tipik olarak 3-5. günde) olduğundan emin olun.
    2. Her kuyuya 1 mL buz gibi ayrışma çözeltisi ekleyin.
    3. Oda sıcaklığında (15-25 °C) 1 dakika kuluçkaya yatır.
    4. Plastik uçların kaplanmasında kullanılacak 15 mL'lik bir tüpe en az 2 mL yapışmayan çözelti ekleyin.
    5. Yapışma önleyici çözelti ile durulanmış plastik uçları yıkamak için kullanılacak 15 mL'lik bir tüpe en az 2 mL DMEM/F-12 ekleyin.
    6. 1 mL pipet ucunu yapışma önleyici çözelti ile kaplayın, 1.2.4 adımından itibaren yapışma önleyici çözelti ile tüpe üç kez 1 mL çözelti pipetleme.
    7. Ucu soğuk DMEM/F-12'de yıkayın, 1.2.5 adımından DMEM/F-12 ile tüpe üç kez 1 mL çözelti borulayın.
    8. Kaplamalı ucu kullanarak, yavaşça pipetleme yaparak kubbeleri dikkatlice yerinden sökün. Organoidleri bozmamaya veya parçalamamaya dikkat edin.
    9. Organoid süspansiyonu yapışma önleyici çözelti ile tedavi edilen bir tabağa aktarın (adım 1.1.1'den itibaren).
    10. Plakayı 30 dakika boyunca 4 °C'de bir çalkalayıcıya yerleştirin. 70 rpm'de bir jiroskop çalkalayıcı kullanılabilir.
      NOT: Organoid parçalanmasına neden olabileceği için numuneyi girdaplama gibi sert titremelerden kaçının. Kabarcıkların ve köpüğün oluşumu sert titremeye işaret edebilir.
    11. 30 dakika sonra plakayı çıkarın. Yapışması önleyici çözelti ile kaplanmış 1 mL pipet ucu kullanarak, çözeltiyi yavaşça yukarı ve aşağı pipetlayın.
    12. Plakayı 15 dakika boyunca 4 °C'de bir çalkalayıcıya yerleştirin. 70 rpm'de bir jiroskop çalkalayıcı kullanılabilir.
    13. Plakayı çıkarın ve organoidlerin yerçekimi ile yerleşmesine izin verin (oda sıcaklığında 1-2 dk). Organoid sedimentasyonu doğrulamak için mikroskop altındaki plakayı gözlemleyin.
      NOT: Yerleşik organoidlerin yeniden canlanmasına neden olabileceği için plakanın kapsamlı ajitasyonundan kaçının.
    14. Organoidler yerleştikten sonra, dissosiyelasyon çözeltisinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve 1,5 mL DMEM / F-12 ekleyerek yıkayın.
    15. Organoidlerin çökeltilmesine izin verin ve süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
      NOT: Herhangi bir yıkama adımı atmadan önce organoid sedimentasyonunu doğrulamak için mikroskop altındaki plakayı gözlemleyin.
    16. DMEM/F-12'nin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve 0,5 mL Bağırsak Organoid Genleşme Ortamı ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatır.
    17. Ertesi gün, plakayı 25 ila 30 derecelik bir açıyla yatırarak ve kuyunun duvarı boyunca ortayı çıkararak kısmi bir orta değişiklik yapın. Askıya alınmış organoidleri çıkarmamaya dikkat ederek 0,4 mL ortayı çıkarın.
    18. 0.4 mL Bağırsak Organoid Genleşme ortamı ekleyin. 3 gün boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de kuluçkaya yatır.
      NOT: 3 gün sonra, organoidlerin çoğunda apikal çıkış polaritesi olmalıdır, ancak büyük agregalar oluşmuş olabilir.
    19. Agregalar oluşmuşsa, ucun ucunu plakanın altına bastırırken 20 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak agregaları yammak için yapışma önleyici çözelti ile kaplanmış bir ucu olan 1 mL pipet kullanın (1.2.6 ve 1.2.7 adımlarında açıklandığı gibi).
    20. Plakayı 37 °C ve%5 CO2'ye yerleştirin ve ertesi gün Bağırsak Organoid Genleşme ortamı ile tam bir orta değişiklik gerçekleştirin (bölüm 1.2.17'de açıklandığı gibi).
    21. 2 gün sonra (süspansiyonda 5 gün), apikal çıkışlı bağırsak organoidleri aşağı akış tahlillerinde kullanılabilir.

2. 3D bağırsak organoidlerinden elde edilen bağırsak hücresi 2D monolayer ve Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) kültürlerinin kurulması

NOT: Bu bölümde bağırsak organoidlerinden 2D monolayer kültürler oluşturma protokolü özetlenecektir. Bu teknik, hücre kültürü membran kesici ucu içeren bir doku kültürü plakasında açıkta kalan apikal bir yüzeye sahip bir konfüler, polarize monolayer kültürü kurma avantajı sağlar. Monolayer, batık, monolayer formatında farklılaşmaya başlayacak olsa da, bir ALI kültürüne geçilerek tek katmanlının ek farklılaşması sağlanabilir. Hem monolayer hem de sonraki ALI protokolleri son nokta tahlilleri olarak tasarlanmıştır ve monolayer kültürü küçük bir kök hücre popülasyonu korusa da, kurulduktan sonra verimli bir şekilde bölünemez ve geçemez.

  1. Bağırsak monolayer kültürü için ortam ve plaka hazırlama
    1. Tek katman kültürü için üretici tarafından belirtildiği gibi Bağırsak Organoid Farklılaşma Ortamı hazırlayın (bkz. Malzeme Listesi). Y-27632'yi yalnızca 1 hafta içinde 10 μM'lik son konsantrasyonda kullanılacak bir ortam hacmine ekleyin. Hemen kullanılmazsa, 4 °C'de saklayın.
    2. Önceden ısınan Tripsin EDTA (%0,05) ila 37 °C.
    3. Monolayer kültürlerinin tohumlanması öncesinde en az 2 saat, aşağıdaki gibi% 2 ECM kaplama çözeltisi hazırlayın.
      1. ECM'yi buz üzerinde çözün ve % 2'lik bir çözelti hazırlamak için soğuk, steril PBS'ye 1:50 ekleyin. Kullanılacak her 6,5 mm (0,33 cm2)hücre kültürü membran kesici ucunun üst kuyusuna 100 μL eklemek için yeterli miktarda hazırlayın. Sesi daha büyük veya daha küçük kültürler için uygun şekilde ayarlayın.
    4. Her kuyuya 100 μL ekleyin ve her plakayı 37 °C ve% 5 CO2'de (tohumlamadan önce en az 2 saat) kuluçkaya yatırın.
  2. Monolayer nesil ve kültür için bağırsak organoidlerinin ayrıştırıcı
    1. İnkübatörden uygun sayıda organoid kültür kuyularını çıkarın. Çeşitli kültür eşyaları için hasat yapılması önerilen kuyu sayısı için Tablo 1'e bakın.
    2. ECM kubbesini bozmadan organoid kültürlerinden tüm ortamları aspire edin.
    3. Her kuyuya 1 mL ayrışma çözeltisi ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında (15-25 °C) en az 1 dakika kuluçkaya yatır.
    5. 1 mL pipet kullanarak, kubbeyi bozmak ve organoidleri serbest bırakmak için kuvvetlice yukarı ve aşağı pipet.
    6. Askıya alınan organoidleri her kuyudan 15 mL konik tüpte bir araya alın. Hafif ajitasyon veya sallanma ile oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Birden fazla kuyuya tohum atan organoidler bu adımda, her tüpte 10 mL hacme kadar birikebilir.
    7. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj.
    8. Üsttant çıkarın ve atın. Organoidleri yeniden canlı olarak çıkarmak için 5 mL buz gibi DMEM/F-12 ekleyin.
    9. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da tekrar karıştırın ve santrifüjlayın.
    10. Peletin rahatsız olmamasına dikkat ederek, mümkün olduğunca çıkararak süpernatantı aspire edin.
      NOT: Bazı artık ECM pelet içinde kalabilir; bununla birlikte, bu organoidlerin ayrışmalarını önemli ölçüde etkilememelidir.
    11. Organoidleri yeniden hayata geçirmek için 1 mL önceden ısıtılmış (37 °C) Tripsin-EDTA (%0,05) ekleyin. Eşit bir süspansiyon sağlamak için iyice karıştırın. Çok sayıda hücre için veya önemli miktarda ECM kalırsa, 1 mL'ye kadar ek Trypsin-EDTA ekleyin.
    12. 5-10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
    13. Organoidleri mümkün olduğunca bozmak için 1 mL pipetle iyice karıştırın. Organoidler tamamen tek hücrelere veya küçük parçalara ayrılmalıdır. daha büyük parçalar veya tüm organoidler iyice pipetlendikten sonra kalırsa, 37 °C'de Trypsin-EDTA ile inkübasyona 3-5 dakika daha devam edin.
      NOT: Trypsin-EDTA ile 20 dakikadan fazla kuluçkaya yatmayın, çünkü bu hücre canlılığının artmasına neden olabilir.
    14. Organoidler yeterince ayrıştıktan sonra, iyice karıştırmak için eşit miktarda DMEM/F-12 (örneğin, mL Trypsin-EDTA başına 1 mL DMEM/F-12) ekleyin ve pipet yukarı ve aşağı ekleyin. Bu adımda DMEM/F-12'ye %10 FBS ekleyerek Trypsin-EDTA'yı devre dışı bırakın.
    15. 2-8 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj parçaları.
    16. Ayrışmış organoidler peletlenmezse, bu yaygındır ve ayrışmış hücreler tarafından salınan mukus birikiminden kaynaklanabilir. Bu durumda, hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyarak iyice karıştırın ve 2-8 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da tekrar santrifüj edin.
    17. Sadece hücre peletini bırakarak mümkün olduğunca fazla süpernatant dikkatlice çıkarın.
    18. Tohumlanacak her kuyu için hücreleri 100 μL Bağırsak Organoid Farklılaşma ortamında (10 μM Y-27632 ile) yeniden depolar. Sesi daha büyük veya daha küçük kuyu boyutları için uygun şekilde ayarlayın.
    19. Kaplamalı plakaları inkübatörden çıkarın (adım 3.1.4'te hazırlanmıştır) ve her kuyudan fazla ECM'yi çıkarın.
    20. Her hücre kültürü kesici ucunun üst kuyusuna 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
    21. Her hücre kültürü kesici ucunun alt kuyusuna 500 μL Bağırsak Organoid Farklılaşma ortamı ekleyin.
    22. 37 °C ve %5 CO2'de kuluçkaya yaslanın.
    23. Ortamı her 2 ila 3 günde bir hem üst hem de alt kuyularda değiştirin. Monolayer kültürleri 7 gün içinde izdiahlara ulaşmalıdır ve genellikle 2-3 gün içinde izdiah eder.
  3. Hava-Sıvı Arabirimi (ALI) kültürü oluşturma
    NOT: İstenirse, batık bağırsak monolayer kültürünün daha da farklılaşması, batık monolayer kültürünün bir ALI kültürüne geçirilmesiyle gerçekleştirilebilir. Bu kültür yöntemi, farklılaştırılmış hücre türlerinin, özellikle de goblet ve enteroendokrin hücreler gibi salgı soyunun hücrelerinin sayısında bir artışa izin verecektir.
    1. Yukarıda 2.2.1-2.2.23 adımlarında açıklandığı gibi hücre kültürü ekinde tek katmanlı bir kültür oluşturun ve bu kültürü en az 4 gün boyunca% 100 izdiahta koruyun.
    2. Bir ALI kültürü oluşturmak için, ortayı üst ve alt kuyulardan çıkarın. Alt kuyuya taze Bağırsak Organoid Farklılaşma ortamını (Y-27632 ile) ekleyin ve üst kuyuyu boş bırakın.
    3. 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatır.
    4. Ortamı alt kuyuda 2-3 günde bir değiştirin ve monolayerin en az 1 hafta farklılaşmasına izin verin.
    5. Gerekirse fazla mukus birikimini gidermek için üst kuyuyu steril PBS ile durulayın.
      Bu koşullar altında, ALI kültürü en az 2-3 hafta boyunca korunabilir.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidler, daha önce23 olarak açıklanan protokolü takiben biyopsi örneklerinden ve Bağırsak Organoid Genleşme Ortamı için PIS'de oluşturulmuştır (bkz. Malzeme Tablosu). Şekil 1A, Sol Panel, Bağırsak Organoid Genleşme Ortamı ile bir kubbede kültürlenmiş bağırsak organoidlerinin fenotipini gösterir. Bu kültür koşullarında organoidler, lümeni içine eden ince (10-25 μm) epitel ile tanımlanan kistik morfoloji sergiler (Şekil 1A, Sağ Panel). Bu aşamada, bağırsak epitelinin apikal tarafı lümenle yüzleşirken, bazolateral taraf çevredeki hücre dışı matrisle temas ettirir. Organoidlerin çoğunluğu istenen boyuta ulaştığında, hücre dışı matris çıkarıldı ve organoidler süspansiyonda kültürlendi. Hücre dışı matrise hücresel bağlanma kaybı organoidlerde bir inversiyon sürecini tetikler, bu da organoid epitelin polaritesinin tersine dönmesine neden olarak epiteliumun apikal tarafını büyüme ortamına maruz kalır ve bazolateral tarafı içselleştirir.

Bazı kültürlerde, süspansiyon agrega ve kaynaşmasında organoidler, ilk 3 gün boyunca daha derin bir etki (Şekil 1B, Sol Panel). Kesme tekniğinin uygulanması, organoidlerin kopmasına ve kültürlerin minimum yeniden toplama ile günlerce devam etmesine izin verir (Şekil 1B, Sağ Panel).

ECM kubbelerinde kültüre edilen bağırsak organoidleri genişlemeye devam eder (Şekil 1C, Sol Panel) ve lümeni çevreleyen epitelin bazolateral tarafında küçük mahzenlere benzeyen ikincil tomurcuklanan yapıların kendiliğinden oluşumunu sergiler ( Şekil1C, SağPanel). Aynı zamanda, hücre dışı matris yokluğunda 5 gün boyunca tutulan organoidler süspansiyonda gelişmeye devam eder (Şekil 1D, Sol Panel). Polaritenin tersine çevrilmesi, organoidlerin çekirdeğini çevreleyen epiteliumun kalınlaşma (30-40 μm) ve çeşitli morfolojilerin ortaya çıkması ile karakterizedir: uzun (Şekil 1D, Sağ Panel ve Tamamlayıcı Şekil 1A), kistik (Ek Şekil 1B) ve düzensiz (Ek Şekil 1C). Bu genellikle organoid içindeki ışık alanının küçülmesiyle birleştirilir ve genel boyutlarını etkiler.

Verimli inversiyon, bağırsaklara özgü polarite belirteçlerinin ekspresyerlerinin ifadesi analiz edilerek de doğrulanabilir. Apikal-out bağırsak organoidleri, 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) sinyalinde belirtildiği gibi, çekirdeğin organoidin lümenine doğru belirgin bir lokalizasyonunu gösterir. VILLIN (Şekil 2A) ve ZO-1 ( Şekil2B) gibi apikal belirteçlerin ekspresyumu, epitelin ortasına maruz kalan dış tarafında tespit edilir. Bu lokalizasyon, ECM'de kültürlenen bağırsak organoidlerinde gözlenenlerle taban tabana zıttır. Çekirdek (DAPI), VILLIN (Şekil 2C) ve ZO-1 ( Şekil 2D ) için lekelenmiş hücre dışı matris gömülü organoidler, apikal tarafın organoidinlümeninebakan bir apikobakal polarite gösterir.

Bağırsak organoidlerinin etkili polarite inversiyonunun elde etmek için ECM'nin tamamen çıkarılması gerekir. Bazen, ECM kalıntıları ile çevrili süspansiyon kültürlerinde bulunan organoidlerin bir kısmı, epitelin polarite inversiyonunda bir başarısızlık olduğunu düşündüren kistik bir morfoloji gösterir (Ek Şekil 2A). Bu organoidler üzerinde yapılan immünofluoresan lekelenmenin analizi, epitel boyunca çekirdeğin (DAPI) bazolateral konumunun ve organoidin lümenine bakan apikal tarafta ZO-1 ekspresyonunun (Ek Şekil 2B) eksik ECM çıkarılmasının APIKOBAKAL polaritenin ECM gömülü organoidlere benzer bir şekilde tutulmasına neden olduğunu doğrulayan kanıtlar sağlar.

Bağırsak monolayer kültürlerinin kurulmasına ilişkin protokol, tohumlamadan sonraki 7 gün içinde bir araya gelen bir monolayer kültürü ile sonuçlanır ve kültür genellikle 2-3 gün gibi kısa bir sürede birleştiği yere ulaşır. Başarının en önemli belirleyicilerinden biri, monolayer tohumlamak için kullanılan hücrelerin sayısı ve kalitesidir. Şekil 3A, Sol Panel, 6,5 mm hücre kültürü membran kesici uçta yaklaşık 150.000 hücrelik ideal bir tohumlama yoğunluğu örneği sağlar. Bu sayı sabit değildir ve donöre ve kaynak organoid kültürünün kalitesine göre oldukça değişken olabilir; bu nedenle, hücre numarası bu değişkenlere göre en iyi duruma getirilmelidir. Tohumlama yoğunluğu çok düşükse veya düşük kalitedeyse(Şekil 3A, Sağ Panel), birikmiş monolayer kültürü oluşturmak için yeterli ek olmayabilir.

Monolayer kurulduktan sonra (Şekil 3B), hücreler parke taşı görünümü oluşturarak sıkı kavşaklar oluşturur (Şekil 3B, Sol Panel). Bir eşli monolayer oluşturamazlarsa (Şekil 3B, Sağ Panel), monolayer'ın görünümü genellikle kaliteli hücre ek bölgeleriyle, ancak bu bölgeler arasında daha büyük boşluklarla "yamalı" olacaktır. Bu kültürler bazal ve apikal bölmeler arasında işlevsel bir bariyer sağlamaz ve açıklanan tahliller için uygun değildir. Bir eşzamanlı monolayer, VILLIN içeren fırça kenarlığını epitelin apikal tarafına doğru yönlendirir ve çekirdeği hücrenin bazolateral kutbuna doğru konumlandırılmıştır (Şekil 4B). Hücreler arasında ZO-1 de dahil olmak üzere çok proteinli komplekslerden oluşan hücreler arası kavşaklar oluşur (Şekil 4B). Onların varlığı, epitel kültürünün bariyer işlevini sağlamanın anahtarıdır.

Bir kez bir araya gelen, bir ALI kültürüne geçiş kültürün daha da farklılaşmasına neden olan (Şekil 3C). Küçük, yuvarlak kadeh hücreleri ortaya çıkar ve monolayer'ın kendisi daha katlanmış bir görünüm alır. Goblet hücreleri batık kültürün epitel içinde mevcut olmasına rağmen (Şekil 4A), ALI farklılaşmasından sonra daha belirgindir. Epitel içinde bulunan goblet hücreleri mukus salgılar ve epiteliumun üstünde puslu bir görünüme yol açtı. Kadeh hücreleri ve salgılanan mukus, salgılanan mucin proteini, MUC2 (Şekil 4A, C ve D) için lekelenerek görselleştirilebilir ve kadeh hücresi popülasyonundaki artış MUC2 ifadesindeki artışla ölçülebilir (Ek Şekil 3A). Bu jel benzeri mukus tabakasını çıkarmak gerekli değildir ve epitel yüzeyine yapışır ve tekrarlanan yıkamaları takip etmeye devam eder. Çıkarma gerekirse, kültürü 10 mM N-asetil sistein veya 50 μg/ mL DTT gibi mukolitik bir bileşikle yıkamak fazla mukusu giderir. Kadeh hücre popülasyonundaki artışa ek olarak, ALI arayüzü ayrıca enteroendokrin hücrelerin (CHGA ifadesinde belirtildiği gibi) (Tamamlayıcı Şekil 3B) ve olgun enterositlerin (KRT20 ifadesiyle belirtildiği gibi)(Ek Şekil 3C)varlığını arttırır.

Hücre agregatlarının ve tek hücrelerin mikroskop görüntüsü, araştırmada hücresel yapıyı vurgulamaktadır.
Şekil 1: Apikal-out bağırsak organoidi neslinin aşamaları. (A) 4. günde istenen boyutta organoidlere sahip bir kubbenin temsili görüntüleri (Sol Panel, Ölçek çubuğu = 500 μm). Organoidler açık bir ışık bölmesi ile ince duvarlı (Sağ Panel, Ölçek çubuğu = 100 μm). (B) Süspansiyonda 3 gün sonra kapsamlı toplama ile bir kuyunun temsili görüntüsü (Sol Panel, Ölçek çubuğu = 200 μm). Kırpma parçalarının kesmeden hemen sonra görüntüsü (Sağ Panel, Ölçek çubuğu = 200 μm). (C) 7. günde kubbede bağırsak organoidlerinin temsili görüntüsü. Organoidler, epitelimin bazolateral tarafında küçük tomurcukların oluşumu ile genişletilmiş bir lümen gösterir (Sol 20x büyütme, İşaretli bölgenin sağ 100x büyütmesi, Ölçek çubuğu = 200 μm). (D) 5 gün boyunca ECM çıkarılması ve sonraki süspansiyon kültüründen sonra bağırsak organoidlerinin temsili görüntüsü. Organoidler kalınlaşmış bir epitel ile yoğun bir morfoloji elde eder ve apikal taraflarını ortama maruz bırakırlar. (Sol 20x büyütme, İşaretli bölgenin sağ 100x büyütmesi, Ölçek çubuğu = 200 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İmmünofloresan mikroskobu; epitel dokusu; DAPI, Villin, E-Cadherin, ZO-1 belirteçleri; hücre bağlantıları.
Şekil 2: Bağırsak organoidlerinde hücre polarite belirteçleri için immünofluoresan lekeleme. Apikal-out (A,B) ve apikal-in (C,D) yönelimli bağırsak organoidleri APIkal belirteçler ZO-1 ve VILLIN ve epitel belirteci E-CADHERIN (kırmızı) ile boyandı. Çekirdekleri görselleştirmek için DAPI (mavi) kullanılmıştır. Sol paneller 25x büyütmede çekilen görüntüleri görüntüler ve sağ paneller 63x büyütmede farklı organoidlerin görüntülerini görüntüler (sadece C paneli aynı organoidin 25x ve 63x büyütmesini görüntüler). (A) VILLIN (yeşil) ve E-CADHERIN (kırmızı) ile lekelenmiş apikal-out bağırsak organoidleri, apikal tarafın ortama maruz kalmasını gösterir. (B) ZO-1 (yeşil) ve E-CADHERIN (kırmızı) ile lekelenmiş apikal-out bağırsak organoidleri sıkı kavşakların varlığını ve apikobakal polaritenin geri dönüşümlerini gösterir. (C) Matrigel gömülü bağırsak organoidi VILLIN (yeşil) ve E-CADHERIN (kırmızı) ile boyanmış, organoid lümenini gösteren apikal tarafı gösterir. (D) Zo-1 (yeşil) ve E-CADHERIN (kırmızı) ile lekelenmiş matrigel gömülü bağırsak organoidleri, organoidin lümenine bakan apikal sıkı kavşakların varlığını gösterir. (Ölçek çubuğu = 100 μm). Organoidler immünofluoresans ile lekelendi ve daha önce yayınlananprotokoller kullanılarakgörüntülendi 24,25. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

A, B, C hücre kültürlerinin mikroskopi görüntüleri; Hücre büyüme paternleri, morfolojik analiz.
Şekil 3: Bağırsak monolayer kültürlerinin kurulması. (A) %0.05 Tripsin-EDTA ile tedaviyi takiben 3D organoidlerin temsili görüntüsü. Organoidler, monolayer kültürlerinin tohumlanma hazırlığı için tek hücrelere veya küçük hücre kümelerine ayrışır. Sol Panel: monolayer kültürü için en uygun tohumlama yoğunluğu örneği, 6,5 mm hücre kültürü membran kesici uçta 100 μL başına yaklaşık 150.000 hücre. Sağ Panel: 6,5 mm hücre kültürü membran kesici uçta 100 μL başına 50.000 < hücrede yetersiz tohumlama yoğunluğu örneği. (B) Batık monolayer kültürünün temsili brightfield görüntüsü. Sol Panel: Karakteristik parke taşı görünümüne sahip% 100 konfluent tabaka. Sağ Panel: yaklaşık % 50 konfluent monolayer. Tek katmanda görülen boşluklar (kesik çizgi ile gösterilir) bağırsak kök hücrelerinin çoğalmaya devam etmesi nedeniyle zamanla kapanır. (C) 7 günde farklılaştırılmış bir ALI kültürünün temsili brightfield görüntüsü. (Ölçek çubuğu = 200 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Konfokal mikroskop görüntüleri; epitel hücre belirteçleri DAPI, MUC2, VILLIN, ZO-1, E-Cadherin.
Şekil 4: Monolayer kültürlerde farklılaştırılmış hücre belirteçleri için immünofluoresan boyama. (A) Müsin proteini MUC2 için batık bir monolayer kültürünün immünofluoresan boyamasının Z-stack görüntüsü, tek katman kültürü içinde kadeh hücrelerinin varlığını gösterir (yeşil = MUC2, mavi = DAPI). (B) Su altında tek katmanlı immünofluoresan boyama Z-yığın görüntüsü. Epitelin apikal ucu boyunca VILLIN lekelenmesi (yeşil), fırça kenarlığı varlığını ve ZO-1 boyama (kırmızı) hücreler arasında sıkı birleşimlerin (mavi = DAPI) varlığını gösterir. (C) ALI monolayer kültürü içinde önemli ölçüde daha fazla sayıda kadeh hücresinin varlığını gösteren mucin proteini MUC2 için ALI farklılaştırılmış bir monolayer kültürünün immünofluoresan boyamasının Z-yığını görüntüsü (yeşil = MUC2, mavi = DAPI). (D) ALI-farklılaştırılmış monolayer kültürünün kriyoseksiyonu, epitelde kadeh hücrelerinin varlığını ve monolayer kültürünün apikal tarafı boyunca mukusun salgılandığını gösteren MUC2 (yeşil) ve E-CADHERIN (kırmızı) varlığı için lekelenmiştir. (Ölçek çubuğu = 200 μm). Monolayer kültürleri immünofluoresans ile lekelenmiş ve daha önce yayınlananprotokoller kullanılarak görüntülenmiştir 26,27. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Kültür süspansiyonunda apikal-out bağırsak organoidinin fenotip spektrumu. (A,B,C) ECM çıkarılmasından 5 gün sonra süspansiyonda tutulan bağırsak organoid morfolojilerinin ek temsili görüntüleri. Organoid polaritesi tersine döndü. Organoidler kalınlaşmış bir epitel ile daha yoğun hale gelmiştir ve organoidlerin apikal tarafı dışa dönüktir. Organoidler çeşitli morfolojiler gösterebilir: uzun (A), kistik (B) ve düzensiz (C). (Ölçek çubuğu = 100 μm). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Bağırsak organoidleri süspansiyon kültürlerinde artık bodrum membran matrisi ortamının varlığında polariteyi tersine çevirememektedir. (A) Tamamlanmamış ECM çıkarılması ve organoidlerin polaritesinin tersine çevrilememesinin temsili görüntüsü. Matrigel kalıntıları organoidlerin etrafında bulunur ve epitel polarite yönelimli apikal-in'in korunmasına katkıda bulunur. Organoidler lümeni çevreleyen ince bir epitel içeren kistik bir morfoloji gösterir (Ölçek çubuğu = 200 μm). (B) Süspansiyon kültürü koşullarında bulunan ters olmayan bir organoidin temsili görüntüsü. Çekirdek (mavi = DAPI) ve E-CADHERIN (kırmızı) bazolateral tarafa, ZO-1 (yeşil) organoidin lümenine bakan apikal tarafa ifade edilir. (Ölçek çubuğu = 100 μm). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Monolayer kültürlerde farklılaştırılmış hücre belirteçlerinin gen ekspresyolü. (A,B,C) Muc2, CHGAve KRT20'nin, qPCR ile kurulan Intestinal Organoid Expansion Medium ile yetiştirilen 3D organoid kültürüne göre Bağırsak Organoid Farklılaşması Ortası'nda oluşturulan batık ve ALI farklılaşmış monolayer kültüründe ekspresyasyonu. Batık tek katmanlı bir kültürün kurulması, farklılaştırılmış her hücre işaretçisinin ifadesini artırır; ancak, bir ALI kültürü olarak farklılaşma, her işaretçinin ifadesini katlanarak artırır. Hata çubukları = +/- SEM. Bu Dosyayı indirmek için lütfen burayı tıklatın.

MONOLAYER KÜLTÜR GEREÇLERIHASAT EDILECEK BAĞıRSAK ORGANOID KuyuLARıNıN SAYISI (tohumlanacak kuyu başına 50 μL kubbeden)
6,5 mm Transwell kesici uç1 - 2 kuyu
12 mm Transwell kesici uç3 - 4 kuyu
6 kuyulu tabak6 - 8 kuyu
24 kuyulu tabak3 - 4 kuyu
96 kuyu plakası1 - 2 kuyu

Tablo 1: Çeşitli kültür eşyaları için hasat etmek için bağırsak organoidlerinin kuyularının sayısı

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitel organoid modelleri doku organizasyonuna, hastalığın ilerlemesine ve terapötiklerintanımlanmasına 23 , 28,29modellemede kullanılabilecek güçlü platformlarhaline gelmiştir. Organoid mikroenjeksiyon, konak epitelyumun apikal tarafı ile patojen etkileşimine izin verdiği için organoidlerin bulaşıcı hastalıkları modelleme yeteneğine değer katmıştır. Mikroenjeksiyon tekniklerindeki son gelişmeler organoidlerdeki enjeksiyon hızını optimize etmiş ve saatte 90'a kadar enjekte edilmiş organoid oranına ulaşmıştır. Enjekte edilen organoidlerdeki bariyer fonksiyonu korunmuştur ve lümenin içindeki düşük oksijen konsantrasyonu zorunlu anaerobik enjekte edilmiş bakterilerin hayatta kalmasına izin verir30. Bununla birlikte, çalışmalar aynı kuyudaki organoid popülasyonlarda heterojenliğin varlığına dikkat silmiştir. Bu farklılıklar boyut ve şekil31,anahtar genlerin ekspresyon seviyeleri32ve çoğalma oranları33olarak gözlenmiştir. Forskolin ve PGE2 gibi bileşiklere veya kolera toksinine aynı organoid popülasyonu içindeki ayırıcı yanıtlar datanımlanmıştır 28,33. Bu sonuçlar çalışmalarda yüksek organoid sayısı ihtiyacını vurgulamakta ve luminal enjeksiyon kullanımını sınırlamaktadır.

Konvansiyonel organoid kültürü, organoidlerin bir hidrojelde kapsüllenmesine ve yayılmasına dayanır. Bununla birlikte, hidrojeller difüzyonda sınırlamalar oluşturabilir ve heterojenliği artırabilecek konsantrasyon gradyanları getirebilir34. Ayrıca, sadece kültürler ve bağışçılar arasında değil, aynı zamanda bireysel deneysel koşullar içinde de yüksek değişkenlik belgelenmiştir. Donör kaynağı, hidrojenin biyokimyasal özellikleri ve organoidin bir kültür sistemi olarak içsel heterojenliği deneysel değişkenliği artırabilecek ve aşağı akış uygulamalarında elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini sınırlandırabilecek önemli faktörlerdir. Burada açıklanan yöntemlerin her ikisi de epiteliumun apikal tarafını açığa çıkarmak için basit bir araç sağlar ve doğrudan kültür ortamına ekleyerek ilgi çekici bileşiklerin ve patojenlerin modellenebilmesine izin verir. Hidrojel kullanımındaki azalma, teknik hata kaynaklarından deneysel değişkenliği sınırlayabilir.

Apikal-out bağırsak organoidleri organoid model sisteminin temel özelliklerini korur ve ölçeklenebilirlikleri, 2D monolayer'a kıyasla yüksek verim testlerine daha uygun hale getirir. Bununla birlikte, organoidler 3D yapılarını korudukça, bazal tarafın erişilebilirliği sınırlıdır ve her iki tarafa da aynı anda erişim gerektiren çalışmaları engelleyebilir.

Bağırsak organoidlerinin polarite inversiyonunun ECM'nin verimli ve mutlak olarak çıkarılmasına dayandığını ve aynı zamanda organoidlerin sağlam yapısını koruduğunu gösterdik. Hem ECM'yi çıkarmak için ayrışma çözeltisinin kullanılması hem de organoidlerin plastik eşyalara yapışmasını önlemek için yapışma önleyici çözelti, Co, J. Y. ve meslektaşları22tarafından yayınlanan protokolün genel verimliliğinin giderilmesine katkıda bulundu - özellikle aşağı akış uygulamaları için üretilen apikal-out organoidlerinin sayısı ile ilgili olarak.

Ayrıca, protokolümüzün 250 μm'den küçük organoidlerin daha verimli tersine çevrilmesine destek verdiğini ve daha büyük organoidlerin kullanılmasının pipetlemenin neden olduğu parçalanma nedeniyle organoid çıkışının azalmasına neden olabileceğini gözlemledik. Malzeme Tablosundabelirtilenler gibi geniş delikli uçlar, daha büyük organoidlerin kullanılmasına izin verebilir. Bununla birlikte, geniş delikli uçlar, daha düşük uygulanan mekanik kuvvet nedeniyle standart uçlara kıyasla ECM ayrışmasında daha az etkilidir. Bu nedenle, daha büyük organoidlerle çalışırken tüm ECM kalıntılarının yeterli kesintiye uğraması ve tamamen çıkarılması için 1.2.9-1.2.11 adımlarının tekrarlanması gerekebilir.

Süspansiyondaki organoidler en az 2 hafta hayatta kalabilir. Bu süreden sonra morfoloji değişiklikleri ve hücre ölüm sayısının arttığını gözlemledik. Apikal-out organoid22'de çoğalma hücrelerinin varlığı, apikal-in intestinal organoid kültürlerinin yeniden kurulmasını sağlar. Bu, apikal-out organoidlerin tek hücrelere ayrıştırılması ve Bağırsak Organoid Genleşme Ortamı ile ECM'ye gömülmesiyle sağlanabilir.

Süspansiyon kültürlerinde bağırsak organoidlerinin kurulmasını tanımlayan protokollerde sıkça karşılaşılan bir sınırlama, büyük agregaların üretilmesidir. Bu, verimlilik, morfolojik özelliklerin tekrarlanabilirliği, bileşiklere geçirgenlik ve parakrin sinyalizasyon gibi çeşitli değişkenleri etkiler. Co, J. Y. ve meslektaşları tarafından yayınlanan protokole benzer şekilde, burada 3 gün askıya alındıktan sonra tüm askıya alınan organoidlerin en az% 97'sinin kesmeden polarite ters çevrildiğini doğrularız. Bununla birlikte, yayının aksine, büyük agregaların oluşumunu azaltmak ve verimi artırmak için mekanik bir ayrışma adımı getirdik. Bu işlem organoidlerin epiteline zarar verebileceğinden, tam epitel iyileşmesine izin vermek ve aşağı akış uygulamaları için yüksek kaliteli kültürler sağlamak için organoid inkübasyon süresini 2 gün daha uzattık. İnkübatör çalkalayıcı veya spinner şişesi kullanımı ile sürekli ajitasyona girilmesi, füzyon olaylarını azaltabilir, parçalanmayı en aza indirebilir ve oksijenlenmeyi artırabilir. Bu alternatif yaklaşımlar kültürleri daha uzun süre koruyabilir, hücre ölümünü azaltabilir ve apikal çıkışlı bağırsak organoidlerinin daha fazla farklılaşmasına izin verebilir.

Organoid türevi bir 2D monolayer kurulması, ters polarite organoidlerine kıyasla çeşitli avantajlar ve dezavantajlar sağlar. Burada açıklanan protokol, tipik olarak 7 günden kısa bir sürede birikmiş monolayer kültürünün hızlı bir şekilde kurulmasına ve kültürlerin uzun süreli (10 haftaya kadar) uzun süreli bakım seçeneğine izin verir. Burada kullanılan protokol ve medya, her zaman diğer organoid türevli monolayer kültürlerinde bulunmayan önemli sayıda hücrenin verimli bir şekilde farklılaşmasına izin verir16. Bir hücre kültürü kesici uç zarı üzerinde tek katmanlı bir yapı kurmak, epitelyumun hem apikal hem de bazolateral taraflarına eşzamanlı erişim sağlar ve bu da onları bariyer bütünlüğü ve epitel taşımacılığı çalışmaları için ideal hale getirir. Bu basitleştirilmiş erişim aynı zamanda onları enfeksiyon ve ilaç tedavisi çalışmalarına daha uygun hale getirir. Ayrıca, bu kültürler donöre özgü özelliklerin çoğunu korur ve hastaya özgü çalışmalarla ilgililerini korur. ALI kültür yöntemi ayrıca hem salgı hem de absorptif hücre tiplerinden oluşan daha fonksiyonel bir epitelin farklılaştırılmasını kolaylaştırarak insan bağırsak epitelinin daha temsili olmasını sağlar. Bu kültürlerin göreceli istikrarı, uzun süreli çalışmalar için olanak sağlayarak uzun süre korunmalarını sağlar. Bununla birlikte, bu yaklaşımın sınırlamaları, bir konfüçyüs monolayer oluşturmak için gereken yüksek hücre sayısı ve apikal ve bazolateral odalar arasında işlevsel bir ayrıma sahip olmak için tam bir izdiah sağlama ihtiyacıdır. 3D organoid kültürlerinde modellenebilen karakteristik mahzen mimarisi de monolayer bir kültür kurulduktan sonra kaybolur. Bununla birlikte, kültürün deneysel olarak dostane formatı ve epitelimin apikal ve bazolateral taraflarına erişilebilmesi kolaylığı, onu bağırsak fizyolojisi çalışması için güçlü bir araç haline getirir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G. S., W.C. ve S. S. STEMCELL Technologies Ltd., Cambridge (UK) çalışanlarıdır. M. S., F. E., S. L., A. E., ve R. K.C. STEMCELL Technologies Inc., Vancouver (Kanada) çalışanlarıdır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma Horizon 2020 hibe organovir tarafından finanse edildi proje Organoids for Virus Research - Yenilikçi bir eğitim-ITN programı üzerine 812673.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Yapışma Önleyici Durulama SolüsyonuSTEMCELL Technologies Inc.7010Kültür eşyalarının kaplanması için. Ana metne yapışmayı önleyici çözüm olarak atıfta bulunulur.
Konik tüpler, 15 mLSTEMCELL Teknolojileri A.Ş.38009
Organoid hatların bakımı ve kurulması için Corning Matrigel Matrisi, Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR), Fenol Kırmızısı İçermeyenCorning356231Hücre Dışı Matris (ECM).
Costar 6.5 mm veya 12 mm Transwell uçlarSTEMCELL Technologies Inc.38023/380242D Tek katmanlı kültür için.
Costar 24 Kuyu  Düz Tabanlı, Doku kültürü uygulanmış plakaSTEMCELL Technologies Inc.38017Organoid hatların bakımı ve kurulması için.
D-PBS (Ca++ ve Mg++ olmadan)STEMCELL Teknolojileri A.Ş.37350Yıkamak için 
Dimetil sülfoksit (DMSO)Millipore SigmaD2650Küçük moleküllerin
DMEM/F-12'nin 15 mM HEPESSTEMCELL Technologies Inc.36254
Nazik Hücre Ayrışma Reaktifini (GCDR)içinSTEMCELL Technologies Inc.7174Matrigel'in çıkarılması için. Ana metne ayrışma reaktifi olarak atıfta bulunulur.
IntestiCult Organoid Büyüme Ortamı (İnsan)STEMCELL Technologies Inc.6010Farklılaşmadan önce organoid hatların genişlemesi için. Ana metne Bağırsak Organoid Genişleme Ortamı olarak anılır.
IntestiCult Organoid Farklılaşma Besiyeri (İnsan)STEMCELL Technologies Inc.100-0214Tek katmanların kurulması ve 3D farklılaşması için. Ana metne Bağırsak Organoid Farklılaşma Ortamı olarak anılır.
Tripsin-EDTA (%0.05)STEMCELL Teknolojileri A.Ş.79102D Monolayer kurulumu için.
Y-27632KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ A.Ş.72302RHO / ROCK yolu inhibitörü, ROCK1 ve ROCK2'yi inhibe eder. 2D tek katmanlı kurulum için kullanılır.
Geniş çaplı uçlarCorning#TF-1005-WB-R-SOrganoidlerin taşınması
ile sulandırılması yıkamak

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Schneeberger, K., Roth, S., Nieuwenhuis, E. E. S., Middendorp, S. Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
  3. Klunder, L. J., Faber, K. N., Dijkstra, G., Van Ijzendoorn, S. C. D. Mechanisms of cell polarity - Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888(2017).
  4. DiMarco, R. L., Hunt, D. R., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates. Biomaterials. 129, 152-162 (2017).
  5. Sun, H., Chow, E. C., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  8. Zhang, Y. -G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiological Reports. 2 (9), 12147(2014).
  9. Nigro, G., Rossi, R., Commere, P. -H., Jay, P., Sansonetti, P. J. The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration. Cell Host & Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  12. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
  13. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  14. Fernando, E. H., et al. A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).
  15. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  16. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  17. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270(2017).
  18. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  19. Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
  20. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).
  21. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).
  22. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  23. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  24. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  25. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  26. Crowley, S. M., et al. Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498(2020).
  27. Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. Journal of Crohn's & Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
  28. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  29. Almeqdadi, M., Mana, M. D., Roper, J., Yilmaz, ÖH. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
  30. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  31. Kassis, T., Hernandez-Gordillo, V., Langer, R., Griffith, L. G. OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks. Scientific Reports. 9 (1), 12479(2019).
  32. Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).
  33. Gunasekara, D. B., et al. Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins. Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).
  34. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intestinal OrganoidsApical Out OrganoidsOrganoid MonolayersEpithelial PolarityExtracellular Matrix RemovalPolarity InversionAir Liquid InterfaceTight JunctionsNutrient AbsorptionHost Pathogen Interactions

Related Articles