Method Article

Damlacık Arayüzü Bilayer'in Sıcaklık Kontrollü Montajı ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/62362

⸱

April 19th, 2021

 , 
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek erime sıcaklıklarına sahip lipitler için lipid monolayer montajını ve damlacık arayüzü bilayer oluşumunu teşvik etmek için geri bildirim sıcaklığı kontrollü bir ısıtma sisteminin kullanımını ve membrandaki sıcaklık odaklı değişiklikleri karakterize etmek için kapasitans ölçümlerini detaylandırıyor.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipid bilayerlerin montajı için damlacık arayüzü bilayer (DIB) yöntemi (örn. DİB'ler) yağdaki lipid kaplı sulu damlacıklar arasında diğer yöntemlere göre önemli faydalar sunar: DİB'ler kararlı ve genellikle uzun ömürlüdür, bilayer alanı ters yönde ayarlanabilir, broşür asimetrisi damlacık bileşimleri ile kolayca kontrol edilebilir ve doku benzeri çift katman ağları birçok damlacığın bitişik olmasıyla elde edilebilir. DiB'lerin oluşturulması, lipitlerin damlacıkların yüzeylerinde yüksek yoğunluklu lipid monolayerlere kendiliğinden bir şekilde bireyi gerektirmektedir. Bu, yaygın sentetik lipitler için oda sıcaklığında kolayca meydana gelse de, bazı hücresel lipit özleri de dahil olmak üzere oda sıcaklığının üzerinde erime noktalarına sahip lipitler için benzer koşullarda yeterli bir monolayer veya stabil iki katmanlı oluşmaz. Bu davranış, model membran çalışmalarındaKI DDB'lerin bileşimlerini ve belki de biyolojik alaka düzeyini sınırlamıştır. Bu sorunu gidermek için, DIB damlacıklarını barındıran yağ rezervuarını dikkatlice ısıtmak ve sıcaklığın lipid zarı üzerindeki etkilerini karakterize etmek için deneysel bir protokol sunulmaktadır. Özellikle, bu protokol, daha geniş bir lipit tipi kümesi için monolayer montajını ve bilayer oluşumunu iyileştiren yüksek sıcaklıkları reçete etmek için bir geri bildirim döngüsü tarafından kontrol edilen termal iletken alüminyum fikstürün ve dirençli ısıtma elemanlarının nasıl kullanılacağını göstermektedir. Zarın yapısal özellikleri ve bilayerden oluşan lipitlerin termotropik faz geçişleri, DIB'nin elektrik kapasitansındaki değişiklikler ölçülerek ölçülür. Birlikte, bu prosedür, çok bileşenli lipit karışımları için etkili bir erime sıcaklığı(TM)belirlemek de dahil olmak üzere çeşitli sıcaklıklarda model membranlarındaki biyofiziksel olayların değerlendirilmesinde yardımcı olabilir. Bu özellik, model membranlarında doğal faz geçişlerinin daha yakın bir şekilde çoğaltilmesine izin verecek ve hücresel meslektaşlarının heterojenliğini daha iyi yakalayanlar da dahil olmak üzere daha geniş bir membran bileşenlerinden model membranların oluşumunu ve kullanımını teşvik edecektir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel zarlar, tüm canlı hücreleri kapsülleyen ve alt bölümlere ayıran binlerce lipit tip1,protein, karbonhidrat ve sterolden oluşan seçici geçirgen bariyerlerdir. Kompozisyonlarının işlevlerini nasıl etkilediğini anlamak ve doğal ve sentetik moleküllerin hücresel zarlarla nasıl etkileşime girdiğini, bunlara nasıl yapıştığını, bozulduğunu ve yer değiştirmesini, bu nedenle biyoloji, tıp, kimya, fizik ve malzeme mühendisliğinde geniş kapsamlı etkileri olan önemli araştırma alanlarıdır.

Bunlar, hücresel karşılıklarının bileşimini, yapısını ve taşıma özelliklerini taklit eden sentetik veya doğal olarak oluşan lipitlerd....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isıtmalı fikstür hazırlığı

  1. Genişlik ve uzunluk olarak 25 mm x 40 mm'ye kesilmiş 1 mm kalınlığında 2 adet yalıtımlı kauçuk toplayın, sırasıyla, 25 mm x 40 mm olan 6 mm kalınlığında bir kauçuğun 2 parçası, hazırlanmış bir alüminyum taban fikstür tertibatı ve alüminyum taban fikstürünün görüntüleme penceresine sığan akrilik bir yağ haznesi (imalat ve patlayan montaj görünümü hakkında ayrıntılar için S1, S2 ve S3 şekillerine bakın). Alüminyum fikstürü ilk olarak fikstürün altına UV kürlenebilir yapıştırıcılı bir cam kapaklı görüntüleme penceresi takarak ve fikstürün her 25 mm x 25 mm yan flanşının üstüne 1 dirençli ısıtma elemanı yapıştırarak....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, dib oluşumu için mikroskop aşamasında alüminyum fikstürün ve akrilik yağ rezervuarın nasıl hazırlandığını göstermektedir. Montaj adımları 1.2-1.4, fikstürü daha verimli ısıtma için sahneden termal olarak yalıtmaya yarar. 1.5-1.7 arası adımlar termokuplün fikstüre nasıl düzgün bir şekilde takılacağını ve yağ haznesinin nasıl konumlandırılacağını gösterir ve 1.8 -1.9 adımları bu parçalara yağ dağıtmak için önerilen yerleri gösterir.

Şek.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol, DIB oluşturmak için kullanılan yağ ve damlacıkların sıcaklığını kontrol etmek için deneysel bir sistemin montajı ve işletilme talimatları sağlar. Özellikle RT'nin üzerinde erime sıcaklıklarına sahip lipitler kullanılarak DIB oluşumunu sağlamak için faydalıdır. Ayrıca, yağ rezervuarının sıcaklığını tam olarak değiştirerek, bilayer sıcaklığı, yüksek sıcaklıkların kapasitans, alan, kalınlık, indüklenmiş termotropik faz değişiklikleri, membran aktif türlerin kinetiği ve iki katlı arayüzün yapışma e.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ulusal Bilim Vakfı Hibe CBET-1752197 ve Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi Hibe FA9550-19-1-0213 tarafından finansal destek sağlanmıştır.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
25 mm x 40 mm x 1 mm yalıtkan kauçuk (x2)Herhangiarmatürün altını mikroskop aşamasından yalıtır
25 mm x 40 mm x 6 mm yalıtkan kauçuk (x2)Herhangi biriIsıtma elemanlarını mikroskop tablası klipslerinden zarar görmekten korur ve ısıtma elemanlarının üst kısmını yalıtır.
3-(N-morfolino) propansülfonik asit Sigma AldrichM3183Lipid çözeltisi için tamponlama maddesi
Akrilik alt tabakaEvde üretilmiştirHTD_STG_2~ 1000 uL akrilik kuyu, oryantasyonu sabitlemek için poka-yoke dış profilli
Alüminyum armatürEvde üretilmiştirHTD_STG_1Akrilik armatürü tutan ve ısıtma elemanları için yağ kuyusuna bitişik iki düz ped içeren bir yağ kuyusuna sahip taban armatürü 
Beyin Toplam Lipid Ekstresi Avanti131101C-100mg25 mg / mL domuz lipid ekstresi 
Kompakt DAQ Şasi (cDAQ)National Instruments cDAQ-9174 ve nbsp;Birden fazla sensör ölçüm veya çıkış modülünü barındırmak için şasi
Veri Toplama Sistemi (DAQ)Moleküler Cihazlar Dijital veri 1440A Yüksek çözünürlüklü analogdan dijitale dönüştürücü
Sabit kazançlı amplifikatör/güç kaynağıHewlitt PackardHP 6826AVoltaj çıkış modülünden DC voltaj çıkışını yükseltir
Cam Kapak KaymaCorningCLS284525Alüminyum tabanın altını sızdırmaz hale getirir ve çift katmanlı Isıtma elemanının optik karakterizasyonuna izin verir
(x2)OmegaKHLV-101/525 mm x 25 mm polimid film 5 watt güç limitli kapton ısıtma elemanı. 
M3 Paslanmaz Çelik VidaMcMaster Carr90116A150Termokupl'u alüminyum fikstüre sabitler
Yama kelepçesi amplifikatörüMoleküler Cihazlar AxoPatch 200B Akımı ölçer ve ana gerilime çıkış sağlar.tage
Kişisel bilgisayarfazla yüksek hızlı usb bağlantı noktasına ve en az 6 Gb ram'e sahipherhangi
Potasyum KlorürSigma AldrichP3911Ayrışmış iyonların elektrolit çözeltisi
Sıcaklık giriş modülüNational Instruments NI 9211için açık ve soğuk bağlantı termokupl ölçümlerini mümkün kılar
;0,02 inç çapında ve 6 inç uzunluğunda U tipi termokupl
UV ile Kürlenebilen YapıştırıcıLoctite19739Cam lamel alüminyum taban fikstürüne sabitler
Gerilim çıkış modülüNational Instruments NI 9263cDAQ şasisi ile kullanım için analog voltaj çıkış modülü
Dalga formu jeneratörüAgilent33210A 10 mV 10 Hz sinüzoidal dalga formu çıkışı vermek için kullanılır
Alüminyum Birden bir Bilgisayar cDAQ şasi Termokupl Omega JMTSS-020U-6 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Droplet Interface BilayerLipid Bilayer AssemblyTemperature ControlMembrane CapacitancePatch Clamp AmplifierThermotropic Phase TransitionBilayer Area TuningIon Channel FormationModel Membrane CharacterizationLipid Melting Temperature

Related Articles