Doğal Öldürücü (NK) ve Membran Bound-IL-21-Modifiye B Hücre Hattı Kullanarak CAR-NK Hücre Genleşme Yöntemi

Doğal öldürücü (NK) hücreler, CD56'yı eksprese eden ve T hücre belirteci CD3 ^1,2'nin ekspresyonundan yoksun lenfositlerin önemli bir alt kümesidir. Konvansiyonel NK hücreleri, viral olarak enfekte olmuş hücrelerin ve kanserli hücrelerin immünsüveyöründen sorumlu doğuştan gelen immün hücreler olarak sınıflandırılır. T hücrelerinin aksine, NK hücreleri CD16 veya diğer aktive edici reseptörleri kullanarak enfekte veya malign hücreleri tanır ve antijen peptitleri ile majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I molekülleri ^3,4 arasında bir kompleks oluşumunu gerektirmez. Relaps veya refrakter CD19 pozitif kanserleri (Hodgkin dışı lenfoma veya kronik lenfositik lösemi [CLL]) tedavi etmek için kimerik antijen reseptörü (CAR)-NK hücrelerini kullanan son klinik araştırmalar, CAR-NK hücrelerinin olağanüstü güvenlik avantajlarını göstermiştir⁵. Örneğin, CAR-NK hücre infüzyonu minimal veya ihmal edilebilir greft versus host hastalığı (GVHD), nörotoksisite, kardiyotoksisite ve sitokin salınım sendromu (CRS) 6,7,8,9,10 ile ilişkilidir. Bununla birlikte, insan NK hücrelerini genişletmeye yönelik geleneksel yöntemler, güçlü kardeş öldürücü öldürme ve telomer kıtlığı ile kapsamlı fenotipler göstermiştir, bu da evlat edinilmiş immünoterapi için yeterli sayıda fonksiyonel NK hücresi elde etmede büyük bir zorluk teşkil etmektedir¹¹.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, birincil NK hücrelerini doğrudan fraksiyone edilmemiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) veya kordon kanından (CB) ışınlanmış ve genetiği değiştirilmiş bir 721.221 (bundan böyle 221) hücre hattı, MHC sınıf I moleküllerinin düşük ekspresyonuna sahip bir insan B-lenfoblastoid hücre hattı kullanarak genişletmek için bir yöntem geliştirilmiştir³. Önceki çalışmalar IL-21'in NK hücre genişlemesindeki önemini göstermiştir; Bu nedenle, 721.221 hücre hattının bir versiyonunu ifade eden genetiği değiştirilmiş membrana bağlı bir IL-21 (şu andan itibaren, 221-mIL-21) 11,12,13,14,15 geliştirilmiştir. Sonuçlar, 221-mIL-21 besleyici hücre genişletilmiş birincil NK hücrelerinin, yaklaşık 2-3 hafta boyunca kalıcı yüksek NK hücre saflığı ile ortalama >40.000 kata kadar genişlediğini göstermiştir. Bu protokolün uygulanmasıyla ilgili ek bilgiler Yang ve ^ark.16'da bulunabilir.

Bu protokol, PBNK, CBNK, doku kaynaklı NK ve CAR-NK hücrelerinin ex vivo olarak yeni genişlemesinin adım adım prosedürünü göstermeyi amaçlamaktadır.

Bu protokoldeki insan dokuları ve kanla ilgili çalışmalar, Rutgers Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (IRB) yönergelerini takip etmektedir.

1. Şekil 1'de gösterildiği gibi karaciğer dokularından NK hücresi genişlemesi (Gün 0).

NOT: İlk hücre sayısı ve canlılık, organ çıkarılmasından bu yana geçen süre ve ilk doku numune miktarı ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bununla birlikte, dokular 30 mL'lik Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS) yerleştirilirse ve gece boyunca 4 ° C'de buzda veya buzdolabında tutulursa, NK hücreleri hala 24 saate kadar yüksek saflıkta ve canlılıkta genişletilebilir.

1. Steril cerrahi ekipman kullanarak dokulardan ve kesitlerden lenfositler elde etmek için uygun doku alanlarını tanımlayın.
2. Dokuları 30 mL HBSS'ye (kalsiyum veya magnezyum olmadan) yerleştirin ve izolasyona hazırlanmaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
3. Bir biyogüvenlik kabini içinde steril tıraş bıçağı veya makas ve forseps kullanarak dokuyu <0,5 cm'lik küpler halinde kesin.
4. HBSS'de 10x stoğu seyrelterek 1x kollajenaz IV çözeltisi (1 mg / mL) hazırlayın (10x Kollajenaz IV: 10 mg / mL veya ~ 200 U / mL).
5. Kıyılmış doku parçalarını doku ayrışma tüplerine yerleştirin. Tüpleri en fazla 4 g doku ile doldurun ve doku parçalarını ~ 10 mL 1x kollajenaz IV içine batırın.
   NOT: DNase I kullanılması, NK canlılığını ve verimini biraz azaltabileceğinden önerilmez. Kullanılan spesifik doku ayrıştırıcı tüpler için lütfen Malzeme Tablosuna bakın.
6. Doku ayrıştırıcı tüplerini bir doku ayrıştırıcısına yerleştirin ve dokuyu iyice kıymak için 37 ° C'de karıştırın.
   NOT: Karaciğer dokusu için bu işlem 30 dakikadan fazla sürebilir. Daha fazla gevrek doku için, yaklaşık 15 dakika yeterli olabilir. Lütfen spesifik doku ayrıştırıcı tüpler ve kullanılan doku ayrıştırıcısı için Malzeme Tablosuna bakın.
7. Doku ayrıştırıcı tüplerini çıkarın ve 5 mL'lik bir şırınganın arka ucunu kullanarak 40 μm naylon hücre süzgecinden tritüre edin. Kaçağı toplayın ve sindirilmemiş büyük parçaları atın.
8. Elüenti oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Süper natantı aspire edin.
9. Hücre peletlerini% 30 polivinilpirolidon (PVP) kaplı silika içinde yeniden askıya alarak, aksi takdirde nihai lenfosit fraksiyonunu kirletecek yağ hücrelerini uzaklaştırın.
   1. 1x PVP kaplı silika hazırlamak için, 10x PBS'de PVP kaplı silikanın 9:1 seyreltilmesini kullanın.
      NOT: Kullanılan belirli PVP kaplı silika için Malzeme Tablosuna bakın.
   2. %30 PVP kaplı silika hazırlamak için 1x PVP kaplı silikayı PBS/HBSS ile seyreltin.
10. Hücre peletini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Süper natantı aspire edin.
11. Hücre peletini 9 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın.
    NOT: R-10 ortamının bileşimi için Malzeme Tablosuna bakınız
12. Lenfositleri kırmızı kan hücrelerinden ve polimorfonükleer hücrelerden ayırmak için hücre süspansiyonunu 4 mL Ficoll veya lenfosit ayırma ortamı üzerine dikkatlice katlayın.
13. Hızlanma ve frenler kapalıyken veya en düşük ayarda oda sıcaklığında 23 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yaparak katmanları ayırın. Üst-orta tabakayı dikkatlice boşaltın ve dokuya sızan lenfositleri içeren interfazı toplayın.
14. Hücreleri 10 mL ortam ile durulayın ve hücre sayımına, akış sitometrisine, hücrelerin alikotasyonuna ve dondurulmasına veya birincil NK genişleme protokolüne geçin.

2. Şekil 2'de gösterildiği gibi PBMC'lerden (veya CB veya organ dokularından) birincil NK hücre genişlemesi (Gün 0).

1. Dondurulmuş PBMC'yi ve dondurulmuş, ışınlanmış besleyici hücreleri 37 °C su banyosunda çözün.
2. PBMC ve 100 Gama ışınlanmış (Gy-ışınlanmış) 221-mIL-21 hücresini, 10 mL R-10 ortam ile 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yoluyla ayrı ayrı yıkayın.
3. Akış sitometrisi için 1 x 10⁶ PBMC hücresi kaydedin.
   NOT: Başlangıçtaki NK hücresi saflığı, NK hücresi genişleme hızının hesaplanmasında önemli bir faktördür.
4. Hücreleri 1 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın. Trypan Blue kullanarak hücreleri sayın.
5. 5x 10 6 PBMC hücresini, 100 Gy-ışınlanmış 221-mIL-21 hücreli 10 x 10⁶ hücreli özel bir⁶ delikli plakada karıştırın (bkz.
6. İnsan IL-2 (200 U / mL) ve insan IL-15 (5 ng / mL) ile desteklenmiş 30 mL R-10 ortamı ekleyin (bkz.
7. Özel 6 delikli plakayı 37 °C'de% 5 CO_{2 ile inkübe edin}.
8. NK hücrelerini her 3-4 günde bir korumak için medyayı insan IL-2 (200 U / mL) ve insan IL-15 (5 ng / mL) ile desteklenmiş R-10 ortamı ile değiştirin.
   NOT: Her ortam değişikliğinde daha fazla genişleme için kuyu başına 20 x 10⁶ hücreden daha az hücre bulundurun. En iyi canlılık için, her bir kuyucuktaki toplam hücre sayısının 100 x 10⁶ hücreyi geçmediğinden emin olun.
9. Toplam hücre sayısını, canlılığını kaydedin ve NK hücresi genişleme hızını hesaplamak için her 3-4 günde bir akış sitometrisi yapın.

3. Şekil 2'de gösterildiği gibi 293T hücrelerinin bağlanması (Gün 2).

1. İşlem görmüş 100 mm plaka başına 11 mL D-10 ortama 1,8 x 10⁶ 293T hücreyi bölün.
   NOT: D-10 ortamının bileşimi için Malzeme Tablosuna bakınız
2. 293T hücreleri 37 °C'de %5 CO_{2 ile inkübe edin}.

4. Retrovirüs transfeksiyonu (3. Gün)

1. 1.7 mL'lik bir tüpte, 470 μL indirgenmiş serum ortamını 30 μL transfeksiyon reaktifi ile karıştırın.
   NOT: Kullanılan spesifik indirgenmiş serum ortamı ve transfeksiyon reaktifi için Malzeme Tablosuna bakınız.
2. Ayrı bir 1.7 mL tüpte, indirgenmiş serum ortamına 2.5 μg pRDF plazmid, 3.75 μg Pegpam3 plazmid ve 2.5 μg CAR yapısı SFG vektörü ekleyin, böylece son hacim 500 μL olur.
3. Çözümleri 4.1 ve 4.2 adımlarında damla damla karıştırın.
4. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
5. 1. günde 4.4. adımdan 293T hücre plakasına 1 mL karışımı damla damla bir şekilde ekleyin.
6. Plakaları 37 °C'de 48-72 saat boyunca% 5 CO₂ ile inkübe edin.

5. Retronektin plaka kaplama (Gün 3)

1. Retronektin proteinini Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile 50-100 μg / mL'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin.
2. Seyreltilmiş retronektinin 500 μL'sini, işlenmemiş 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin (CAR yapısı başına 5 kuyu). Plakayı parafilm kullanarak kapatın ve plakayı gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.

6. Transdüksiyon (4. Gün)

1. Retronektin plakasını 2103 x g'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüj edin. Süper natantı atın.
2. 24 delikli plakanın her bir kuyusunu 1 mL R-10 ortamı ile bloke edin.
3. Plakayı 37 ° C'de 1 saat boyunca% 5 CO₂ ile inkübe edin.
4. Retronektin plakası bloke edilirken santrifüjü önceden 32 ° C'ye ısıtın.
5. Transfekte edilmiş 293T hücrelerini 0,45 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyerek retrovirüs süpernatantını toplayın.
6. Aliquot filtrelenmiş retrovirüs süpernatantının 2 mL'si her bir kuyucuğun içine.
7. 24 delikli plakayı 32 °C'de 2 saat boyunca 2103 x g'de santrifüj yapın.
8. Plaka santrifüjleme sırasında, genişletilmiş PBNK hücrelerini 0. Gün'den toplayın ve Trypan Blue kullanarak hücreleri sayın.
   NOT: IL-2 (200 U/mL) ve IL-15 (5 ng/mL) ile desteklenmiş R-10 ortamı ekleyerek PBNK hücrelerini genişletmeye devam edin.
9. Genişlemiş PBNK hücrelerini, IL-2 (200 U/mL) ve IL-15 (5 ng/mL) ile desteklenmiş R-10 ortamı ile seyreltin ve 2,5 x 10 5-5 x 10⁵ hücre/mL (kuyucuk başına^0,5 x 10 6-1 x 10⁶ hücre) elde edin.
   NOT: Toplam hücre sayısını, canlılığını kaydedin ve akış sitometrisi için 5 x 10⁵ genişletilmiş PBNK hücresini kaydedin, çünkü bu değerler NK hücresi genişleme hızını belirlemede önemlidir.
10. Santrifüjlemeden sonra, retrovirüs süpernatantını her bir kuyucuktan kısmen aspire edin.
    NOT: Tamamen aspirasyon yapmayın, yani kuyu başına yaklaşık 100 μL retrovirüs süpernatant bırakın, çünkü bu transdüksiyon verimliliğini azaltacaktır.
11. Seyreltilmiş genişlemiş PBNK hücrelerinin Aliquot 2 mL'si adım 6.8'den her bir kuyucuğa kadar.
12. Plakayı 32 ° C'de 10 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yapın. Plakayı 37 ° C'de 48-72 saat boyunca% 5 CO 2 ile inkübe edin.
    NOT: Plakayı parafilme almayın.

7. Şekil 2'de gösterildiği gibi CAR-NK hücrelerinin toplanması (Gün 6 veya 7).

1. Hücreleri 24 delikli plakadan yavaşça toplayın ve hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın
   NOT: Kabarcıklar oluşturmamaya çalışın, çünkü bu hücre canlılığında bir azalmaya neden olur.
2. Tüpü 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın.
3. Peleti 1 mL R-10 ortamı ile yeniden askıya alın ve Trypan Blue kullanarak hücreleri sayın.
   NOT: Transdüksiyon verimliliğini belirlemek üzere akış sitometrisi için 5 x 10⁵ hücre kaydedin.
4. Yeniden askıya alınan hücreleri, IL-2 (200 U / mL) ve IL-15 (5 ng / mL) ile desteklenmiş 30 mL R-10 ortamı içeren özel bir 6 delikli plakaya aktarın.
5. Özel 6 delikli plakayı 37 °C'de% 5 CO_{2 ile inkübe edin}.
6. NK hücrelerini her 3-4 günde bir korumak için IL-2 (200 U / mL) ve IL-15 (5 ng / mL) ile desteklenmiş R-10 ortamını değiştirin.
   NOT: Her değişiklikte daha fazla genişleme için kuyu başına 20 x 10⁶ hücreden daha az hücre bulundurun. En iyi canlılık için, her bir kuyucuktaki toplam hücre sayısının 100 x 10⁶ hücreyi geçmediğinden emin olun.
7. Toplam hücre sayısını, canlılığını kaydedin ve NK hücresi genişleme hızını hesaplamak için her 3-4 günde bir akış sitometrisi gerçekleştirin.
8. Hücreleri uygun in vitro veya in vivo testler için kullanın.
   NOT: Ex vivo genişlemiş PBNK ve CAR-NK hücreleri yaklaşık 4 hafta boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde kültürlenebilir.
9. NK hücre sayısını ve saflığını 7. gün, 11. gün, 14. gün, 18. gün ve 21. günde akış sitometrisi ile inceleyin.

221-mIL-21 besleyici hücre metodolojisini kullanarak dokuya sızan NK hücre izolasyonu ve PBNK hücre genişlemesinin şematik bir iş akışı Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Genişlemiş PBNK hücreleri, hücreleri anti-insan CD56 ve anti-insan CD3 ile boyayarak NK hücre saflığını belirlemek için akış sitometrisi için her 3 veya 4 günde bir toplandı. Deney, genişleme sisteminin tekrarlanabilirliğini göstermek için iki farklı donör kullanılarak tekrarlandı (Şekil 3). 221-mIL-21 ile genişleyen PBNK hücrelerinin yaklaşık 5 × 104 kat genişlediği gösterilmiştir (Şekil 3A). Ayrıca, NK hücresi saflığı, 21 günlük genişleme boyunca yaklaşık% 85 oranında korunmuştur (Şekil 3B). 221-mIL-21 besleyici hücre genişletme sistemini kullanarak, NK hücre saflığı, donörlerden bağımsız olarak% 85 -% 95 arasında tutarlı bir şekilde değişmiştir (veriler gösterilmemiştir). 221-mIL-21 genişleme sisteminin sağlamlığını göstermek için, PBMC'ler genişlemeden önce anti-CD56 ve anti-CD3 için boyandı, bu da NK hücreleri için% 7.09'luk bir hücre saflığı ve yüksek oranda T hücresi gösterdi (Şekil 4A). PBMC'ler, NK hücrelerini genişletmek için 221-mIL-21 ile birlikte kültürlendi; NK saflığı, 4. günde CAR-NK transdüksiyonundan önce kontrol edildi (Şekil 4A). CAR-NK hücreleri toplandı ve anti-CD56, anti-CD3 ve anti-hIgG(H+L) F(ab')2 için boyandı,

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.