Yöntem makalesi

Doğal Öldürücü (NK) ve Membran Bound-IL-21-Modifiye B Hücre Hattı Kullanarak CAR-NK Hücre Genleşme Yöntemi

DOI:

10.3791/62336

⸱

8 Şubat 2022

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Immunology and Laboratory Medicine, Rutgers-New Jersey Medical School, 2Department of Microbiology, Biochemistry & Molecular Genetics, Public Health Research Institute Center, New Jersey Medical School, Rutgers University, 3Center for Immunity and Inflammation, New Jersey Medical School, Rutgers-The State University of New Jersey

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, periferik kan doğal öldürücü (PBNK), karaciğer dokularından NK hücreleri ve periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) veya kordon kanından (CB) türetilen kimerik antijen reseptörü (CAR)-NK hücrelerini genişletmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, genişlemiş NK hücrelerinin optimize edilmiş saflığına ek olarak, 221-mIL-21 besleyici hücreler kullanılarak NK ve CAR-NK hücrelerinin genişlemesini göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimerik antijen reseptörü (CAR) modifiye immün hücre tedavisi, kanserler ve bulaşıcı hastalıklar için gelişmekte olan bir tedavi haline gelmiştir. NK bazlı immünoterapi, özellikle CAR-NK hücresi, hayatı tehdit eden ciddi toksisite olmaksızın en umut verici 'kullanıma hazır' gelişmelerden biridir. Bununla birlikte, başarılı bir CAR-NK tedavisi geliştirmenin darboğazı, üçüncü bir taraftan yeterli sayıda kapsamlı olmayan, uzun ömürlü, 'kullanıma hazır' CAR-NK hücresi elde etmektir. Burada, genetiği değiştirilmiş bir interlökin-21 (IL-21) membran formunu ifade eden bir Epstein-Barr virüsü (EBV) dönüştürülmüş B hücre hattı kullanarak yeni bir CAR-NK genişleme yöntemi geliştirdik. Bu protokolde, NK ve CAR-NK hücrelerini kordon kanı ve periferik kandan ve ayrıca katı organ dokularından genişletmek için adım adım prosedürler sağlanmaktadır. Bu çalışma, CAR-NK immünoterapisinin klinik gelişimini önemli ölçüde artıracaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğal öldürücü (NK) hücreler, CD56'yı eksprese eden ve T hücre belirteci CD3 1,2'nin ekspresyonundan yoksun lenfositlerin önemli bir alt kümesidir. Konvansiyonel NK hücreleri, viral olarak enfekte olmuş hücrelerin ve kanserli hücrelerin immünsüveyöründen sorumlu doğuştan gelen immün hücreler olarak sınıflandırılır. T hücrelerinin aksine, NK hücreleri CD16 veya diğer aktive edici reseptörleri kullanarak enfekte veya malign hücreleri tanır ve antijen peptitleri ile majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I molekülleri 3,4 arasında bir kompleks oluşumunu gerektirmez. Relaps veya refrakter CD19 pozitif kanserleri (Hodgkin dışı lenfoma veya kronik lenfositik lösemi [CLL]) tedavi etmek için kimerik antijen reseptörü (CAR)-NK hücrelerini kullanan son klinik araştırmalar, CAR-NK hücrelerinin olağanüstü güvenlik avantajlarını göstermiştir5. Örneğin, CAR-NK hücre infüzyonu minimal veya ihmal edilebilir greft versus host hastalığı (GVHD), nörotoksisite, kardiyotoksisite ve sitokin salınım sendromu (CRS) 6,7,8,9,10 ile ilişkilidir. Bununla birlikte, insan NK hücrelerini genişletmeye yönelik geleneksel yöntemler, güçlü kardeş öldürücü öldürme ve telomer kıtlığı ile kapsamlı fenotipler göstermiştir, bu da evlat edinilmiş immünoterapi için yeterli sayıda fonksiyonel NK hücresi elde etmede büyük bir zorluk teşkil etmektedir11.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, birincil NK hücrelerini doğrudan fraksiyone edilmemiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) veya kordon kanından (CB) ışınlanmış ve genetiği değiştirilmiş bir 721.221 (bundan böyle 221) hücre hattı, MHC sınıf I moleküllerinin düşük ekspresyonuna sahip bir insan B-lenfoblastoid hücre hattı kullanarak genişletmek için bir yöntem geliştirilmiştir3. Önceki çalışmalar IL-21'in NK hücre genişlemesindeki önemini göstermiştir; Bu nedenle, 721.221 hücre hattının bir versiyonunu ifade eden genetiği değiştirilmiş membrana bağlı bir IL-21 (şu andan itibaren, 221-mIL-21) 11,12,13,14,15 geliştirilmiştir. Sonuçlar, 221-mIL-21 besleyici hücre genişletilmiş birincil NK hücrelerinin, yaklaşık 2-3 hafta boyunca kalıcı yüksek NK hücre saflığı ile ortalama >40.000 kata kadar genişlediğini göstermiştir. Bu protokolün uygulanmasıyla ilgili ek bilgiler Yang ve ark.16'da bulunabilir.

Bu protokol, PBNK, CBNK, doku kaynaklı NK ve CAR-NK hücrelerinin ex vivo olarak yeni genişlemesinin adım adım prosedürünü göstermeyi amaçlamaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoldeki insan dokuları ve kanla ilgili çalışmalar, Rutgers Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (IRB) yönergelerini takip etmektedir.

1. Şekil 1'de gösterildiği gibi karaciğer dokularından NK hücresi genişlemesi (Gün 0).

NOT: İlk hücre sayısı ve canlılık, organ çıkarılmasından bu yana geçen süre ve ilk doku numune miktarı ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bununla birlikte, dokular 30 mL'lik Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS) yerleştirilirse ve gece boyunca 4 ° C'de buzda veya buzdolabında tutulursa, NK hücreleri hala 24 saate kadar yüksek saflıkta ve canlılıkta genişletilebilir.

  1. Steril cerrahi ekipman kullanarak dokulardan ve kesitlerden lenfositler elde etmek için uygun doku alanlarını tanımlayın.
  2. Dokuları 30 mL HBSS'ye (kalsiyum veya magnezyum olmadan) yerleştirin ve izolasyona hazırlanmaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
  3. Bir biyogüvenlik kabini içinde steril tıraş bıçağı veya makas ve forseps kullanarak dokuyu <0,5 cm'lik küpler halinde kesin.
  4. HBSS'de 10x stoğu seyrelterek 1x kollajenaz IV çözeltisi (1 mg / mL) hazırlayın (10x Kollajenaz IV: 10 mg / mL veya ~ 200 U / mL).
  5. Kıyılmış doku parçalarını doku ayrışma tüplerine yerleştirin. Tüpleri en fazla 4 g doku ile doldurun ve doku parçalarını ~ 10 mL 1x kollajenaz IV içine batırın.
    NOT: DNase I kullanılması, NK canlılığını ve verimini biraz azaltabileceğinden önerilmez. Kullanılan spesifik doku ayrıştırıcı tüpler için lütfen Malzeme Tablosuna bakın.
  6. Doku ayrıştırıcı tüplerini bir doku ayrıştırıcısına yerleştirin ve dokuyu iyice kıymak için 37 ° C'de karıştırın.
    NOT: Karaciğer dokusu için bu işlem 30 dakikadan fazla sürebilir. Daha fazla gevrek doku için, yaklaşık 15 dakika yeterli olabilir. Lütfen spesifik doku ayrıştırıcı tüpler ve kullanılan doku ayrıştırıcısı için Malzeme Tablosuna bakın.
  7. Doku ayrıştırıcı tüplerini çıkarın ve 5 mL'lik bir şırınganın arka ucunu kullanarak 40 μm naylon hücre süzgecinden tritüre edin. Kaçağı toplayın ve sindirilmemiş büyük parçaları atın.
  8. Elüenti oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Süper natantı aspire edin.
  9. Hücre peletlerini% 30 polivinilpirolidon (PVP) kaplı silika içinde yeniden askıya alarak, aksi takdirde nihai lenfosit fraksiyonunu kirletecek yağ hücrelerini uzaklaştırın.
    1. 1x PVP kaplı silika hazırlamak için, 10x PBS'de PVP kaplı silikanın 9:1 seyreltilmesini kullanın.
      NOT: Kullanılan belirli PVP kaplı silika için Malzeme Tablosuna bakın.
    2. %30 PVP kaplı silika hazırlamak için 1x PVP kaplı silikayı PBS/HBSS ile seyreltin.
  10. Hücre peletini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Süper natantı aspire edin.
  11. Hücre peletini 9 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın.
    NOT: R-10 ortamının bileşimi için Malzeme Tablosuna bakınız
  12. Lenfositleri kırmızı kan hücrelerinden ve polimorfonükleer hücrelerden ayırmak için hücre süspansiyonunu 4 mL Ficoll veya lenfosit ayırma ortamı üzerine dikkatlice katlayın.
  13. Hızlanma ve frenler kapalıyken veya en düşük ayarda oda sıcaklığında 23 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yaparak katmanları ayırın. Üst-orta tabakayı dikkatlice boşaltın ve dokuya sızan lenfositleri içeren interfazı toplayın.
  14. Hücreleri 10 mL ortam ile durulayın ve hücre sayımına, akış sitometrisine, hücrelerin alikotasyonuna ve dondurulmasına veya birincil NK genişleme protokolüne geçin.

2. Şekil 2'de gösterildiği gibi PBMC'lerden (veya CB veya organ dokularından) birincil NK hücre genişlemesi (Gün 0).

  1. Dondurulmuş PBMC'yi ve dondurulmuş, ışınlanmış besleyici hücreleri 37 °C su banyosunda çözün.
  2. PBMC ve 100 Gama ışınlanmış (Gy-ışınlanmış) 221-mIL-21 hücresini, 10 mL R-10 ortam ile 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yoluyla ayrı ayrı yıkayın.
  3. Akış sitometrisi için 1 x 106 PBMC hücresi kaydedin.
    NOT: Başlangıçtaki NK hücresi saflığı, NK hücresi genişleme hızının hesaplanmasında önemli bir faktördür.
  4. Hücreleri 1 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın. Trypan Blue kullanarak hücreleri sayın.
  5. 5x 10 6 PBMC hücresini, 100 Gy-ışınlanmış 221-mIL-21 hücreli 10 x 106 hücreli özel bir6 delikli plakada karıştırın (bkz.
  6. İnsan IL-2 (200 U / mL) ve insan IL-15 (5 ng / mL) ile desteklenmiş 30 mL R-10 ortamı ekleyin (bkz.
  7. Özel 6 delikli plakayı 37 °C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
  8. NK hücrelerini her 3-4 günde bir korumak için medyayı insan IL-2 (200 U / mL) ve insan IL-15 (5 ng / mL) ile desteklenmiş R-10 ortamı ile değiştirin.
    NOT: Her ortam değişikliğinde daha fazla genişleme için kuyu başına 20 x 106 hücreden daha az hücre bulundurun. En iyi canlılık için, her bir kuyucuktaki toplam hücre sayısının 100 x 106 hücreyi geçmediğinden emin olun.
  9. Toplam hücre sayısını, canlılığını kaydedin ve NK hücresi genişleme hızını hesaplamak için her 3-4 günde bir akış sitometrisi yapın.

3. Şekil 2'de gösterildiği gibi 293T hücrelerinin bağlanması (Gün 2).

  1. İşlem görmüş 100 mm plaka başına 11 mL D-10 ortama 1,8 x 106 293T hücreyi bölün.
    NOT: D-10 ortamının bileşimi için Malzeme Tablosuna bakınız
  2. 293T hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin.

4. Retrovirüs transfeksiyonu (3. Gün)

  1. 1.7 mL'lik bir tüpte, 470 μL indirgenmiş serum ortamını 30 μL transfeksiyon reaktifi ile karıştırın.
    NOT: Kullanılan spesifik indirgenmiş serum ortamı ve transfeksiyon reaktifi için Malzeme Tablosuna bakınız.
  2. Ayrı bir 1.7 mL tüpte, indirgenmiş serum ortamına 2.5 μg pRDF plazmid, 3.75 μg Pegpam3 plazmid ve 2.5 μg CAR yapısı SFG vektörü ekleyin, böylece son hacim 500 μL olur.
  3. Çözümleri 4.1 ve 4.2 adımlarında damla damla karıştırın.
  4. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
  5. 1. günde 4.4. adımdan 293T hücre plakasına 1 mL karışımı damla damla bir şekilde ekleyin.
  6. Plakaları 37 °C'de 48-72 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.

5. Retronektin plaka kaplama (Gün 3)

  1. Retronektin proteinini Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile 50-100 μg / mL'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin.
  2. Seyreltilmiş retronektinin 500 μL'sini, işlenmemiş 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin (CAR yapısı başına 5 kuyu). Plakayı parafilm kullanarak kapatın ve plakayı gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.

6. Transdüksiyon (4. Gün)

  1. Retronektin plakasını 2103 x g'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüj edin. Süper natantı atın.
  2. 24 delikli plakanın her bir kuyusunu 1 mL R-10 ortamı ile bloke edin.
  3. Plakayı 37 ° C'de 1 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.
  4. Retronektin plakası bloke edilirken santrifüjü önceden 32 ° C'ye ısıtın.
  5. Transfekte edilmiş 293T hücrelerini 0,45 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyerek retrovirüs süpernatantını toplayın.
  6. Aliquot filtrelenmiş retrovirüs süpernatantının 2 mL'si her bir kuyucuğun içine.
  7. 24 delikli plakayı 32 °C'de 2 saat boyunca 2103 x g'de santrifüj yapın.
  8. Plaka santrifüjleme sırasında, genişletilmiş PBNK hücrelerini 0. Gün'den toplayın ve Trypan Blue kullanarak hücreleri sayın.
    NOT: IL-2 (200 U/mL) ve IL-15 (5 ng/mL) ile desteklenmiş R-10 ortamı ekleyerek PBNK hücrelerini genişletmeye devam edin.
  9. Genişlemiş PBNK hücrelerini, IL-2 (200 U/mL) ve IL-15 (5 ng/mL) ile desteklenmiş R-10 ortamı ile seyreltin ve 2,5 x 10 5-5 x 105 hücre/mL (kuyucuk başına0,5 x 10 6-1 x 106 hücre) elde edin.
    NOT: Toplam hücre sayısını, canlılığını kaydedin ve akış sitometrisi için 5 x 105 genişletilmiş PBNK hücresini kaydedin, çünkü bu değerler NK hücresi genişleme hızını belirlemede önemlidir.
  10. Santrifüjlemeden sonra, retrovirüs süpernatantını her bir kuyucuktan kısmen aspire edin.
    NOT: Tamamen aspirasyon yapmayın, yani kuyu başına yaklaşık 100 μL retrovirüs süpernatant bırakın, çünkü bu transdüksiyon verimliliğini azaltacaktır.
  11. Seyreltilmiş genişlemiş PBNK hücrelerinin Aliquot 2 mL'si adım 6.8'den her bir kuyucuğa kadar.
  12. Plakayı 32 ° C'de 10 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yapın. Plakayı 37 ° C'de 48-72 saat boyunca% 5 CO 2 ile inkübe edin.
    NOT: Plakayı parafilme almayın.

7. Şekil 2'de gösterildiği gibi CAR-NK hücrelerinin toplanması (Gün 6 veya 7).

  1. Hücreleri 24 delikli plakadan yavaşça toplayın ve hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın
    NOT: Kabarcıklar oluşturmamaya çalışın, çünkü bu hücre canlılığında bir azalmaya neden olur.
  2. Tüpü 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın.
  3. Peleti 1 mL R-10 ortamı ile yeniden askıya alın ve Trypan Blue kullanarak hücreleri sayın.
    NOT: Transdüksiyon verimliliğini belirlemek üzere akış sitometrisi için 5 x 105 hücre kaydedin.
  4. Yeniden askıya alınan hücreleri, IL-2 (200 U / mL) ve IL-15 (5 ng / mL) ile desteklenmiş 30 mL R-10 ortamı içeren özel bir 6 delikli plakaya aktarın.
  5. Özel 6 delikli plakayı 37 °C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
  6. NK hücrelerini her 3-4 günde bir korumak için IL-2 (200 U / mL) ve IL-15 (5 ng / mL) ile desteklenmiş R-10 ortamını değiştirin.
    NOT: Her değişiklikte daha fazla genişleme için kuyu başına 20 x 106 hücreden daha az hücre bulundurun. En iyi canlılık için, her bir kuyucuktaki toplam hücre sayısının 100 x 106 hücreyi geçmediğinden emin olun.
  7. Toplam hücre sayısını, canlılığını kaydedin ve NK hücresi genişleme hızını hesaplamak için her 3-4 günde bir akış sitometrisi gerçekleştirin.
  8. Hücreleri uygun in vitro veya in vivo testler için kullanın.
    NOT: Ex vivo genişlemiş PBNK ve CAR-NK hücreleri yaklaşık 4 hafta boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde kültürlenebilir.
  9. NK hücre sayısını ve saflığını 7. gün, 11. gün, 14. gün, 18. gün ve 21. günde akış sitometrisi ile inceleyin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

221-mIL-21 besleyici hücre metodolojisini kullanarak dokuya sızan NK hücre izolasyonu ve PBNK hücre genişlemesinin şematik bir iş akışı Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Genişlemiş PBNK hücreleri, hücreleri anti-insan CD56 ve anti-insan CD3 ile boyayarak NK hücre saflığını belirlemek için akış sitometrisi için her 3 veya 4 günde bir toplandı. Deney, genişleme sisteminin tekrarlanabilirliğini göstermek için iki farklı donör kullanılarak tekrarlandı (Şekil 3). 221-mIL-21 ile genişleyen PBNK hücrelerinin yaklaşık 5 × 104 kat genişlediği gösterilmiştir (Şekil 3A). Ayrıca, NK hücresi saflığı, 21 günlük genişleme boyunca yaklaşık% 85 oranında korunmuştur (Şekil 3B). 221-mIL-21 besleyici hücre genişletme sistemini kullanarak, NK hücre saflığı, donörlerden bağımsız olarak% 85 -% 95 arasında tutarlı bir şekilde değişmiştir (veriler gösterilmemiştir). 221-mIL-21 genişleme sisteminin sağlamlığını göstermek için, PBMC'ler genişlemeden önce anti-CD56 ve anti-CD3 için boyandı, bu da NK hücreleri için% 7.09'luk bir hücre saflığı ve yüksek oranda T hücresi gösterdi (Şekil 4A). PBMC'ler, NK hücrelerini genişletmek için 221-mIL-21 ile birlikte kültürlendi; NK saflığı, 4. günde CAR-NK transdüksiyonundan önce kontrol edildi (Şekil 4A). CAR-NK hücreleri toplandı ve anti-CD56, anti-CD3 ve anti-hIgG(H+L) F(ab')2 için boyandı,

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinik çalışmalardaki mevcut CAR-NK ürünlerinin çoğu, Hodgkin dışı lenfoma hastası18'den izole edilmiş bir hücre hattı olan NK-92, NK-92MI, IL-2 bağımsız NK-92 hücre hattı19 ve büyük granüler lenfosit hastası20'den izole edilen NKL gibi NK hücre hatları17'yi kullanmaktadır, çünkü bu hücre hatları 'kullanıma hazır' ürünler için kolayca proliferatif olmaktadır. Bununla birlikte, bu hücre hatları, örneğin NK-92 hücreleri, infüzyondan önce ışınlama gerektirdiğinden, marjinal klinik etkinliklere ve in vivo genişlemeye sahiptir, böylece proliferasyonlarını ve sitotoksisitelerini in vivo21 sınırlarlar. Bu nedenlerden dolayı, periferik kan, CB, kemik iliği (BM), insan embriyonik kök hücreleri (HSC'ler), indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) ve tümör dokuları21,22,23 dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan birincil NK hücrelerini genişletmek için çeşitli stratejiler araştırılmaktadır. Örneğin, NK hücreleri IL-15, IL-18 ve IL-21 dahil olmak üzere interlökinler kullanılarak ex vivo olarak genişletilebilir. K562 hücreleri gibi lenfoblastoid hücre hatları veya 721.221 hücreleri gibi Epstein-Barr Virüsü ile dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre hatları da NK hücre genişlemesiiçin kullanılır 16. Bununla birlikte, yukarıda belirtilen stratejiler genellikle CAR-NK immünoterapisinin evlat edinilmiş bir transferi için yetersiz sayıda NK hücresi üretir22,24. Sorunun çözülmesine yardımcı olmak için, buradaki çalışma, genetiği değiştirilmiş bir EBV dönüştürülmüş hücre hattı, 221-mIL-21 besleyici hücreler kullanarak bir ex vivo NK hücre genişlemesi için bir protokol göstermektedir.

Bu protokolde gösterilen 221-mIL-21 besleyici hücreleri kullanan genişleme metodolojisi, HL-60 ve OCl-AML3 eksprese membran IL-21, K562 ve OX40ligand 22,24,25'i eksprese eden K652-mIL21 dahil olmak üzere diğer lösemi hücre hatlarından en az 10 ila 100 kat daha yüksek bir genişleme oranına sahip NK hücrelerini genişletmek için optimize edilmiştir. CAR ekspresyonu da yaklaşık 2 hafta ex vivo olarak değerlendirilir. Daha da önemlisi, 221-mIL-21 besleyici hücre genişletme stratejisi, NK hücrelerini PBMC'ler, CB ve karaciğer gibi katı organlar dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan ilk NK zenginleştirme adımı olmadan genişletmek için uygulanabilir. 221-mIL-21 besleyici sistemi, yukarıda belirtilen besleyici hücre hatları kadar donöre bağımlı olmasa da, donörlerden tamamen bağımsız değildir. Ortalama olarak, 221-mIL-21 genişleme sistemi, yüksek NK hücre sayısı ile NK hücre saflığının% 90'ını elde edebilir ve genişleme sonrası 14. günde T hücresi kontaminasyonunun yaklaşık% <5'ini elde edebilir. Bu nedenle, T hücresi kontaminasyon olasılığını ortadan kaldırmak için, ex vivo genişlemeden önce elde edilen numunelerden NK hücrelerini izole etmek veya ex vivo genişlemeden sonra T hücrelerini ortadan kaldırmak için bir CD3 + seçim sistemi kullanmak gerekir.

Bir NK hücre genişleme sisteminin kullanılmasındaki eleştirilerden biri, besleyici hücrelerin genişlemeden sonra veya önemli düzenleyici kaygılara sahip olabilecek bir transfüzyondan önce tamamen yok edilmemiş olabileceğidir; Bu nedenle, bir transfüzyondan önce besleyici hücrelerin tamamen yok edilmesi çok önemlidir. Bununla birlikte, ex vivo CBNKhücre genişlemesi 24,25 için K562-mIL21-4-1BBL besleyici hücrelerin kullanıldığı son CAR-NK klinik çalışmaları, ilgili herhangi bir komplikasyon göstermemiştir. Ayrıca, ön verilerimiz, genişleme ilerledikçe ışınlanmış 221-mIL-21 popülasyonunun kademeli olarak azaldığını göstermiştir (veriler gösterilmemiştir). Ancak bu genişleme yönteminin klinik ortamda uygulanabilmesi için daha kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır. Toplu olarak, 221-mIL-21 genişleme sistemi, birincil CAR-NK hücrelerinin genişletilmesi zorluğunun çözülmesine yardımcı olur ve bu nedenle yakın gelecekte CAR-NK hücre bazlı immünoterapinin daha geniş kullanımına önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liu laboratuvarı üyelerine (Dr. Hsiang-chi Tseng, Dr. Xuening Wang ve Dr. Chih-Hsiung Chen) el yazmaları hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. SFG vektörleri için Dr. Gianpietro Dotti'ye ve 721.221 hücreleri için Dr. Eric Long'a teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu) ve Rutgers-Health Advance Funding (NIH REACH programı), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti ve R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) ve D. Liu Laboratuvarı için Rutgers Üniversitesi-New Jersey Tıp Fakültesi Başlangıç fonundan desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 mm yüzey işlem görmüş steril doku kültürü kaplarıVWR10062-880Transfeksiyon
293T hücreleriATCCCRL-3216Transfeksiyon için
6 kuyulu G-REX plakasıWilson Wolf80240MNK hücre genişlemesi için
AF647-konjuge AffiniPure F (ab ') 2 parça keçi anti-insan IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch109-606-088Akış için SFG
vektöründeDr. Dongfang Liu'nun laboratuvarındaTransfeksiyon için
Kollajenaz IVSigmaC4-22-1GTIL izolasyonu için
Kriyoprezervasyon ortamı
Bileşen: Fetal Sığır Serumu (FBS)		Corning35-010-CV%90
Kriyoprezervasyon ortamı
Bileşen: Dimetil sülfoksit (DMSO)		SigmaD2050% 10
D-10 medya
Bileşen: DMEM		VWR45000-304
D-10 medya
Bileşen: Fetal Sığır Serumu (FBS)		Corning35-010-CV
10 D-10 media
Bileşen: Penisilin Streptomisin		VWR45000-6521%
FastFlow & Düşük Bağlayıcı Millipore Express PES MembranMillexSLHPR33RBTransdüksiyon için
Genejuice transfeksiyon reaktifiVWR80611-356Transfeksiyon
için gentleMACS C-tüpleriMiltenyi Biotec130-093-237TIL'ler için izolasyon
gentleMACS OctoMiltenyi BiotecTILizolasyonu için
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS - olmadan kalsiyum veya magnezyum)ThermoFisher14170120TIL izolasyonu için
İnsan IL-15Peprotech200-15NK hücre genişlemesi için
İnsan IL-2Peprotech200-02NK hücre genişlemesi için
Işınlanmış 221-mIL21 besleyici hücrelerDr. Dongfang Liu'nun laboratuvarındaüretildi Kriyorezervasyon ortamında donduruldu
Lenfosit Ayırma OrtamıCorning25-072-CVTIL izolasyonu için
OPTI-MEMThermoFisher31895Transfeksiyon için
PE anti-insan CD3 klonu HIT3aBiolegend300308Akış sitometrisi için
PE / Cy7 anti-insan CD56 (NCAM) klonu 5.1H11BioLegend362509Akış sitometrisi için
Dr. Dongfang Liu'nun laboratuvarındaPegpam3 plazmidiİçin transfeksiyon
PercollGE Healthcare17089101TIL'lerin izolasyonu için
Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler)New York Kan MerkeziSağlıklı donörlerin plazmasından izole edilmiş, kriyoprezervasyon ortamında dondurulmuştur
Fosfat Tampon Salin (PBS)Corning21-040-CVTransdüksiyon için
pRDF plazmidiDr. Dongfang Liu'nun laboratuvarındaTransfeksiyon için
R-10 media
İçindekiler: RPMI 1640		VWR45000-404
R-10 media
Bileşen: L-glutamin		VWR45000-304%1
R-10 media
Bileşen: Penisilin Streptomisin		VWR45000-652%1
R-10 media
Bileşen: Fetal Sığır Serumu (FBS)		Corning35-010-CV%10
RetronektinDr. Dongfang Liu'nun laboratuvarında üretildi:ev yapımı,Transdüksiyon için,
Trypan BlueCorning25-900-ClHücre sayımı için
İşlenmemiş 24 oyuklu plaka, Fisher Scientific13-690-071Transdüksiyon için
için sitometri CAR yapısı üretildi % alıntı üretilen üretilmiştir, , ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Acker, H. H., et al. CD56 in the immune system: More than a marker for cytotoxicity. Frontiers in Immunology. 8, 892(2017).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Shimizu, Y., et al. Transfer and expression of three cloned human non-HLA-A,B,C class I major histocompatibility complex genes in mutant lymphoblastoid cells. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 85 (1), 227-231 (1988).
  4. Wu, J., Lanier, L. L. Natural killer cells and cancer. Advances in Cancer Research. 90, 127-156 (2003).
  5. Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. The New England Journal of Medicine. 382 (6), 545-553 (2020).
  6. Alonso-Camino, V., et al. Efficacy and toxicity management of CAR-T-cell immunotherapy: a matter of responsiveness control or tumour-specificity. Biochemical Society Transactions. 44 (2), 406-411 (2016).
  7. Bonifant, C. L., Jackson, H. J., Brentjens, R. J., Curran, K. J. Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16011(2016).
  8. Kalaitsidou, M., Kueberuwa, G., Schitt, A., Gilham, D. E. CAR T-cell therapy: toxicity and the relevance of preclinical models. Immunotherapy. 7 (5), 487-497 (2015).
  9. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  10. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  11. Zhang, Y., et al. In vivo kinetics of human natural killer cells: the effects of ageing and acute and chronic viral infection. Immunology. 121 (2), 258-265 (2007).
  12. Vidard, L., et al. CD137 (4-1BB) Engagement fine-tunes synergistic IL-15- and IL-21-driven nk cell proliferation. Journal of Immunology. 203 (3), Baltimore, Md. 676-685 (2019).
  13. Venkatasubramanian, S., et al. IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Mucosal Immunology. 10 (4), 1031-1042 (2017).
  14. Ojo, E. O., et al. Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells. Scientific Reports. 9 (1), 14916(2019).
  15. Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), 30264(2012).
  16. Yang, Y., et al. Superior expansion and cytotoxicity of human primary NK and CAR-NK cells from various sources via enriched metabolic pathways. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 428-445 (2020).
  17. Liu, S., et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 7(2021).
  18. Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell-line (Nk-92) with phenotypical and functional-characteristics of activated natural-killer-cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
  19. Tam, Y. K., et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy. Human Gene Therapy. 10 (8), 1359-1373 (1999).
  20. Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
  21. Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (2), 167-176 (2018).
  22. Tseng, H. C., et al. Efficacy of anti-CD147 chimeric antigen receptors targeting hepatocellular carcinoma. Nature Communications. 11 (1), 4810(2020).
  23. Easom, N. J. W., et al. IL-15 overcomes hepatocellular carcinoma-induced NK cell dysfunction. Frontiers in Immunology. 9, 1009(2018).
  24. Granzin, M., et al. Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic activity in a xenograft mouse model of melanoma. Oncoimmunology. 5 (9), 1219007(2016).
  25. Liu, E. L., et al. Cord blood derived natural killer cells engineered with a chimeric antigen receptor targeting CD19 and expressing IL-15 have long term persistence and exert potent anti-leukemia activity. Blood. 126 (23), (2015).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Do al Katil H crelerNK mm noterapisiAk SitometrisiPeriferik Kan NKKordon Kan NKLenfosit zolasyonuRetrovir s Transd ksiyonu

İlgili makaleler