Yöntem makalesi

Primer Tümörü Özetlemek İçin Oküler Melanomun Orto- ve Ektopik Zebra Balığı Kseno-Aşılanması ve Deneysel Metastaz Gelişimi

2.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62356

⸱

4 Eylül 2021

 ,  , 
1Institute of Biology, Leiden University

Bu makalede

Özet

Burada, primer tümörün büyüme kinetiğini, yayılımını, ekstravazasyonunu ve uzak, peri-vasküler metastaz oluşumunu ve bunlar üzerindeki kimyasal inhibisyonun etkisini değerlendirmek için oküler melanom için çok yönlü ortotopik ve ektopik zebra balığı ksenogreft modelleri oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Şu anda metastatik oküler melanom için hayvan modeli bulunmamaktadır. Metastatik hastalık modellerinin eksikliği, metastatik oküler melanomun tedavisi için yeni stratejilerin araştırılmasını ve geliştirilmesini büyük ölçüde engellemiştir. Bu protokolde, sırasıyla retro-orbital ortotopik ve intravasküler ektopik hücre aşılaması kullanarak, oküler melanomun hem birincil hem de yaygın aşaması için embriyonik zebra balığı modelleri oluşturmanın hızlı ve verimli bir yolunu betimliyoruz. Bu iki farklı aşılama stratejisini birleştirerek, göz altındaki primer, lokalize tümör büyümesinden kuyrukta perivasküler metastaz oluşumuna kadar ilerleyen kanserin etiyolojisini bir bütün olarak özetleyebiliriz. Bu modeller, spesifik etiketleme, genetik veya kimyasal girişim ile implantasyondan önce kanser hücrelerini hızlı ve kolay bir şekilde değiştirmemize olanak tanır; ve tümör gelişimini azaltmak için aşılanmış konakçıları (küçük moleküler) inhibitörlerle tedavi etmek.

Burada, floresan olarak işaretlenmiş stabil hücre hatları kullanarak oküler melanomların (konjonktival ve uveal melanom) hem ortotopik hem de ektopik aşılanmasının oluşumunu ve niceliğini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda hasta biyopsisinden ve hasta/PDX'ten türetilen materyalden (hazırlık aşamasında olan el yazması) türetilen primer hücrelerin aşılanması için de geçerlidir. Aşılamadan birkaç saat sonra hücre göçü ve proliferasyonu görselleştirilebilir ve ölçülebilir. Her iki tümör odağı da hem epifloresan mikroskobu hem de konfokal mikroskopi ile görüntüleme için hazırdır. Bu modelleri kullanarak, deneyin başlamasından sonraki 8 gün gibi kısa bir süre içinde kimyasal veya genetik inhibisyon stratejilerinin aktivitesini doğrulayabilir veya çürütebiliriz, bu da sadece stabil hücre hatlarında yüksek verimli taramaya izin vermekle kalmaz, aynı zamanda hastaya yönelik taramayı da mümkün kılar.

Giriş

Metastatik yayılım, oküler melanomun ana ölüm nedeni olarak kabul edilir; Şu anda yaygın oküler melanom 1,2 için geçerli bir tedavi rejimi yoktur. Ayrıca, oküler melanom için metastatik hastalığı yansıtan hiçbir hayvan modeli mevcut değildir. Bu boşluğu kapatmak için, birincil tümör oluşumunu veya metastatik yayılmanın erken aşamalarını özetleyen iki farklı zebra balığı modeli oluşturduk, böylece normalde zor olan bu süreçlerin incelenmesine kolayca izin verdik 3. Mikro-metastaz modelleri, hedef arama, kolonizasyon ve ekstravazasyon dahil olmak üzere metastatik yayılmanın son aşamalarının analizine izin verir. Bu aşamada ve sonrasında genetik veya kimyasal müdahaleler, metastatik oküler melanomun tedavisinde potansiyel olarak güçlü bir dayanak sağlayabilir.

Zebra balığı larvalarının kseno ve allogreftlerin alıcısı olarak kullanılması, bu türün gelişimin erken aşamalarında optik şeffaflığı (veya casper mutantları için tüm yaşam döngüsü4), yüksek doğurganlık ve ex utero fertilizasyon5 gibi içsel güçlü yönleri ile desteklenir. Omurgalılarda yüksek transkripsiyonel homoloji, zebra balığı ve insanlar arasındaki çekirdek sinyal mekanizmalarının korunmasını ve dolayısıyla sonuçların 6 yüksek potansiyel çevrilebilirliğini sağlar, ancak genetik yaklaşımlar bazen teleost genom duplikasyonu 7 nedeniyle bozulur veya karmaşıktır. Son gelişmeler, zebra balığı ksenogreft modellerinin insan hastalığının klinik öncesi "avatarları" olarak önemini vurgulamıştır8 ve tek bir zebra balığı deneyinden 9 tedavi stratejilerinin klinik öncesi değerlendirmesi için çok sayıda kişiselleştirilmiş kanser tedavisi modelini etkili bir şekilde ortaya çıkarmıştır.

Hayvan modellerinin eksikliği ve metastatik oküler melanom için tedavi seçeneklerinin buna bağlı eksikliği göz önüne alındığında, modellerimiz hem genetik değişiklikleri (kanser hücresi içsel) taramak hem de klinik öncesi bir ortamda kimyasal müdahale stratejileri geliştirmek için hızlı ve kolay bir translasyonel platform sağlar. Aynı model içinde, bir stereo floresan mikroskopta düşük seviyeli büyütme kullanarak tüm hayvan düzeyinde kanser hücresi büyüme kinetiğini, aşılama oranını/metastatik potansiyeli ve hücre hedeflemesini görselleştirebilir ve ölçebilir ve orta veya yüksek büyütmeli konfokal mikroskobik analiz kullanarak benzer ölçümler yapabiliriz.

Burada, aşağıdakiler için kapsamlı ve ayrıntılı protokolleri açıklıyoruz: yüksek düzeyde optimize edilmiş lentiviral transdüksiyon11 kullanılarak floresan olarak işaretlenmiş kanser hücrelerinin oluşturulması; sırasıyla ektopik ve ortotopik modeller oluşturmak için bu hücrelerin döllenmeden 2 gün sonra (DPF) zebra balığı larvalarına intravenöz ve retro-orbital (RO) aşılamaları; ardından veri toplama ve analizi yapılır. Bu yöntemler, burada açıklanan uygulamalar için kapsamlı olmasına rağmen, gerektiğinde (yalnızca enjeksiyon bölgesini veya enjeksiyon zamanını değiştirerek) arka beyin boşluğu, karaciğer ve perivitellin boşluğundaki hücreleri aşılamak için modifiye edilebilir12,13.

Bir kavram kanıtı olarak, Pontes ve ark. 2018, zebra balığı model 14'te konjonktival melanom hücre hatlarının bir doz ve hücre içsel mutasyona özgü tepkisini gösterdik. Bu bulguları, BRAF V600E mutasyonuna özgü inhibitör vemurafenibin hem metastatik hem de primer konjonktival melanom modellerinde etkinliğini göstererek detaylandırdık.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Hayvan Deneyleri Komitesi (Dier Experimenten Commissie, D.E.C.) tarafından AVD1060020172410 lisansı altında onaylanmıştır. Tüm hayvanlar, standart protokoller (www.ZFIN.org) kullanılarak yerel yönergelere uygun olarak muhafaza edildi.

1. Hazırlık

  1. Reaktif
    1. Yumurta suyu hazırlayın: 0.6 mg / L nihai konsantrasyon deniz tuzu.
    2. 5 mg / mL Trikain 25x stoğu hazırlayın: 5 g Trikain (etil 3-aminobenzoat metansülfonat veya MS-222) tozu, 900 mL demineralize su ve 21 mL 1 M Tris (pH 9) karıştırın. Trikain kısa süreli (altı aya kadar) 4 ° C'de saklanabilir veya güneş ışığından korunduğunda oda sıcaklığında bir ay boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
    3. Yumurta suyunda% 1.5 (a / h) agaroz hazırlayın: 100 mL DPBS'de 1.5 g. Çözmek için mikrodalga.
    4. Yumurta suyunda% 1 (a / h) az erime noktalı agaroz hazırlayın: 100 mL DPBS'de 1.5 g. Çözmek için mikrodalga.
    5. DPBS'de %2 (a/a) PVP40 stoğu hazırlayın: 50 mL DPBS'de 1 g PVP40. Çözünmeyi kolaylaştırmak için girdap ve 37 ° C'de inkübe edin. Oda sıcaklığında saklayın.
    6. DMSO'yu kullanın. İlaç tedavilerinde çözücü olarak sıklıkla kullanılır ve karanlıkta 2-8 ° C'de saklanmalıdır.
    7. Hücrelere daha az zarar veren ve güçlü bir şekilde yapışan hücrelerin nazikçe dağılmasına izin veren sentetik bir tripsin ikamesi olan TrypLE'yi kullanın.
    8. Hücreleri yıkamak için Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyunu (DPBS) Mg2 + ve Ca2 + olmadan hazırlayın. Ca2 + eksikliği, kaderinler yoluyla hücre-hücre yapışmasını bozar.
    9. Lentiviral plazmitleri hazırlayın: Didier Trono tarafından hediye edilen psPAX2 (plazmid #12260) ve pMD2.G (plazmid #12259) ve transfer plazmidini (Addgene) kodlayan bir GFP (Plazmid #106172) veya tdTomato (Plazmid #106173).
    10. LipodD293 kullanın: Yüksek verimli HEK293T optimize edilmiş transfeksiyon reaktifi.
  2. Agaroz yemeği
    NOT: Uzun süre saklanmış bulaşıkları kullanırken, enjeksiyona başlamadan önce bulaşıklara az miktarda yumurta suyu eklediğinizden emin olun (bu, balığın çok hızlı kurumasını önleyecektir).
    1. % 1.5 (a / h) agaroz kaplı tabaklar hazırlayın (yumurta suyunda çözülmüş agaroz).
    2. Hemen kullanın veya 4 °C'de ters konumda saklayın.

2. İğneler

NOT: Kullanılan filament üzerinde kılcal damarların kalibre edildiğinden emin olun. Filamanı veya kılcal damarı değiştirirken, kullanılan filaman üzerindeki kılcal damarların ramp değerini belirleyin (iğne çektirme kılavuzuna bakın).

  1. Bir cam kılcal damar iki mikro enjeksiyon iğnesi verecektir. İğne yapmadan önce, iğne çekicinin filamentinin (2,5 mm kutu filament) yapısal bütünlüğünü kontrol edin.
  2. Karşılık gelen rampa değerini elde etmek için hem filamentin hem de kılcal damarın kalibre edildiğinden emin olun. Filamentlerin yapısal bütünlüğü tehlikeye girdiğinde (yani düzensiz, delikler, erimiş vb.), filamenti değiştirin.
  3. Aşağıdaki programı kullanın (İğne #99, Isı=rampa+15, çekme=95, hız=60, zaman=90). İğneleri belirlenmiş bir Petri kabında saklayın (iğneleri yapıştırmak için kil veya bant içeren)

3. Lentiviral partiküllerin oluşumu

NOT: Zaman ve kaynak israfını önlemek için, lentiviral transdüksiyondan önce hızlı bir tümörjenite kontrolü yapılabilir. Bu, zebra balığı modelinde kullanılacak hücre hattının yeterince tümörjenik olmasını sağlamak için yapılır, bu amaçla hücreler Liverani ve ark. 2017 15'te açıklandığı gibi bir CMdiI (veya benzer izleyici) ile boyanabilir.

  1. Yaklaşık% 70'lik bir birleşme elde etmek için transfeksiyondan bir gün önce HEK 293t hücrelerini plakalayın (rutin olarak, bir gün önce 1: 3'lük bir seyreltmede tam bir şişenin aynı hacimdeki kültür şişesine bölünmesiyle yapılır).
  2. Transfeksiyon gününde, transfer plazmidini kodlayan bir GFP (Plazmid #106172) veya tdTomato (Plazmid #106173) ile birlikte plazmidi eksprese eden gerekli ambalaj plazmitleri psPAX2 ve pMD2.G viral zarfını birlikte transfekte edin. Kullanılan tam plazmit miktarı Tablo 1'de belirtilmiştir.
    NOT: Hem psPAX2 hem de pMD2.G, Didier Trono tarafından hediye edilmiştir (sırasıyla Addgene plazmidi #12260 ve #12259).

figure-protocol-1
Şekil 1. Açıklanan zebra balığı aşılama sisteminin şematik gösterimi. A) Zebra balığının 0. günde (B1) yetiştirilmesiyle yaklaşımın zaman çizelgesi. Balıklar, balığı geçtikten sonraki sabah hasat edilir (1. gün). 48-54 saat sonra balıklar büyük ölçüde yumurtadan çıkar (koryonlarını döker) ve koryon kalıntılarının suyu temizlendikten sonra balıklara enjekte edilir (retro-orbital veya sistemik olarak, B2) (2. gün). Larvalar daha sonra bir stereo floresan mikroskobu kullanılarak taranır ve istenmeyen fenotipler gösteren tüm larvalar atılır (3. gün). Deneyin amacına bağlı olarak ya larvalar zaman içinde görüntülenir (B3, aşılama kinetiği, enjeksiyondan 1, 4 ve 6 gün sonra görüntülenir (dpi)) ya da balıklar randomize edilir ve deney gruplarına alınır, ilaçlarla tedavi edilir ve araç kontrolü ile karşılaştırılır (ilaç taraması, 6 dpi'de görüntülenir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Tüm plazmitlerin tamamen karışmasını sağlamak için tüm plazmitleri 500 μL serum içermeyen ortamda karıştırın. 500 μL serumsuz DMEM'e 32 μL LipoD293 reaktifi ekleyin ve tamamen karıştırmak için girdap yapın. Her iki hacmi de iyice karıştırın. Plazmitlerin ve lipoD293'ün 20 dakika boyunca kompleksleşmesine izin verin.
  2. 9 mL tam kültür ortamı içeren% 70 birleşik HEK293T hücresi içeren 75 cm'lik 2 hücreli bir kültür şişesine damla damla ekleyin. Transfeksiyon karışımını serolojik bir pipet (yatay yönde şişe) kullanarak doğrudan hücre katmanına ekleyin.
  3. Ortamı, transfeksiyondan 16 saat sonra 20 mL taze tam DMEM ile değiştirin. Transfeksiyondan 72 saat sonra süpernatanı hasat edin. Viral süpernatanı 1 mL alikotlarda alikotlayın ve -80 ° C'de saklayın. Lentiviral süpernatant -80 °C'de en az 1 yıl stabildir.

4. Lentiviral transdüksiyon

  1. Lentiviral transdüksiyondan önce, seçilebilir bir lentiviral yapı kullanırken bir öldürme eğrisi oluşturun.
  2. Öldürme eğrisi için, 12 oyuklu bir plakada (yaklaşık% 10-20 birleşme) dönüştürülecek hücre hattını plakalayın. Seçicinin bir doz eğrisi ekleyin (öldürme eğrileri için yaklaşık konsantrasyonlar: puromisin 0.5-10 μg / mL, blastisidin 1-20 μg / mL, genetik in (G418) 100-2000 μg / mL, higromisin 100-2000 μg / mL).
  3. Seçilen seçicinin stabil bir konsantrasyonunu sağlamak için ortamı her üç günde bir değiştirin.
  4. % 20-40 birleşen hücreler üzerinde 8 μg / mL polibren nihai konsantrasyonu içeren 9 mL kültür ortamına 1 mL lentiviral süpernatant ekleyin. Bu süpernatant/orta oranı korunurken hacimler küçültülebilir.
  5. Transdüksiyondan 16-24 saat sonra, ortamı değiştirin. Gerektiğinde, fenotip penetransını artırmak için önceki adımı tekrarlayın (başka bir transdüksiyonun gerekip gerekmediğine karar vermek için floresansı kontrol edin).
  6. Transdüksiyondan 48 saat sonra, lentiviral kasete dahil edilen direnç belirtecine karşılık gelen antibiyotiği kullanarak hücreleri seçin. Dönüştürülen hücre popülasyonunun seçimi için kullanılacak konsantrasyon, seçicinin uygulanmasından sonraki 7 gün içinde vahşi tip popülasyonu öldürmelidir (yani, dönüştürülmüş hücrelerin vahşi tip popülasyonunu aşmasına izin vermelidir).
  7. Transdüksiyonun ve hücresel genomun neden olduğu genetik lezyonların hücre canlılığını veya tümörjenisitesini olumsuz etkilememesini sağlamak için farklı enfeksiyon sayılarında (MOI'ler) viral süpernatan uygulayın.

5. Zebra balığı yetiştiriciliği

  1. 0. günde, kanser hücrelerinin aşılanmasından 2 gün önce, yetişkin zebra balığını oda sıcaklığında "aile çaprazı" şeklinde çiftleştirin (Şekil 1).
  2. Zebra balığı tankını muhafaza sisteminden çıkarın (28,5 °C'de tutulur).
  3. Balıkları 1:1 oranında erkek: dişi, küme başına 10 balık olacak şekilde küçük üreme kümelerine ayırın. Balıkları küçük üreme tanklarına, barınak sisteminden çekilen suya, eğimli bir ızgaranın üzerine yerleştirin (zebra balığının doğal olarak yumurtlayacağı sığlıkları taklit etmek için eğimli).
    NOT: Sıcaklığın 28,5°C'den oda sıcaklığına (25°C) düşmesi ve karanlık/aydınlık döngüsünün bir sonraki ışık evresine girişin neden olduğu balıkların yumurtlayacağı durumdur.
  4. Daha sonra, yetişkinleri çıkarın ve muhafaza tanklarına aktarın.
  5. Yumurtaları toplayın ve bir süzgeç kullanarak yumurta suyu ile yıkayın. Yumurtaları tabak başına yaklaşık 75-100'e bölün ve 28.5°C'de tutun.
  6. Toplamadan yaklaşık 6 saat sonra, ölü veya hatalı biçimlendirilmiş embriyoların bulaşıklarını temizleyin.
  7. Ertesi sabah, yumurta suyunu değiştirin ve ölü embriyoların bulaşıklarını tekrar temizleyin.

6. Hasat hücreleri

NOT: Uygun hücre hazırlığı, implantasyon prosedürünün anahtarıdır, gereksiz miktarda hücre kullanmak, daha kolay aşağı akış işlemine izin verir. Üçüncü santrifüjleme adımı kritiktir, çünkü bu size sadece hücre peletini bırakacaktır, santrifüj tüpünün yanlarında sıkışmış kalan PBS, son yeniden süspansiyon hacmini büyük ölçüde aşar.

  1. Hücre kültüründe kullanılan tüm ortamları ve çözeltileri kullanmadan önce 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın.
  2. 75 cm2 kültür şişesi başına 2 mL TryplE veya 25 cm2 şişesi başına 1 mL ekleyin ve tüm hücreler yuvarlanana kadar inkübe edin. Çoğu hücre hattı için 2-5 dakika yeterli olmalıdır. Yüksek epitelyal hücreler veya fibroblastik hücreler için 5-10 dakika uygun dekolmana izin vermelidir (yetersiz tripsinizasyon, aşağı akış süreçlerini engelleyecek ve implantasyon sırasında hücre agregasyonunu kolaylaştıracaktır).
    1. Kalan hücreleri çıkarmak için şişenin kenarına hafifçe vurun.
  3. Komple ortamın orijinal kültür hacmine ekleyin. Hücre kümelerini tek hücre süspansiyonu halinde kesmek için serolojik bir pipetle nazikçe ama iyice yukarı ve aşağı pipetleyin. Köpük, hücrelerin mekanik olarak kesilmesinin bir göstergesi olduğu için bu işlem sırasında köpük oluşturmayın.
  4. Steril 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve 1 mL steril PBS ekleyin. Steril 1000 μL'lik bir pipet kullanarak hücreleri dikkatlice ve iyice yeniden süspanse edin.
  5. Sayım için 20 μL hücre süspansiyonunu çıkarın ve kalan hücre süspansiyonunu santrifüje aktarın. Oda sıcaklığında 200 x g'da 4 dakika santrifüjleyin.
  6. KRİTİK ADIM: Tüm PBS'yi çıkarın, oda sıcaklığında 200 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve kalan PBS'yi çıkarın.
  7. Hücreleri aşağıdaki gibi% 2 polivinilpiridon 40 (PVP40,% 2 (a / h)) içinde 250 hücre / nL'ye seyreltin:
    figure-protocol-2 
    (Örneğin, figure-protocol-3
  8. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlerken hücreleri iyice yeniden askıya alın (hücreler, tümörjenik potansiyel kaybı olmadan% 2 PVP40'ta en az 2 saat tutulabilir).

7. Ksenogreft modellemesi

Tüm deneyler yerel hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak yapılmalıdır.
Uygulamaya bağlı olarak, deneysel tasarımdaki iki ana varyasyon, fenotip değerlendirmesi (7.1 ön tarama aşaması) ve ikincisi, hücrelerin aşılamadan önce modifiye edildiği bir ekran veya embriyoların kimyasal bir inhibitör ile tedavi edildiği 7.3 olarak sınıflandırılır.

  1. Ön tarama ve tümörjenik potansiyelin belirlenmesi
    1. İlgilenilen zebra balığı larvalarını (WT, transgenik veya raportör hattı) 2 dpf'de değişen sayıda floresan hücre (yani 200, 400, 600 ±100) ile aşılayın.
    2. Enjeksiyondan 16-24 saat sonra larvaları tarayın ve aykırı değerleri (ektopik model için dolaşımdaki aşırı yüksek veya düşük hücre sayıları veya ortotopik model için kafa içindeki hücreler) çıkarın ve yanlış aşılanmış balıkları çıkarın. Aynı larvaların kinetik analizine karşı grup analizi için deney grubu başına larva sayısını belirtin.
    3. Zebra balığı larvalarını düzenli aralıklarla izleyin (enjeksiyondan 1,2,4,6 gün sonra (dpi)) ve ±50 larvadan oluşan bir havuzdan 20 bireyi (9. ve 10. adımlarda açıklandığı gibi) görüntüleyin.
    4. Genel fenotip ve hastalık ilerlemelerini izleyin ve ardından ImageJ ile nicelik belirleyin (kanser hücrelerindeki florofor sinyalinin entegre yoğunluğunu ölçme).
    5. Zebra balığı içindeki kanser hücresi büyüme kinetiğini görselleştirmek için verileri çizin (Şekil 3).
  2. Hücreleri a priori olarak değiştirin (ilgilenilen bir geni yıkın veya nakavt edin) ve zebra balığına aşılayın.
    1. Balıkları aşılayın ve tüm istenmeyen fenotipleri ortadan kaldırın (koşul başına).
    2. Bireyleri 1 dpi'de (grup başına 20 larva) görüntüleyin. Bireyler belirli aralıklarla (1,2,4 ve 6 dpi) görüntülenebilir.
    3. Görüntülemeden sonra 6dpi'de, tricain ile aşırı dozda (0.4 mg / mL'de dozlamanın 10 katı fazla) balığı ötenazi yapın ve bir huniyi kaplayan emici kağıda atın.
  3. Aşılamadan sonra balıkları ilaçlarla tedavi edin.
    1. Aşılanmış zebra balığı üzerinde ilaç uygulamasından önce, zebra balığı üzerinde maksimum tolere edilen dozu (MTD) belirleyin (negatif kontrol olarak en yüksek çözücü hacmini kullanarak 10 μM - 0.150 nM'den titre edin) MTD'yi bireylerin %>80'inin tüm tedaviden sağ çıktığı konsantrasyon olarak belirledik.
    2. Enjeksiyondan bir gün sonra, istenmeyen fenotipleri çıkarın.
    3. Balıkları rastgele gruplara ayırın (36-48 birey / durum) ve 1 mL yumurta suyunda kuyucuk başına 6 larva ile 24 oyuklu bir plakada tutun.
    4. İlaçları aşılamadan 24 saat sonra uygulayın. Kontrol olarak, bir deney grubu için uygulanan en yüksek hacimde aynı miktarda çözücü (DMSO, EtOH vb.) kullanın.
    5. Tolere edilen maksimum dozda ilaç tedavisine başlayın. Yumurta suyu içeren ilacı gün aşırı değiştirin. Her değişiklik sırasında yumurtayı, suyu ve ölü larvaları mümkün olduğunca tamamen çıkarın.

8. Enjeksiyon

NOT: Basınçlı hava hattına bağlı, 100 psi fazla basınç sağlayan bir pnömatik darbe kontrolörü kullanın. Bu, hem enjekte etmek (≈20 psi) hem de olası hücre agregalarını (≈100 psi) çıkarmak için yeterli basınca izin verir. Başlangıç basıncı ve süresi 20 psi'de yaklaşık 200 ms olmalıdır. Enjeksiyonun başlangıcında her ikisinin de P'den fazla azaltılması gerekiyorsa, hücre süspansiyonu çok sıvıdır (hücre veya PVP40 konsantrasyonu çok düşük) veya iğne açıklığı çok büyüktür.

  1. Bir kılcal iğneyi kabından dikkatlice çıkarın. İnce bir saatçi forsepsi kullanarak ø20 μm'lik bir açıklık oluşturmak için iğneyi kırın.
  2. 20 μL'lik bir pipet ucu kullanarak hücreleri dikkatlice ve iyice yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu uzun (mikro yükleyici) bir uç kullanarak açık cam kılcal iğneye pipetleyin. İğneyi mikro manipülatöre yükleyin.
  3. 0.04 mg / mL trikadlı içinde anestezi altına alınmış ~ 20-40 larvayı bir transfer pipeti kullanarak bir agaroz kabına yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak larvaları hareketsiz hale getirmek için fazla nemi alın. Larvalar, hala nispeten büyük bir yumurta sarısı kesesinin varlığından dolayı çoğunlukla yanal bir şekilde yönlendirilecektir.
  4. Larvalara yaklaşık 200, 400 ve 600 hücre enjekte edin ektopik model için Cuvier Kanalı (doC) yoluyla.
    1. Benzer şekilde, larvaları retro-orbital (RO) enjekte edin. Ortotopik modeli elde etmek için (100 ±50 hücre enjekte ederek), pikopompa üzerindeki pnömatik darbe uzunluğunu değiştirin (~20 psi, 200 ms'den başlayın ve buna göre ayarlayın). Enjeksiyon sırasında larvaların kurumamasına dikkat edin. Tüm (veya çoğu) larvaların enjekte edildiğinden emin olun.
  5. Enjekte edilen larvaları taze yumurta suyuyla yıkayın ve etiketli temiz bir Petri kabına aktarın (tabak başına 150 kişiye kadar havuzlayın). Yeterli larva enjekte edilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
  6. Aşılamadan sonra, balığı nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 34 °C'de tutun, burada 34 °C, zebra balığı tarafından kolayca tolere edilen en yüksek sıcaklıktır ve memeli kanser hücrelerinin verimli bir şekilde aşılanmasına izin verir.
    NOT: Genel olarak, hem doC hem de RO'da tek hücre hatlarının enjeksiyonu ile %<5'lik mekanik hasara bağlı yaklaşık bir ölüm gözlemledik (mekanik hasar, larvaları enjeksiyondan 1-16 saat sonra öldürür).

9. Tarama

  1. Bir stereo-floresan mikroskobu kullanarak, a priori olarak modifiye edilmiş hücreleri karşılaştırırken (veya implantasyondan 1 gün sonra, ilaçları tararken, tedavi gruplarına rastgele atamadan önce) implantasyondan 1 saat sonra balığı uygun fenotip için tarayın.
  2. DoC yoluyla implante edilen larvalar, implantasyondan 1 saat ila 16 saat sonra kuyrukta hücrelere sahip olmalıdır. Anormallik gösteren balıklar da dahil olmak üzere diğer tüm balıkları enjekte edilen havuzdan çıkarın.
    NOT: Retroorbital olarak implante edilen larvaların hücreler sadece gözün arkasındaki interstisyumda olmalıdır, baş veya vücut boyunca yayılmış hücrelere sahip larvalar havuzdan çıkarılır.
  3. Pozitif olarak taranmış larvaları temizleyin ve rastgele deney gruplarına atayın.
  4. Aşılamadan sonra, balıkları nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 34 °C'de tutun ve günlük olarak izleyin. DOC yoluyla implante edilen hücrelerin hematojen yayılımı neredeyse anında gerçekleşirken, RO boşluğuna implante edilen hücrelerin metastatik yayılımı 2-4 gün sonra yayılacaktır.

10. Zebra balığı larvalarının epifloresan görüntülemesi

  1. Zebra balığı larvalarını 0.2 mg / mL trikat ile uyuşturun, ya balığın suyuna trikin ekleyerek ya da bir balık alt popülasyonunu bakım kabından 0.2 mg / mL trikserin içeren bir tabağa taşıyarak.
    1. Zebra balıklarını, yanal çizginin uyarılması uçuş davranışını indüklemeyene kadar sabit kalana kadar tricaine içeren bir tabakta tutun.
  2. Balıkları, tabak başına yaklaşık 10 adet olacak şekilde agaroz kaplı bir Petri kabına aktarın. Suyun çoğunu çıkarın, ancak tabağın bir ucunu nazikçe kaldırın (suyun Petri kabının alt ucunda nazikçe birikmesine izin verin). Dikkatli bir şekilde yapılırsa, tüm balıklar hizalanacak, kuyrukları aşağı bakacak şekilde hizalanacaktır.
  3. Tabağın üstünden altına kadar tüm balıkları görüntüleyin. Daha sonra balığı yumurta suyuyla trikat içermeyen bir tabağa yıkayın.
  4. Yeterli sayıda kişi görüntülenene kadar tekrarlayın.
  5. Daha sonra larvaları ya 34 ° C'ye geri aktarın ya da trikserin ile aşırı dozda (yani 0.5 mg / mL, 10 dakika inkübe edin, bir huni astarı kaplayan emici kağıda atmadan önce) itlaf edin.

11. (Aşılanmış) zebra balığı larvalarının konfokal görüntülenmesi

  1. Zebra balığını daha önce tarif edildiği gibi 0.2 mg / mL trikain ile uyuşturun.
  2. Stereo mikroskop altına cam tabanlı bir konfokal çanağı yerleştirin ve çanağın dibine odaklanın. 5-10 larvayı cam tabanlı bir konfokal tabağa aktarın. Mümkün olduğu kadar çok su alın.
  3. Larvaları 42 °C, %1 düşük erime noktalı yumurta suyunda çözülmüş agaroz ile örtün. Kullanmadan önce agarozun en az 42 °C'ye kadar soğuduğundan emin olun; Daha yüksek sıcaklıklar larvalara zarar verebilir veya öldürebilir.
  4. Stereomikroskobu kullanarak, kesilmiş bir mikro yükleyici ucu kullanarak larvaları hızlı ama nazikçe aşağı iterek yönlendirin. Ventral oryantasyon gerekiyorsa, larvaları bir saatçinin forsepslerinin maşasıyla (embriyoya dokunmadan) yerinde tutun.
  5. Agaroz setleri larvaların oryantasyonunda ince ayarlamalar yaparken. Konfokal mikroskoba aktarmadan önce larvaların tamamen sertleşmesine izin verin.

12. Konfokal mikroskobun ayarlanması

  1. Yeşil (488 nm) ve kırmızı (564 nm) uyarma lazer çizgilerini açın. Konfokal çanağı konfokal mikroskobun tutucusuna yerleştirin. Epifloresan kullanarak, ışık demetini ilk balıkla birleşecek şekilde hareket ettirin ( x ve y ayarı). Oküler sayesinde odağı larvaların merkeziyle çakışacak şekilde ayarlayın ( z ayarı).
  2. Her iki floresan kanalında 700 kazanç,% 1-5 lazer gücü ayarlayın. Yaklaşık tam dinamik aralığa ulaşmak için lazer gücünü artırın ve ofseti azaltın. Sinyali aşırı doyurmayın, ancak sinyali yalnızca birkaç doymuş piksel gösterecek şekilde geliştirin.
  3. Bir dikiş yakalarken, larvaların başlangıcını ve sonunu bir eksen ( x veya y) boyunca ayarlayın, bir eksen boyunca ayarlanırsa bütün bir embriyo 1 x 4 segmentte görüntülenebilir ve ImageJ kullanılarak tek bir görüntüye sonradan işlenebilir.
  4. Görüntülemeden sonra, saatçinin forsepslerini kullanarak gömülü larvaların etrafını nazikçe yırtarak larvaları agarozdan çıkarın. Aksi takdirde, seyreltilmemiş trikserin ile aşırı dozda larvaları ötenazi yapın, agarozu bir trikin tabakası ile kaplayın ve 10 dakika inkübe edin.

13. Veri analizi

  1. ImageJ/Fiji'deki bireysel veri kümelerini (yani kontrol, ilaç A, ilaç B, ilaç A+B) araç kontrolünden başlayarak ayrı ayrı açın.
  2. Analiz makrosunu açın (açıklamalı komut dosyası kullanılabilir) (http://doi.org/10.5281/zenodo.4290225).
  3. Kısacası, makro analiz aşağıdakileri yapar: tüm açık görüntüleri birleştirir (bir koşul); Görüntüleri, görüntüyü oluşturan ayrı kanallara böler; tüm aksesuar kanallarını kapatır (kanser hücresi kanalını terk eder); birleştirilmiş dizinin tamamında bir eşik algoritması çalıştırır; her bir görüntünün entegre yoğunluğunu ölçer; ve ölçüleri kök klasörde bir Excel sayfası olarak kaydeder.
  4. Makro analizini tüm koşullarda çalıştırın.
  5. Ölçümleri birleştirin (genel olarak en az n=2*20) ve aykırı değerleri kaldırın (Graph pad Prism v8'de Q-testi).
  6. Ölçümleri ya çözücü kontrolüne ya da 1. güne kadar normalleştirin (deneyin türüne bağlı olarak, birincisi bir ilaç inhibisyonu deneyi için ve ikincisi bir büyüme kinetiği deneyi için). Sırasıyla Şekil 3 ve Şekil 4'te gösterildiği gibi zaman veya durum (x ekseni) içinde normalleştirilmiş kanser hücresi yükü (y ekseni) olarak ölçümleri ifade edin.

Sonuçlar

Yeni bir hücre hattından analizine ilerlemek için hızlı ve kolay bir yaklaşım için adım adım talimatlar sağladık. Bir lentiviral aşırı ekspresyon kaseti kullanarak bir floresan izleyicinin aşırı ekspresyonu ile başlıyoruz (adım 3 ve 4). Bunu, enjeksiyon sırasında mümkün olan en az ölü hacmi sağlamak için hücre hazırlığı takip eder ve hem doC hem de retro-orbital boşluğa yüksek hücre sayılarının enjekte edilmesine izin verir (adım 6 ve 7). Daha sonra, tüm vücut kanser hücresi yayılımının kalitatif analizi için stereo-floresan mikroskopi ve daha yüksek büyütmeli konfokal mikroskopi kullanarak yarı yüksek verimli veri toplama işlemi gerçekleştiriyoruz (Şekil 2 ve adım 10, 11 ve 12). Hem stereo hem de konfokal mikroskobik görüntüleme için tekrarlanabilirliği sağlamak için veri elde edilirken dikkatli olunmalıdır, genel ayarlar ve standardizasyon tanımlanmıştır (adım 11 ve 12). Veri analizi (imageJ/Fiji kullanılarak) 16 ve imageJ makroları kullanılarak standardizasyon (adım 13) tartışılmaktadır.

3. adımda, yeni bir kanser hücresi hattının tümörjenik potansiyelini değerlendirmek için hızlı bir ön tarama yapmak için (kanser) hücrelerinin geçici olarak etiketlenmesinden bahsettik. Önemli bir uyarı, kullanımı kolay ve uzun ömürlü olmasına rağmen, burada açıklanan geçici lekenin artefakt oluşturma olasılığına sahip olmasıdır (yani, Fior ve meslektaşları tarafından kapsamlı bir şekilde gerçekleştirildiği gibi, hücre parçalarının tüm hücrelerden ayırt edilebilmesini sağlamak için özen gösterilmelidir 9). Deneyimlerimize göre, bu eserlerin oluşumu, lekenin aşırı stabilitesi ve parlaklığı (hücre ölümünden sonra bile) ile doğrudan bağlantılıdır, burada hücre parçaları dağılır ve bağışıklık hücreleri tarafından alınır, bu da daha sonra yanlış bir şekilde aktif metastazdan türediği sonucuna varılabilir.

Açıklanan her iki modelde de, doC yoluyla sistemik aşılama ve retro-orbital boşlukta lokalize aşılama, enjeksiyondan bir gün sonra larvaların kapsamlı bir şekilde taranması büyük önem taşımaktadır. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, retro-orbital modelde aşılanmış hücrelerin baş bölgesine (retro-orbital bölgenin ötesinde) mekanik olarak yer değiştirdiğini ve yolk kesesi içindeki hücreleri gösteren veya doC enjekte edilen havuzda ödem gösteren tüm larvalar uzaklaştırılmalıdır. Negatif olarak seçilen tüm fenotipler, Şekil 2'de yüksek çözünürlüklü konfokal dikişler olarak gösterilmektedir, ancak stereo mikroskobik gözlem yoluyla kolayca görülebilir ve çıkarılabilir.

Zamanla hücreler hem göç edecek hem de çoğalacaktır. Retro-orbital model için, CRMM1 için komşu dokulara infiltrasyon gözlemledik, ancak CRMM2 için daha az proliferasyon gözlemledik. Şekil 4'te gösterildiği gibi, bazı bireylerde ( ) 2-4 dpi arasında ortaya çıkan uzak metastazı çarpıcı bir şekilde gözlemledik ve 6 dpi'de anlamlı bir fark ölçtük. Her iki hücre hattı için, her iki bölgeye de enjekte edildiğinde proliferatif potansiyeli test ettik. CRMM1 için, normalleştirilmiş tümör hücresi yükü olarak görüntülendiğinde, enjeksiyon bölgeleri için veya enjeksiyon bölgelerinde kanser hücresi sayısında önemli bir artış (p<0.0001) vardı ve her model için birinci güne normalleşti (7.8 kat artış, RO modeli için ±3.2 ve 15 kat artış ±doC modeli için 8,8). CRMM2, her bir model için birinci güne normalleştirildiğinde önemli bir büyüme göstermedi (2,4 kat artış, ±1,9 ve 2,3 kat artış, ±RO ve doC için 1,14). CRMM1'in engraftmandan sonra hem retro-orbital dokuda hem de kaudal hematopoietik dokuda kolayca çoğaldığı bulundu. Hücre hattı CRMM2 her iki modelde de daha az proliferatifti, ancak ilginç bir şekilde, Şekil3B, C'de gösterildiği gibi retro-orbital boşluğa enjekte edildiğinde uzak metastaz yapabildiği bulundu.

Enjekte edilen larvaları 1 dpi'de taradıktan ve bireyleri rastgele tedavi veya kontrol gruplarına atadıktan sonra, balıklar 6 gün boyunca tedavi edildi ve Vemurafenib içeren su değiştirildi (bu inhibitör, başka herhangi bir titre edilmiş antitümör bileşiği ile kolayca değiştirilebilir). Vemurafenib'in ortotopik olarak aşılanmış CRMM1 üzerindeki etkinliğini test ederek, CRMM114'ü aşılayan daha önce yayınlanmış hematojen konjonktival melanom yayılma modelini detaylandırmayı seçtik. CRMM1, Şekil 4'te gösterildiği gibi Vemurafenib ile tedavi edilen ektopik olarak aşılanmış grupta (P<0.0001) güçlü bir anlamlı azalma ve ortotopik olarak aşılanmış model (p<0.05) için bodur ancak anlamlı bir yanıt gösterdi.

figure-results-1
Şekil 2. Enjeksiyon sonrası fenotipik değerlendirme ve tarama. A) Zebra balığı ksenogreft konfokal dikiş üretiminin şematik tasviri, sonraki konfokal projeksiyonun entegrasyonundan sonra kesintisiz, yüksek çözünürlüklü görüntüler verir. Burada zebra balığı ksenogreftleri %1 düşük erime noktalı agaroz içine gömülür ve cam tabanlı bir konfokal tabağa monte edilir (adım 11.3'te açıklandığı gibi). B) Retro-orbital ve Cuvier engraftment kanalının tüm olası sonuçları, yeşil floresan kan damarı raportör zebra balığına (TG:fli:GFP) enjekte edilmiş ve hücreler tdTomato ekspresyonu üzerinden lentiviral yoluyla boyanmış olarak gösterilmiştir. 1 dpi'de (RO paneli) doğru aşılamayı ve istenmeyen fenotipleri (hem beyin sızıntısı hem de kan damarı sızıntısı) gösteriyoruz. Son iki popülasyon, aşağı akış deneysel bulgularını karıştırmadıklarından emin olmak için kaldırılmalıdır. C) Cuvier kanalı (doC) yoluyla hematojen aşılama için istenmeyen fenotipler, kardiyak ödemli larvaların (Kardiyak ödem) ve yolk kesesine sızan hücrelere sahip larvaların (Yolk enjeksiyonu) aşağı akış ölçümlerine müdahaleyi önlemek için çıkarılması gereken ana hatlardır. Doğru şekilde enjekte edilen larvalar, adım 7.1'de anlatıldığı gibi deney gruplarına alınır. (Konfokal mikroskop kullanılarak 1 dpi'de elde edilen tüm görüntüler, ölçek çubukları 200 μm. Sarı kutular, sırasıyla hem RO hem de doC aşılamaları, baş bölgesi ve kaudal hematopoietik doku için metastatik bölgeleri gösterir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 3. Konjonktival melanom hücre hatları CRMM1 ve CRMM2'nin karşılaştırmalı analizi, diferansiyel metastatik ve büyüme kapasitesini göstermektedir. A) Enjeksiyon modellerinin, retro-orbital modelin (RO) ve hematojen aşılama modelinin (doC) şematik gösterimi, kullanılan balıklar TG(fli:GFP) yeşil kan damarı raportörleridir ve tdTomato'yu aşırı eksprese eden hücreler kırmızı ile gösterilmiştir. B) CRMM1 ve CRMM2 ile aşılanmış balıkların temsili fenotipleri, CRMM1, verimli aşılama (hem RO hem de doC) ve RO aşılama bölgesini çevreleyen dokuya küçük ölçekli invazyon (RO, sarı ok uçları) gösterir. CRMM2, her iki aşılama modeli için de önemli ölçüde daha düşük bir aşılama verimliliği sergiler, ancak retro-orbital olarak enjekte edildiğinde uzak metastaz gösterir (RO'da gösterildiği gibi, ok uçları ile gösterilir). (6 dpi'de elde edilen tüm görüntüler, konfokal mikroskop, ölçek çubukları 200 μm. Sarı ok uçları sırasıyla hem RO hem de doC aşılamaları, baş bölgesi ve kaudal hematopoietik doku için metastatik bölgeleri gösterir). C) Hem CRMM1 hem de CRMM2 için kinetik aşılama grafikleri, her iki aşılama modelini 1. günle (1. güne normalleştirerek) karşılaştırarak, hücre hattı CRMM1 için normalleştirilmiş tümör yükünde önemli (p<0.0001) bir artış vardır (1 dpi ile 6 dpi arasında) CRMM2 için (anlamlı olmayan) bir artış eğilimi vardır. CRMM1, doC modelinin daha yüksek bir tümör genişleme oranı gösterdiği (doC aşılanmış larvalar için yaklaşık 2 kat daha yüksek) RO ve doC büyümesi arasında önemli bir fark ortaya koymaktadır. Grafikler, ortalamanın (SEM) ortalama ve standart hatasını gösterir. Tüm gruplar, her bir koşul için 1 dpi olarak normalize edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 4. BRAF V600E inhibitörü Vemurafenib, hem RO hem de doC konjonktival melanom aşılanmış zebra balığı larvalarını önemli ölçüde inhibe eder. A) Zebra balığı fenotiplerinin şematik gösterimi, RO ve doC modelleri. B) Konjonktival melanom hücre hattı CRMM1 enjekte edilen hem RO hem de doC aşılanmış larvalar, normalize tümör yükünde önemli bir azalma gösterir (sırasıyla p<0.05 ve P<0.001). DoC aşılanmış zebra balığı modelleri, gelişmiş bir ilaç tepkisini ve ilaç inhibisyonu ile dozdan bağımsız bir ilişkiyi gösterir, bu da olası bir inhibisyon doygunluğunu gösterir). Grafikler, ortalamanın (SEM) ortalama ve standart hatasını gösterir, Tüm gruplar her bir hücre hattını kontrol etmek için normalleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ReaktifHacim
psPAX2 Serisi1.71 pmol (12.14μg)
pMD2.G0.94 pmol (3.66μg)
Plazmid Transferi*1.64 PMOL (tam hacmi hesapla)

Tablo 1.

Tartışma

Burada, zebra balığı ksenogreftlerinde primer ve metastatik oküler melanomu modellemek için titiz bir yaklaşım tanımladık. Hem lokalize, ortotopik enjeksiyon hem de sistemik, ektopik enjeksiyon modellerini birleştirerek, daha önce hiçbir hayvan modelinin bulunmadığı bir kanser için karsinogenez etiyolojisini özetledik. Erken zebra balığı larvalarının doğal şeffaflığı, floresan olarak etiketlenmiş kanser hücrelerinin tüm hayvan düzeyinde izlenmesine izin vererek, potansiyel metastatik bölgelerin kolay görselleştirilmesini sağlar17. Ayrıca, yüksek büyütmeli konfokal mikroskobik analiz, hücreleri hücre altı çözünürlükteizlememizi sağlar 10.

Yeni bir hücre hattından ksenogreftin kurulmasına ve analizine kadar ilerlemek için hızlı ve kolay bir yaklaşım için adım adım talimatlar sağladık. Bir lentiviral aşırı ekspresyon kaseti (adım 3 ve 4) kullanarak bir floresan izleyicinin aşırı ekspresyonu ile başlıyoruz, ardından enjeksiyon sırasında mümkün olan en az ölü hacmi sağlamak için hücre hazırlığı yapıyoruz. Bu, yüksek hücre sayılarının hem doC hem de retro-orbital uzaya enjekte edilmesini sağlar (adım 7 ve 8). Daha sonra, tüm vücut kanseri hücresi yayılımının kalitatif analizi için stereo-floresan mikroskopi ve daha yüksek büyütmeli konfokal mikroskopi kullanarak yarı yüksek verimli veri toplama işlemi gerçekleştiriyoruz (Şekil 2 ve adım 9 ve 10). Hem stereo hem de konfokal mikroskobik görüntüleme için tekrarlanabilirliği sağlamak için veri elde edilirken dikkatli olunmalıdır, genel ayarlar ve standardizasyon tanımlanmıştır (adım 11 ve 12). Veri analizi (imageJ/Fiji kullanılarak) 16 ve ImageJ makroları kullanılarak standardizasyon (adım 13) ele alınmaktadır.

3. adımda, yeni bir kanser hücresi hattının tümörjenik potansiyelini değerlendirmek için hızlı bir ön tarama yapmak için (kanser) hücrelerinin geçici etiketlemesinden bahsediyoruz. Önemli bir uyarı, kullanımı kolay ve uzun ömürlü olmasına rağmen, burada açıklanan geçici lekenin artefakt oluşturma olasılığına sahip olmasıdır (örneğin, Fior ve meslektaşları tarafından kapsamlı bir şekilde gerçekleştirildiği gibi, hücre parçalarının tüm hücrelerden ayırt edilebilmesini sağlamak için özen gösterilmelidir 9). Deneyimlerimize göre, bu eserlerin oluşumu, lekenin aşırı stabilitesi ve parlaklığı (hücre ölümünden sonra bile) ile doğrudan bağlantılıdır, burada hücre parçaları dağılır ve bağışıklık hücreleri tarafından alınır, bu da daha sonra yanlış bir şekilde aktif metastazdan türediği sonucuna varılabilir.

Bu modelleri kullanarak, aşılanmış hücreleri retro-orbital interstisk içinde fiziksel olarak sınırlayarak primer tümör gelişimini simüle ettik. Aşılamadan 1 gün sonra yapılan kapsamlı tarama, deneyin ilerleyen bölümlerinde uzak bölgede bulunan hücrelerin aktif olarak metastaz yapmasını sağlar (intravaze edilmiş ve yayılmış, sonuçta metastatik nişte ekstravazata dönüşmüştür). Embriyonik ortak kardinal ven olan doC yoluyla aşılama, hücreler için büyük miktarlarda (uygun şekilde konsantre edildiğinde 600 hücre fazlalığında) kolay ve yüksek oranda tekrarlanabilir implantasyona izin verir, metastatik kaskadının birincil aşamalarını etkili bir şekilde atlar (intravazasyon) ve metastatik kaskadının sonraki aşamalarına (adezyon, ekstravazasyon ve büyüme) odaklanmamızı sağlar. Doğru kullanıldığında güçlü araçlar olmasına rağmen, deneyin sonraki aşamalarında yanlış pozitif sonuçlar çıkarılmadığından emin olmak için her iki model de aşılamadan sonraki ilk gün boyunca kapsamlı bir şekilde izlenmelidir.

Önceki yayınlarla uyumlu olarak, konjonktival melanom hatlarının zebra balığı kan dolaşım sistemi boyunca yayıldıktan sonra kolayca metastatik koloniler oluşturduğunu gösterdik14. Burada, ortotopik bir model olarak retro-orbital enjeksiyon ile engraftman repertuarının genişletildiğini ve ardından hücre hattı CRMM2'nin kaudal hematopoietik dokusuna aktif metastazı bildiriyoruz. Daha sonra, BRAF V600E'ye özgü inhibitör Vemurafenib'in zebra balığı larvalarında modellendiğinde konjonktival melanomun birincil formu üzerindeki etkinliğini de bildiriyoruz.

Yukarıda belirtilen yöntemleri kullanarak, yetenekli bir araştırmacı, önerilen her iki modelden de günde yüzlerce aşılanmış larva (saatte yaklaşık 200) üretme yeteneğine sahiptir. İki haftalık bir zaman ölçeğinde, bir ilaç hem maksimum tolere edilen doz için titre edilebilir hem de yerleşik ksenogreft modelinde taranabilir. Baştan sona, transdüksiyonsuz bir hücre hattı kullanarak, zebra balığı modelinde bir ilaç duyarlılık profiline sahip olmak bir ay içinde elde edilebilir (enjekte edilen hücre hattının zebra balığı modelinde tümörjenik olduğu göz önüne alındığında). Elimizde, deney başına 20 kadar az larva ve iki biyolojik tekrar, tekrarlanabilir bir şekilde sağlam ilaç inhibisyonu sağladığında, iki ayrı deney çakıştığında (veya istatistiksel olarak anlamlı bir büyüme inhibisyonu vermediğinde), üçüncü bir biyolojik tekrar gerçekleştirilebilir.

Küçük ayarlamalar sayesinde, bu modeller bu implantasyon stratejilerini diğerlerinin yanı sıra glioblastoma (arka beyin boşluğu enjeksiyonu), meme kanseri (doC enjeksiyonu) ve osteo sarkom (doC) için hızlı bir şekilde uyarlamamıza izin verdi 18,19,20,21. Bu modeller daha sonra hem tek ilaçların hem de kombinatoryal ilaç stratejilerinin hem temel araştırmaları hem de klinik öncesi taraması için kullanılabilir. Son zamanlarda, bu modelleri kullanarak farklı ilaç uygulama rejimlerini ve bunların foto aktivasyonunu tanımladık 13.

Açıklamalar

Hiç kimse.

Teşekkürler

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından 667787 No'lu hibe sözleşmesi (UM Cure 2020 projesi, www.umcure2020.org) kapsamında sağlanan finansmanla desteklenmiştir. Çin Burs Konseyi, JY'ye doktora hibesi için nazikçe kabul edilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2,5 mm kutu filamentBilim ürünleriSutter P97 veya P1000 3 mL transfer pipetleri kullanarak mikro enjeksiyon iğnelerini çekmek içinFB255B
Zebra balığı embriyolarının transferi ve seçimi içinMerckZ350796
AgaroseMilipore2120yumurta suyunda %1,5 (a/h), 100 mL DPBS'de 1,5 g, zebra balığı larvalarının enjekte edilmesi ve stereofloresan görüntülenmesi için mikrodalgada çözünmesi için mikrodalga
Kılcal damarlar: borosilikat cam dışdünya hassas aletlerBF100-78-10İğne hazırlama için kullanılan borosilikat cam kılcal damarlar
DMSOSigmaD8418Genellikle ilaç tedavilerinde çözücü olarak kullanılır, 2-8 ° C'de saklanmalıdır; C karanlığı.
DPBSThermo Fischer Bilimsel14190144Dulbecco' Hücreleri yıkamak için Mg2 + ve Ca2 + içermeyen fosfat tamponlu salin, Ca2 + eksikliği, kaderinler yoluyla hücre-hücre yapışmasını bozar ve enjeksiyon sırasında hücre agregasyonunu önler
Yumurta suyuAnında okyanusSS15-10  Demineralize suda 0.6 mg/L nihai konsantrasyon deniz tuzu
GFP kodlayan lentiviral transfer plazmidiAddgenePlazmid #106172Snaar laboratuvarında üretilmiştir, Addgene
Hek293TATCCCRL-3216'daLentiviral partiküller üretmek için kararlı hücre hattı, lentiviral partiküllerin üretilmesi için gerekli olan SV40-T antijenini içerir
Leica sp8 konfokalLeica LeicaTCS SP8405/488/514 / 635nm lazerli otomatik sahne konfokal mikroskop
LipodD293SignagenSL100668Yüksek verimli HEK293t optimize edilmiş transfeksiyon reaktifi
Düşük erime noktalı agarozMilipore2070100 mL'de 1,5 g yumurta suyunda %1 (a/h) DPBS, mikrodalgada çözündürülür, konfokal görüntüleme için zebra balığı larvalarını gömmek için
Mikro yükleyici uçlarıFischer bilimsel10289651esnek Mikro yükleyici uçları
Mikro manipülatörDünya hassas aletleriM3301Rx/y/z mikroenjeksiyon için manuel mikro manipülatör
İğne çektirmesi: P-97 veya P-1000SutterP-97iğne çektirmesi standartlaştırılmış mikro aşılama iğneleri üretmek için kullanılır
Nr.5 saatçi forsepsVWRHAMMHSC818-11ince saat yapımcısı forsepsleri geri iğneleri
kırmak için kullanılırPicopumpWorld hassas aletlerSYS-PV820mikroenjeksiyon için basınç sağlayan nabız kontrolörü
pMD2.GAddgeneplazmid #12259Didier Trono tarafından hediye edildi, 2. nesil lentiviral virülans plazmidi
psPAX2Addgeneplazmidi #12260Didier Trono tarafından hediye edildi, 2. nesil lentiviral ambalaj plazmidi
PVP40Sigma-AldrichPVP40Polivinilpirolidon ortalama mol wt 40.000) DPBS'de PVP40 %2 (a/h), 50 mL DPBS'de 1 g PVP40. Girdap ve 37 ° C'de kuluçkaya yatırın; Çözünmeyi kolaylaştırmak için C. Oda sıcaklığında saklayınız.
tdTomato kodlama lentiviral transfer plazmidiAddgenePlazmid #106173Snaar laboratuvarında üretilmiştir, Addgene
iletilen ışık stereo mikroskobuLeicaleica M50'de (MDG33 tabanı)ayna ayarlanabilir aydınlatmalı leica iletilen ışık mikroskobu.
TrikainSigma-AldrichE10521Etil 3-aminobenzoat metansülfonat veya MS-222
TryplEThermo Fischer Scientific12604-01Sentetik tripsin replasmanı, hücrelere daha az zarar verir ve güçlü bir şekilde yapışan hücrelerin nazikçe dağılmasına izin verir. (Termo-
willco çanakWillCo kuyularıGWST-504050 mm cam tabanlı tabaklar, 20'ye kadar zebra balığı larvasının gömülmesine izin vererek, geniş optik cam yüzeyi sayesinde tek bir tabakta birden fazla durumun görüntülenmesini sağlar
mevcuttur

Kaynaklar

  1. Yang, J., Manson, D. K., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Treatment of uveal melanoma: where are we now. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
  2. Wong, J. R., Nanji, A. A., Galor, A., Karp, C. L. Management of conjunctival malignant melanoma: A review and update. Expert Review of Ophthalmology. 9, 185-204 (2014).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews Cancer. 9, 274-284 (2009).
  4. White, R. M., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  5. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 35-44 (2005).
  6. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  7. Palmblad, M., et al. Parallel deep transcriptome and proteome analysis of zebrafish larvae. BMC Research Notes. 6, 428(2013).
  8. Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177, 1903-1914 (2019).
  9. Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).
  10. Campbell, P. D., Chao, J. A., Singer, R. H., Marlow, F. L. Dynamic visualization of transcription and RNA subcellular localization in zebrafish. Development. 142, Cambridge. 1368-1374 (2015).
  11. Campeau, E., et al. A Versatile Viral System for Expression and Depletion of Proteins in Mammalian Cells. PLoS One. 4, 6529(2009).
  12. vander Helm, D., et al. Mesenchymal stromal cells prevent progression of liver fibrosis in a novel zebrafish embryo model. Scientific Reports. 8, 16005(2018).
  13. Chen, Q., et al. TLD1433 photosensitizer inhibits conjunctival melanoma cells in zebrafish ectopic and orthotopic tumour models. Cancers. 12, (2020).
  14. Pontes, K. C. deS., et al. Evaluation of ( fli:GFP ) Casper Zebrafish Embryos as a Model for Human Conjunctival Melanoma. Investigative Opthalmology & Visual Science. 58, 6065(2017).
  15. Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo 3D system and the zebrafish model. Biology Open. 6, 133-140 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. White, R. M., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  18. Mercatali, L., et al. Development of a patient-derived xenograft (PDX) of breast cancer bone metastasis in a Zebrafish model. International Journal of Molecular Sciences. 17, (2016).
  19. Tulotta, C., et al. Imaging cancer angiogenesis and metastasis in a zebrafish embryo model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, Springer New York LLC. 239-263 (2016).
  20. Paauwe, M., et al. Endoglin expression on cancer-associated fibroblasts regulates invasion and stimulates colorectal cancer metastasis. Clinical Cancer Research. 24, 6331-6344 (2018).
  21. Cao, J., et al. Overexpression of EZH2 in conjunctival melanoma offers a new therapeutic target. Journal of Pathology. 245, (2018).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Zebrafish NakliOrtotopik NakilEktopik NakilTümör MetastazıHücre GöçüKonfokal MikroskopiEpifloresan MikroskopiGenetik İnhibisyonHassas Tıp

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.