Yöntem makalesi

Murin Kalplerde Optogenetik Çok Bölgeli Fotostimülasyon Uygulayarak İleri Kardiyak Ritim Yönetimi

DOI:

10.3791/62335

⸱

26 Ağustos 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, transgenik channelrhodopsin-2 (ChR2) farelerinin bozulmamış murin kalplerinin kardiyak ritmini, bir mikro-LED dizisi ile lokal fotostimülasyon ve epikardiyal membran potansiyelinin eşzamanlı optik haritalamasını kullanarak kontrol etmek için bir yöntem bildirmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ventriküler taşiaritmiler tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önemli bir nedenidir. Yüksek enerjili elektrik şokları kullanan elektriksel defibrilasyon şu anda hayatı tehdit eden ventriküler fibrilasyonun tek tedavisidir. Bununla birlikte, defibrilasyonun dayanılmaz ağrı, doku hasarı ve prognozun kötüleşmesi gibi yan etkileri olabilir, bu da daha yumuşak kardiyak ritim yönetimi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir tıbbi ihtiyacı gösterir. Enerji azaltıcı elektriksel yaklaşımların yanı sıra, kardiyak optogenetik, ışığa duyarlı membran iyon kanalları ve ışık darbeleri kullanarak kardiyak aktiviteyi etkilemek için güçlü bir araç olarak tanıtıldı. Bu çalışmada, Langendorff perfüze edilmiş sağlam murin kalplerinin başarılı fotostimülasyonu için sağlam ve geçerli bir yöntem, 3 x 3 mikro ışık yayan diyotlar dizisi (mikro-LED) uygulanan çok bölgeli pacing temelinde tanımlanacaktır. Epikardiyal membran voltaj dalgalarının eşzamanlı optik haritalanması, bölgeye özgü stimülasyonun etkilerinin araştırılmasına izin verir ve yeni indüklenen kardiyak aktiviteyi doğrudan yerinde değerlendirir. Elde edilen sonuçlar, defibrilasyonun etkinliğinin, kardiyak aritmi sırasında fotostimülasyon için seçilen parametrelere güçlü bir şekilde bağlı olduğunu göstermektedir. Kalbin aydınlatılmış bölgesinin sonlandırma başarısı için çok önemli bir rol oynadığı ve aritmi paternlerinin değiştirilmesi için aydınlatma sırasında kardiyak aktivitenin hedeflenen kontrolünün nasıl sağlanabileceği gösterilecektir. Özetle, bu teknik, kardiyak ritmin gerçek zamanlı geri besleme kontrolüne giden yolda yerinde mekanizma manipülasyonunu optimize etme imkanı ve bölgeye özgüllük açısından, spesifik olmayan elektrik şoku uygulamalarının kullanımına kıyasla kalp sistemine potansiyel zararı azaltmada yeni yaklaşımlar sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aritmi sırasında mekansal-zamansal dinamiklerin erken araştırmaları, kardiyak fibrilasyon sırasındaki karmaşık elektriksel paternlerin vorteks benzeri dönen uyarma dalgaları tarafından yönlendirildiğini ortaya koymuştur1. Bu bulgu, aritmilerin altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler verdi ve bu da daha sonra miyokard 2,3,4'ün çok bölgeli uyarılmasına dayanan yeni elektriksel sonlandırma tedavilerinin geliştirilmesine yol açtı. Bununla birlikte, elektrik alan stimülasyonu kullanan tedaviler lokal değildir ve kas dokusu da dahil olmak üzere çevredeki tüm uyarılabilir hücreleri innerve edebilir, hücresel ve doku hasarına ve dayanılmaz ağrıya neden olabilir. Elektriksel tedavilerin aksine, optogenetik yaklaşımlar, kardiyomiyosit aksiyon potansiyellerini yüksek uzamsal ve zamansal hassasiyetle uyandırmak için spesifik ve doku koruyucu bir teknik sağlar. Bu nedenle, optogenetik stimülasyon, kardiyak fibrilasyon sırasında kaotik aktivasyon paternlerinin minimal invaziv kontrolü için potansiyele sahiptir.

Işığa duyarlı iyon kanalı channelrhodopsin-2'nin (ChR2) genetik manipülasyon 5,6,7 yoluyla uyarılabilir hücrelere sokulması, fotostimülasyon kullanılarak uyarılabilir hücrelerin membran potansiyelinin depolarizasyonunu sağlamıştır. Nöronal ağların aktivasyonu, kardiyak aktivitenin kontrolü, görme ve işitmenin restorasyonu, omurilik yaralanmalarının tedavisi ve diğerleridahil olmak üzere çeşitli tıbbi uygulamalar geliştirilmiştir 8,9,10,11,12,13,14. ChR2'nin kardiyolojide uygulanması, milisaniye yanıt süresi15 nedeniyle önemli bir potansiyele sahiptir ve bu da onu aritmik kardiyak dinamiklerin hedeflenen kontrolü için çok uygun hale getirmektedir.

Bu çalışmada, transgenik bir fare modelinin sağlam kalplerinin çok bölgeli fotostimülasyonu gösterilmiştir. Özetle, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) kapsamında transgenik bir alfa-MHC-ChR2 fare hattı kurulmuş ve Prof. S. E. Lehnart tarafından sağlanmıştır. Genel olarak, alfa-MHC kontrolü altında Cre-rekombinaz eksprese eden transgenik yetişkin erkek C57 / B6 / J, dişi B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm27.1 (CAG-COP4 * H134R / tdTomato) Hye / J ile çiftleşmek üzere eşleştirildi. Kardiyak STOP kaseti ikinci nesilde silindiğinden, yavrular stabil bir MHC-ChR2 ekspresyonu gösterdi ve kardiyak ışığa duyarlı kolonileri korumak için kullanıldı. Tüm deneyler, 36-48 haftalıkken her iki cinsiyetten yetişkin farelerle yapıldı. Aydınlatma, silikon bazlı mahfaza ve kısa optik cam elyaflarının uygulanmaması dışında,16,17'de açıklandığı gibi imal edilen 3 x 3 mikro-LED dizisi kullanılarak elde edilir. Kardiyak bir uygulamada ilk kullanımı18 yılında bulunur. Benzer bir imalat teknolojisine dayanan doğrusal bir mikro-LED dizisi, kalp hızı19 için nüfuz edici bir prob olarak uygulanmıştır. Mikro LED'ler, 550 μm'lik bir aralıkta 3 x 3'lük bir dizilim halinde düzenlenmiştir ve çok küçük bir alanda hem yüksek uzamsal çözünürlük hem de yüksek radyant gücü sağlar. Yazarlar bu çalışmada, yeni anti-aritmik tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinin yolunu açabilecek çok yönlü bir yerel çok bölgeli fotostimülasyon göstermektedir.

Aşağıdaki deneysel protokol, kanüle aortun perfüzyon girişi olarak işlev gördüğü retrograd Langendorff perfüzyon ex vivo'yu içerir. Uygulanan perfüzyon basıncı ve kardiyak kasılma nedeniyle perfüzyon, aorttan ayrılan koroner arterlerden akmaktadır. Sunulan çalışmada, kalp, perfüzyon rezervuarlarının 1 m yüksekliğe, 73.2 mmHg'ye eşdeğer olarak 2.633 ± 0.583 mL / dak akış hızına ulaşmasıyla elde edilen sabit bir basınç ayarı kullanılarak perfüze edilir. Deney sırasında iki çeşit Tyrode çözeltisi perfüzyon olarak kullanılır. Düzenli Tyrode çözeltisi kararlı bir sinüs ritmini desteklerken, Low-K + Tyrode çözeltisi, murin kalplerinde aritmi indüksiyonunu sağlamak için Pinacidil ile karıştırılır. Altıgen bir su banyosunun kullanılması, kalbin altı farklı düzlemsel pencereden gözlemlenmesine izin verir ve birkaç optik bileşenin kırılma ile daha az bozulma ile birleştirilmesine izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler, Alman mevzuatı, yerel hükümler ve Avrupa Laboratuvar Hayvanları Bilimi Dernekleri Federasyonu'nun (FELASA) tavsiyelerine uygun olarak hayvan refahı yönetmeliğini sıkı bir şekilde takip etti. Hayvan deneylerinin onaylanması için yapılan başvuru, sorumlu hayvan refahı otoritesi tarafından onaylanmış ve tüm deneyler hayvan refahı temsilcilerimize bildirilmiştir.

1. Deney hazırlama ve materyalleri

  1. Optik haritalama kurulumu
    NOT: Optik kurulum ve elektrik kurulumu Şekil 1'de gösterilmiştir. Optik ve elektrik kurulumunda kullanılan tüm bileşenler Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak listelenmiştir.
    1. Aritmi indüksiyonu ve yedek defibrilasyon için LED 1 ve LED 2 kullanın. ChR26'nın uyarma dalga boyunun zirvesi olan 475 nm'ye yakın λmavi dalga boyuna sahip yüksek güçlü LED'leri seçin. Optik spektrumu daha da daraltmak için 470 ± 20 nm bandpass filtresi kullanın.
      NOT: Bu çalışmada, veri sayfası20'ye göre, LED 1 ve LED 2, 3,9 ila 5,3 W tipik bir radyant akıya sahiptir.
    2. Optik haritalama için epikardiyumu, λ kırmızı = 625 nm merkez dalga boyuna ve 700 mW 21 radyant akıya sahip ışık yayan yüksek güçlükırmızı bir LED (Şekil1'de LED 3) ile aydınlatın. Kırmızı ışık, 628 ± 20 nm bandpass filtresi ile filtrelenir ve λ DM = 685 nm kesme dalga boyuna sahip uzun geçişli dikroik ayna (DM ) tarafından yansıtılır.
    3. Sadece kardiyak aktivitenin floresan emisyonunu kaydetmek için kamera hedefinin önünde λfiltre kamı = 775 ± 70 nm olan bir emisyon filtresi kullanın. Düşük ışıklı uygulamalar için çok uygun olan hızlı bir hedef kullanın.
      NOT: Bir fare kalbinin fibrilasyon frekansı 20 ila 35 Hz arasında değişir; bu nedenle, 1 ila 2 kHz veya daha yüksek bir frekansta kayıt yapmak için yeterince hızlı bir kamera kullanın.
  2. Mikro-LED dizisi
    NOT: Burada uygulanan mikro-LED dizileri,16,17 başka bir yerde daha ayrıntılı olarak açıklandığı gibi mikro sistem işleme kullanılarak gerçekleştirilir.
    1. Spin, 5 μm kalınlığında bir poliimid (PI) tabakayı 4 inç silikon substratlar üzerine (tek tarafı cilalı, 525-μm kalınlığında) kaplayın.
    2. Bu PI tabakasını azot atmosferi altında maksimum 450 °C sıcaklıkta kürleyin. Maksimum sıcaklığı 10 dakika boyunca sabit tutun.
    3. Ultraviyole (UV) litografi kullanarak bir görüntü tersine çevrilmiş fotodirenci (PR) biriktirin ve desenleyin ve püskürtün, 250 nm ince bir platin tabaka (Pt) biriktirin.
    4. Bu Pt bazlı metalizasyonu, maskeleme tabakası görevi gören desenli PR ile 1 μm kalınlığında altın (Au) bir tabakayı elektro kaplama yaparak kalınlaştırın.
    5. İkinci bir PI katmanını spin kaplamadan önce, gofreti ilk PI tabakası ve Au-elektrolize metalizasyonu ile PI tabakasının yüzeyini kimyasal olarak aktive eden bir oksijen plazmasına maruz bırakın.
    6. İkinci PI katmanını 450 ° C'de tekrar kürleyin, bir PR katmanını modellemek için UV litografisi uygulayın ve desenli PR'yi maskeleme katmanı olarak kullanarak reaktif iyon aşındırma (RIE) ile mikro-LED çipleri ve ara yüzey baskılı devre kartı (PCB) için dizinin temas pedlerini açın.
      NOT: Bu RIE işlem adımlarında, kontak pedi açıklıklarını ve iki boyutlu (2B) mikro-LED dizisinin dış şeklini tanımlamak için sırasıyla 10 ve 30 dakika boyunca 200 W ve 100 W uygulanması önerilir.
    7. PR'yi çözücüler ve plazma aşındırma kullanarak sıyırın. Ek 6 μm kalınlığında altın tabakayı elektro kaplama yaparak temas pedlerini daha da kalınlaştırın.
    8. Mikro-LED çipleri, bir flip-chip bağlayıcı kullanarak temas pedlerine takın.
    9. PI yüzeyini bir oksijen plazmasında etkinleştirin ve mikro-LED çiplerini solventsiz bir yapıştırıcı ile doldurun. Daha sonra yapıştırıcıyı 120 ° C'de 12 saat kürleyin.
    10. Mikro-LED çipleri kapsüllemek için, Argon ile başka bir plazma işlemi gerçekleştirin ve manuel olarak ince bir floropolimer tabakası uygulayın. Bu tabakayı 1 saat boyunca 80 ° C'de önceden kürleyin.
    11. Mikro-LED dizisini altta yatan floropolimer tabakasına silikon yapışmasını iyileştirmek için kullanılan bir oksijen plazmasına maruz bıraktıktan sonra silikonu son kapsülleme tabakası olarak manuel olarak uygulayın. Silikon tabakayı her biri 1 saat boyunca 80 °C ve 180 °C'de kürleyin. Bu son kürleme adımları aynı zamanda floropolimer tabakasını tamamen iyileştirir.
    12. PI substratının temas pedlerini, dizinin harici bir enstrümantasyona birbirine bağlanması için şerit konektörleri taşıyan baskılı bir devre kartına lehimleyin. PCB üzerindeki lehim pedlerini bir yapıştırıcı kullanarak örtün.
  3. Elektrik tesisatı
    1. Kalbin elektriksel aktivitesini sürekli izlemek için bir elektrokardiyogram (EKG) kaydetmek için uygun elektrotlar, örneğin gümüş / gümüş-klorür elektrotları veya Monofazik Eylem Potansiyeli (MAP) elektrotları ve bir EKG amplifikatörü kullanın. Ayrıca, elde edilen tüm elektrik sinyallerini kaydetmek için uygun bir toplama cihazı (AD) kullanın.
    2. Her aygıta uygulanan maksimum akımı yönetebilen yüksek güçlü LED'ler (LED 1, LED 2 ve LED 3) için çok uygun bir sürücü seçin. LED sürücülerin çıkışını doğru bir şekilde kontrol etmek için rastgele bir işlev üreteci (AFG) kullanın.
    3. Mikro LED dizisinden akan akımı kontrol etmek için çok kanallı bir LED sürücüsü kullanın. Birden fazla çıkışa sahip bir AFG de bu görev için uygundur.
      NOT: Akımı mikro-LED'in maksimum akımıyla sınırlayan LED sürücülerin seçilmesi önerilir, aksi takdirde diyotlar hasar görebilir. Çok kanallı bir mikro-LED sürücünün bir örneği başka bir çalışmada açıklanmıştır18. Gerekirse, mikro LED ayarlarını uzaktan denetlemek için AFG veya başka bir LED sürücüsü bir bilgisayara bağlanabilir. Bu durumda, LED sürücüsünü seçtiğiniz iletişim protokolüyle bilgisayara bağlayın, örneğin Genel Amaçlı Arabirim Veri Yolu (GPIB) veya seri bağlantı.

   

2. Deneysel prosedürler

  1. Çözelti hazırlama
    1. Tyrode çözeltisini hazırlayın: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1.8 mM CaCl 2, 1.2 mM KH 2 PO4, 5.6 mM Glikoz,% 0.1 BSA/ Albümin.
    2. Low-K+ Tyrode çözümünü hazırlayın: Low-K+ Tyrode'lar, KCl miktarının sadece yarısı eklenmesi dışında normal Tyrode çözeltisiyle aynı şekilde yapılır (4 mM KCl yerine 2 mM).
      NOT: 3 saat süren bir deney için genellikle 2-3 L Low-K+ Tyrode (ayrıca optik haritalama yapılırsa Blebbistatin (Adım 2.1.5) ile karıştırılır) ve 1-2 L normal Tyrode yeterlidir.
    3. 100 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için22'de açıklandığı gibi aritmi indüksiyon işlemini kolaylaştırmak için Low-K + Tyrode çözeltisine Pinacidil ekleyin. Pinacidil'i kullanırken koruyucu laboratuvar eldivenleri giyin.
    4. Düzenli Tyrode çözeltisi ile 1 mL 50 μM DI-4-ANBDQPQ hazırlayın. Fotobeyazlatmayı önlemek için boyayı ışıktan koruyun.
    5. 10 mM'lik bir Blebbistatin stok çözeltisi yapın. Optik haritalama için, 5 μM'lik bir çözelti elde etmek için Blebbistatin'i 100 mM Pinacidil-Tyrode çözeltisi (Adım 2.1.3) ile karıştırın. Blebbistatin'i kullanırken koruyucu laboratuvar eldivenleri giyin.
      NOT: Optik haritalama başlayana kadar hem boyayı hem de Blebbistatin çözeltisini bir kenara bırakın.
  2. Langendorff perfüzyonu
    NOT: Kurulum, iki Tyrode çözümü için iki rezervuardan oluşur. Üç yönlü musluklara sahip tüplerle bir kabarcık tuzağına bağlanırlar. Kalp daha sonra bir Luer kilit konektörü ile kabarcık tuzağına bağlanır ve daha sonra altıgen bir su banyosunda askıya alınır. Su banyosu, sırayla, kullanılmış Tyrode çözeltisini toplamak için bir atık kabına bağlanır.
    1. Her deneyden önce tüm tüpleri tamamen demineralize su ile temizleyin.
    2. Deneye başlamadan önce her iki Tyrode çözeltisini de oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Karbojenli (%5 CO 2ve % 95O2) havalandırın. Tyrode çözeltilerinin pH değerini NaOH ile 7,4'e ayarlayın.
    3. Her Tyrode çözeltisinin 500 mL'sini ilgili rezervuara doldurun ve tüplerde veya kabarcık tuzağında daha fazla sıkışmış hava kabarcığı görülmeyene kadar Tyrode'un çözeltisini perfüzyon sisteminden geçirerek tüplerin ve kabarcık tuzağının havasını giderin.
    4. Perfüzyonun pH'ının daha sonra perfüzyon sırasında sabit kalmasını sağlamak için rezervuarlardaki tüm deney boyunca Tyrode çözeltilerini Karbojenle havalandırmaya devam edin.
    5. Perfüzyon sistemini bir su ısı pompası ile 37 ° C'ye ısıtın. Su geçirmez bir ısıtma kablosu gibi ek bir ısıtma elemanı kullanarak su banyosu içinde perfüzyon sıcaklığını sabit tutun.
      NOT: Deney sırasında, Tyrode'un rezervuarlarını boş çalışmadan önce yeniden doldurmak çok önemlidir. Aksi takdirde, hava kabarcıkları kalbe girebilir, bu da damarları tıkayabilir ve iskemiye yol açabilir.
  3. Fare Hazırlığı
    1. Kalp izolasyon prosedüründen 30 dakika önce deri altından 0.1 mL 500 yani Heparin enjekte edin.
    2. 6 cm'lik bir Petri kabını ve 2 mL'lik bir şırıngayı buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi ile doldurun. Stereoskopik mikroskop altına yerleştirin.
    3. 2 dakika boyunca doymuş bir İzofluran ortamı ile farelerin kısa süreli anestezisini ve daha sonra derhal servikal çıkığı gerçekleştirin.
      NOT: Yeterli anesteziyi doğrulamak için negatif ayak parmakları arası refleksin kontrol edilmesi kesinlikle gereklidir.
    4. Göğsü açın, başka bir yerde açıklandığı gibi kalbi çıkarın23 ve buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi ile 6 cm'lik Petri kabına yerleştirin. Kardiyak atım, sıcaklık düşüşü nedeniyle azalacaktır.
    5. İnce hazırlığı, başka bir yerde detaylandırıldığı gibi stereoskopik bir mikroskop altındayapın 23. Aortu künt iğneye takın ve damarı dikiş malzemesiyle sabitleyin.
    6. Bir kontrol olarak, buz gibi soğuk Tyrode'un solüsyonunu iğneden kalbe enjekte edin ve kalbin sıkıca monte edildiğini kontrol edin. Bu adım aynı zamanda kalpten kalan kanı da durular.
    7. Monte edilmiş kalbi perfüzyon sistemine aktarın. İğneyi kabarcık tuzağına bağlarken havanın kalbe girmesini önlemek için perfüzyonun aktığından emin olun. Kalbin su banyosunda Tyrode çözeltisi ile kaplı olup olmadığını kontrol edin. Adım 2.3.4, 2.3.5 ve 2.3.7 Şekil 2'de gösterilmiştir.
    8. Kalbin birkaç dakika içinde atmaya başladığından emin olun. Kalbin 15 ila 20 dakika boyunca perfüzyon kurulumuna adapte olmasına izin verin, ardından optik haritalama yapılacaksa, Pinacidil ile düşük K + Tyrode çözeltisine (Adım 2.1.3) sırasıyla Pinacidil ve Blebbistatin ile düşük K + Tyrode çözeltisine (Adım 2.1.5) geçin.
  4. Aritmi indüksiyonu ve optik defibrilasyon
    1. İyi sinyal kalitesi sağlamak için EKG elektrotlarından birini kalp yüzeyine mümkün olduğunca yakın yerleştirin. İkinci EKG elektrodunu Tyrode çözeltisinde askıya alın. Edinilen EKG'nin tercih edilen AD tarafından kaydedildiğinden emin olun.
    2. Mikro-LED dizisini çalışmanın ilgi alanına, örneğin sol ventriküle yerleştirin.
    3. Perfüzyonu Pinacidil ile düşük K + Tyrode'lara değiştirin ve kalbi 15 ila 30 dakika boyunca perfüze edin.
    4. Aritmi indüklemek için, kalbi LED 1 ve LED 2 ile, 25 ila 35 Hz frekans find, 2 ila 15 ms darbe Wind ve 2,8 mW mm-2 ışık yoğunluğu LIopt_ind ile 20 ila 50 ışık darbesinden oluşan bir trenle aydınlatın.
    5. Aritmi indüklenene kadar işlemi tekrarlayın.
      NOT: EKG sinyalinde aritmilerin tanımlanması kolaydır, çünkü sinyalin frekansı ve morfolojisi normal sinüs ritminden farklıdır. Aritmi sonraki 5 saniye içinde sona ererse, kendi kendine sonlanan olarak sınıflandırın ve yeni bir indüksiyon girişimi başlatın.
    6. Sürekli bir aritmi görsel olarak tespit edildikten sonra, 15 mA'lık bir darbe akımında dizinin üç, altı veya dokuz mikro LED'ini kullanarak, farklı genişliklerde W def ve frekansları fdef olan birdarbe patlaması uygulayın I darbe, ışık yoğunluğuna LIμLED = 33.31 ± 2.05 mW mm-2'ye kadar verir.
    7. Beş mikro-LED dizi tabanlı defibrilasyon denemesinden sonra aritmi devam ederse, girişimi başarısız olarak sınıflandırın ve yedek defibrilasyona başlayın.
    8. Yedek defibrilasyon için, mikro LED dizisi için ayarlanan zamanlama parametrelerinin aynısını kullanarak LED 1 ve LED 2'yi kullanın.
      NOT: Kalp tüm deney süresi boyunca iskemik ve metabolik strese maruz kaldığından, yedek defibrilasyonda bile aritmi sonlandırma girişimlerinin başarısız olması mümkündür. Bu olduğunda, perfüzyon solüsyonunu normal Tyrode'lara değiştirin ve kalbin 5 ila 10 dakika iyileşmesine izin verin. EKG sinüs ritmine döndüğünde, Adım 2.4.3'teki protokolü tekrar tekrarlayın.
  5. Optik Haritalama
    1. Kalbi Adım 2.1.5'te hazırlanan Blebbistatin çözeltisi ile perfüze edin ve mekanik ayrılma gerçekleşene kadar bekleyin. Bu, kalp atmayı bıraktığında gerçekleştirilir, ancak bir EKG sinyali hala ölçülebilir.
      NOT: Blebbistatin çözeltisinin belirtilen konsantrasyona karıştırılması ve kalbin bu çözelti ile perfüze edilmesi, tüm deney boyunca elektriksel aktiviteden ayrılan kardiyak mekanik aktiviteyi korur.
    2. 1 mL gerilim boyası DI-4-ANBDQPQ'yu (Adım 2.1.4'te hazırlanmıştır) Langendorff perfüzyonunun kabarcık tuzağında bir bolus olarak verin. Boyanın kalbi düzgün bir şekilde delmesine izin vermek için 5 ila 10 dakika bekleyin.
      NOT: Kayıt yapılmadığında kırmızı ışığı kapatarak boyanın fotobeyazlatılmasını önleyin. Kaydın sinyal-gürültü oranı çok küçülürse (alınan sinyal çok gürültülüyse), 2.1.4 ve 2.5.2 numaralı adımları tekrarlayın.
    3. Fotoğraf makinesini kalp yüzeyine odaklayın, LED 3'ü açın ve 1,27 mW mm-2 optik güç uygulayın.
    4. Laboratuvar ışıklarını kapatın ve kayda başlayın. Elde edilen sinyalin frekansını kaydedilen EKG'nin frekansı ile karşılaştırarak optik bir sinyalin alındığından emin olun. Bu, elde edilen optik sinyalin tamamen kalbin elektriksel aktivitesi ile ilgili olmasını sağlar.
      NOT: Boyanın yaydığı floresan ışığı çok hafta olduğundan, optik haritalama karanlık bir odada yapılır. Bu, diğer ışık kaynaklarından gelen sinyal parazitini önler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, LED 1 ve LED 2 (Şekil 1) tarafından üretilen fotostimülasyon darbelerini kullanarak sağlam murin kalplerde ventriküler aritmilerin indüklenmesine izin verir ve 25 Hz ile 35 Hz arasında bir frekans f ind ve 2 ms ile 10 ms arasında bir nabız süresi Wind. Bu kadar hızlı ışık darbelerinin amacının kalp ritmini yakalamak değil, kardiyak aktivitenin dengesini bozmak olduğunu, böylece düzensiz elektrik dalgalarının üretilebileceğini ve bunun da bir aritmi kolaylaştır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak taşiaritmilerin başarılı bir tedavisi kardiyak tedavinin anahtarıdır. Ancak aritmi başlangıcı, sürekliliği ve sonlandırılmasının altında yatan biyofiziksel mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, kardiyak araştırmalar, elektrik şoku tedavisini aritmilerin daha yumuşak bir şekilde sonlandırılmasına yönelik olarak optimize etmeyi ve böylece hastaların yaşam kalitesini arttırmayı amaçlamaktadır 28,29,30,31.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, deneyler sırasında mükemmel teknik destekleri için Marion Kunze ve Tina Althaus'a teşekkür eder. Sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı FP7/2007-2013'ten HEALTH-F2-2009-241526 hibe anlaşması numarası altında fon almıştır. Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi, DZHK e.V. (Proje MD28), ortak site Goettingen, Alman Araştırma Vakfı CRC 1002 (proje C03) ve Max Planck Derneği tarafından da destek sağlandı. Bu çalışma kısmen Alman Araştırma Vakfı tarafından finanse edilen BrainLinks-BrainTools, Mükemmellik Kümesi (DFG, hibe numarası EXC 1086) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kimyasal Bileşenler
BlebbistatinTargetMolT603810 mM stok çözeltisi
BSA/AlbuminSigma-AldrichA4919
Kalsiyum KlorürSigma-AldrichC1016CaCl2
CarbogenWestfalen50 l şişe
DI-4-ANBDQPQAAT Bioquest21499Optik Haritalama
Boyası GlikozSigma-AldrichD9434 C6H12O6
HeparinLEO PharmaHeparin-Natrium Leo 25.000 IE/5 ml, sadece reçete ile temin edilebilir
Hidroklorid AsitMerck1.09057.1000HCl, 1 M stok çözeltisi
İzofluranCP Pharma1 ml/ml, sadece reçete ile mevcuttur
Magnezyum KlorürMerck8.14733.0500MgCl2
Monopotasyum FosfatSigma-Aldrich30407KH2PO4
Pinacidil monohidratSigma-AldrichP154-500mg10 mM stok çözeltisi
Potasyum KlorürSigma-AldrichP5405KCl
Sodyum BikarbonatSigma-AldrichS5761NaHCO3
Sodyum KlorürSigma-AldrichS5886NaCl
Sodyum HidroksitMerck1.09137.1000NaOH, 1 M stok çözümü
Elektrik Kurulumu
Biopac MP150Biopac SistemleriMP150WSWveri toplama ve analiz sistemi
Özel yapım EKG, alternatif ECG100CBiopac SistemleriECG100CElektrokardiyogram Amplifikatörü
Isıtma kablosu kullanarak özel yapım su banyosu ısıtıcısıRMS Isıtma SistemiHK-5,0-12Isıtma kablosu 120W
Altıgen su banyosu
LED Sürücü Güç kaynağıThorlabsKPS10115 V, 2.4 A Güç Kaynağı Ünitesi, Bir K veya T-Küp için 3.5 mm Jak Konnektörü.
LEDD1B LED SürücüThorlabsLEDD1BT-Cube LED Sürücü, 1200 mA Maksimum Sürücü Akımı
MAP, EKG ElektroduHugo Sachs ElektronikBS4  73-0200İzole edilmiş kalpler için Mini-EKG Elektrodu
mikro LED Sürücü, örneğin AFGAgilent InstrumentsA-2230Keyfi fonksiyon üreteci (AFG)
Sinyal ÜreteciAgilent InstrumentsA-2230AFG
mikro-LED Dizi Bileşenleri
Epoksid yapıştırıcıEpoksi TeknolojisiEPO-TEK 353NDİki bileşenli epoksi
Floropolimer  Asahi Cam Co., Ltd.Yüksek şeffaflığa sahipCytop 809M
Görüntü ters fotorezistMerck KGaAAZ 5214Eiçin Görüntü Tersine Çevirme Direnci
  Cree A.Ş.C460TR2227-S2100Mavi mikro-LED
FotorezistMerck KGaAAZ 9260Kalın Pozitif Fotorezistler
PoliimidUBE Industries Ltd.U-Varnish SPoliimid Çözeltisi
SilikonNuSil Technology LLCMED-6215Düşük viskoziteli silikon elastomer
Solventsiz yapıştırıcıJohn P. Kummer GmbHEpo-Tek 301-2Düşük viskoziteli epoksi reçine
Optik Haritalama
Mavi FiltreChroma Technology CorporationET470/40xMavi uyarma filtresi
KameraFotometrisiCascade 128 +Yüksek performanslı EMCCD Kamera
Kamera ObjektifiNavitarDO-5095Navitar yüksek hızlı sabit odak uzaklığına sahip lensler CCD ve CMOS kameralarla çalışır
Dikroik AynaSemrockFF685-Di02-25x36685 nm kenar BrightLine® tek kenarlı standart epi-floresan dikroik ışın ayırıcı
EmisyonFiltresi SemrockFF01-775/140-25775/140 nm BrightLine® tek bantlı bant geçiren filtre
SoğutucuGelişmiş Termal ÇözümlerATSEU-077A-C3-R0Isı Emiciler - LED STAR LED Soğutucu, 45 mm çap, 68 mm, Siyah/Gümüş, Dişsiz Taban Plakası Donanım
LED 1 ve LED 2LED Engin OsramLZ4-00B208Yüksek Güçlü LED'ler - Tek Renk Mavi, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3ThorlabsM625L3625 nm, 700 mW (Min) Monte LED, 1000 mA
LenslerLED Engin OsramLLNF-2T06-HLED Aydınlatma Lensleri Montajları LZ4 LENS DAR TAŞKIN IŞIN
Güç ölçer için fotodiyotThorlabsS120VCStandart Fotodiyot Güç Sensörü
Güç ÖlçerThorlabsPM100DKompakt Güç ve Enerji Ölçer
KırmızıFiltre SemrockFF02-628/40-25BrightLine® Tek bantlı bant geçiren filtre
Floropolimer Yüksek Çözünürlüklü LED çipi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101(2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618(2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086(2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. 36th Annual Internation Conference IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Chicago, IL, , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. 28th IEEE Proceedigns. MEMS, Estoril, , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. 40thAnnual International Conference of IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Honolulu, HI, , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. mouser.de, LED Engin, [Online]. , Available: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208- 1531969.pdf (2020).
  21. thorlabs.com, thorlabs, [Online]. , Available: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020).
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Computing in Cardiology, Belfast, , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692(2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477(2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337(2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kardiyak OptogenetikVentrik ler Ta ikardiOptik HaritalamaMikro LED DizisiLangendorff Perf zyonuKardiyak DefibrilasyonEpikardiyal Voltaj HaritalamaAritmi Sonland r lmas

İlgili makaleler