Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Zebra balığı (Danio rerio), gelişimi ve hastalığı incelemek için güçlü bir omurgalı model organizma olarak ortaya çıkıyor. Zebra balığı, yüksek oranda korunmuş genetiği (~%70 genetik homoloji ve ~%84 hastalıkla ilişkili genler) ve temel organ morfolojik özelliklerini insanlarla paylaşır^1,2. Bu koruma, zebra balıklarının kanser³,⁴de dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarını modellemek için^{kullanılmasına}izin verir.

Zebra balıklarının kullanımı ve bakımı, küçük boyutları, tüm yıl boyunca yüksek doğurganlıkları ve dış gübreleme^3,5nedeniyle farelerden çok daha kolay ve daha uygun maliyetlidir. Zebra balığı embriyoları, yaşamlarının ilk 5-7 günü boyunca canlı beslenme gerektirmez ve gelişim, enfeksiyon ve kanser¹, 4^,6,7için etkili bir model olarak kullanılmıştır. Zebra balığı embriyoları döllenme sonrası 48 saatte yumurtadan çıkar (hpf) ve tüm organları oluşmuş, atan bir kalp ve fonksiyonel dolaşım sistemi, karaciğer, beyin, böbrek iliği^vb. Ayrıca, gelişimin bu aşamasında sadece doğuştan gelen bağışıklık oyundadır, adaptif bağışıklık hala gelişmektedir, bu da bağışıklık sistemi baskılanmış mutantların kullanımına gerek kalmadan insan hücrelerinin genel olarak verimli bir şekilde kaplanmasına izin verir^7,8. Bununla birlikte, tüm insan hücrelerinin eşit olarak^9grafya etmediğini ve örneğin lösemi hücreleri için, verimli engraftasyon için fagositlerin (nötrofiller ve makrofajlar) tükenmesi gerektiğinin gösterildiğini belirtmek önemlidir¹⁰.

Zebra balığı genetik çekiş kabiliyeti ve erken embriyonik aşamalarının optik şeffaflığı, tek hücreli intravital görüntülemenin yüksek çözünürlükte ve böylece çeşitli biyoloji alanlarında son teknoloji görüntüleme tekniklerinin oluşturulmasına izin verir. Ayrıca, kanser bağlamında, bu özellikler anjiyojenik ve metastatik potansiyeli incelemek gibi konak tümör etkileşimlerinin en erken aşamalarının gerçek zamanlı çalışmaları ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi ile etkileşimler için yararlıdır 8^,9,11,12,13.

Kısa ksenograft tahlilinde metastatik "evrim" için zaman olmamasına rağmen- tümör hücrelerinin metastatik kapasitesini analiz etmek mümkündür (yani, invazyon, intravazasyon, dolaşımda sağkalım, ekstravazasyon ve kolonizasyon gibi metastatik adımlardan geçme verimlilikleri ve bu nedenle bu süreçleri vivo ve gerçek zamanlı olarak incelemek^8,11,13,14).

Yaşam döngüsünün özellikleri zebra balığını kanserde kişiselleştirilmiş tıp için benzersiz bir model olarak yerleştirir. Tahliller daha kısa bir zaman aralığında yapılabilir ve birkaç hafta içinde elde edilen sonuçlar^7,8,9^,11,12,15,16. Bu tahlillerin kerevizi ve fizibilitesi, doktorlara ve araştırmacılara, zamanın önemli bir ihtiyaç olduğu kanser hastaları için yararlı olabilecek çevirisel sonuçlar elde etme imkanı sağlar.

Başarılı zebra balığı embriyo ksinograftları üretme girişimlerine rağmen, enjeksiyon prosedürünün standartlaştırılmasının yanı sıra enjeksiyon sonrası hücre canlılığının ve tümör davranışının değerlendirilmesinde hala ihtiyaç vardır.

Bu protokolde araştırmacılara zebra balığı embriyolarına insan kanseri hücre çizgilerinin enjeksiyonu ve daha sonra tümör hücre davranışının sabitlenmesi, immünostaining, görüntüleme ve nicelleştirilmesi için açık ve ayrıntılı bir adım adım kılavuz sunuyoruz.

Zebra balığı(Danio rerio)modeli, Avrupa Hayvan Refahı Mevzuatı, Direktifi 2010/63/AB (Avrupa Komisyonu, 2016) ve Champalimaud Balık Platformu'nun standart protokollerine göre ele alındı ve sürdürüldü. Tüm protokoller Champalimaud Hayvan Etik Komitesi ve Portekizli kurumsal kuruluşlar-ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética Hayvan/Hayvan Refahı ve Etik Organı) ve DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/Gıda ve Veterinerlik Genel Müdürlüğü) tarafından onaylandı.

3. >>
4. >>
5. 1. 
      
   3. 1. >>
      5. 
         
   4. 
      
      
6. 
   

Zebra balığı yabancıyıldızı, anti-kanser tedavilerini incelemek için bir araç olarak.
HCT116 kolorektal kanser hücre hattı CM-DiI ile etiketlendi ve döllenme sonrası 2 günlük PVS (dpf) embriyolara enjekte edildi. Enjeksiyondan sonra, ksinograftlar zebra balığı gelişiminden ödün vermeden tümör hücrelerinin büyümesini sağlayan bir sıcaklık olan 34 ° C'de inkübe edildi. Ertesi gün, ksinograftlar PVS'de bir tümör kütlesinin varlığına veya yokluğuna göre tarandı (düzgün enjekte edilmeyen zebra balıkları atıldı ve ötenaziye tabi tökezlendi) (Şekil 6A-A''). Ksinograftlar tümör boyutlarına göre gruplandırıldı (Şekil 6B-B'') ve tedavi edilmeyen kontrollerde ve FOLFIRI kemoterapisinde (0.18 mM Folinik asit, 0.08 mM Irinotecan ve 4.2 mM Fluorouracil (5-FU)) rastgele (kuyu başına 6 kuyu plakasında: ~12 ksinograft) dağıtıldı.

Kontrol E3 ve ilaçlar günlük olarak değiştirildi ve ölü zebra balıkları atıldı. 4 dpi ve tedavi sonrası üç gün (dpt), engraftment protokolün 8.2 adımında olduğu gibi ölçüldü. Engraftment, PVS'de 4 dpi'de tümör kütlesi sunan ksinograftların sıklığı olarak kabul edilir. Örneğin, deneyin sonunda 40 canlı larva varsa ve 40'ın 35'i PVS'de bir tümör varsa, engraftment oranı% 87.5'tir. Ksinograftlar, immünofluoresans ve konfokal mikroskopi ile tümör büyüklüğü ve apoptozu değerlendirmek için ötenazi yapıldı ve sabitlendi.

Nüklei karşıtlığı için anti-cleaved Caspase 3 antikoru (asp175) (tavşan, 1:100, #CST 9661) ve DAPI (50 μg/mL) kullanılarak apoptotik hücreleri tespit etmek için immünoresans yapıldı. Görüntü yığını veri kümeleri (her 5um) adım 12'deaçıklandığı gibi FIJI/ImageJ yazılımı ile gerçekleştirilen bir LSM710 konfokal mikroskop ve veri analizinde elde edilmiştir. Mitotik indeksin nicelleştirilmesi, apoptoz (% Aktif Caspase3) ve tümör büyüklüğü, FOLFIRI'nin mitozun önemli bir azalmasına (Mann Whitney Testi, P<0.0001) ve apoptozun önemli bir indüksiyonunu (Mann Whitney testi, P<0.0001), tümör büyüklüğünün % 54 azalmasına neden olduğunu ortaya koydu (P<0.001) (Şekil 8C-E, Şekil 9A-E).

Bu özellikler, yüksek verimli fenotipik ilaç ekranlarında ve birkaç kanser tedavisinin hücre içsel ve fizyolojik etkilerini kısa bir zaman diliminde test etmek için yararlıdır.

İnsan-zebra balığı ksinograftlarının insana özgü antikorlarla karakterizasyonu
Tüm ksinograft modellerinde olduğu gibi, hücreleri yanlış tanımlama riski vardır. Örneğin, makrofajlar insan kanser hücrelerini fagositoz ederek lipofilik boya ile etiketlenebilir ve daha sonra zebra balığı konağı boyunca seyahat edebilir ve böylece bu hücreler tümör mikrometastaz ile karıştırılabilir. Bu nedenle, ksinograftların insan HLA, ki-67 veya insan mitokondri (hMITO) gibi spesifik insan antikorlarıyla etiketlenmesi, ilk karakterizasyon ve ayrıca tümör hücrelerinin morfolojisi ile tanışması için çok önemlidir (Şekil 9F-I).

Hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için Zebra balığı ksinograft.
Zebra balığı ksinograft modelinin bir başka büyük avantajı, farklı tümör hücrelerinin etkileşimlerini incelemek ve her hücre türünün diğerinin davranışını nasıl etkileyebileceğini analiz etmek mümkündür. Farklı insan kanser hücreleri (aynı tümörden veya farklı tümörlerden farklı klonlar) birlikte enjekte edilebilir. Bu örnekte, aynı hastadan elde edilen iki CRC hücre hattı farklı lipofilik boyalarla etiketlenmiş ve enjeksiyon için 1:1 oranında karıştırılmıştır (Şekil 9J-K').

aynı greft üzerinde insan hücre hatlarını karıştırırken (poliklonal tümörler oluşturmak için), dio boyasını kullanmaktan kaçının, çünkü bu spesifik olmayan çift boyama ile sonuçlanır(Tablo 2). Bunun yerine, denemenin sonunda popülasyonların kolay bir şekilde ayırt edileceğini görmek için örneğin, yeşil CMFDA (hücre satırı#2) ile CM-DiI (hücre satırı#2) veya Derin kırmızı (hücresatırı#2) (Tablo 2, Şekil 9J-K') ile CM-DiI (hücre satırı#1) kullanın. Tümör içindeki her klonun sıklığını ölçmek için, her klonu tanımlamak için FIJI'de 2 farklı sayaç tipi kullanın ve ardından her birinin (%) göreli fraksiyonunu elde etmek için toplam hücre sayısına (tüm klonların toplamı) bölün.

Şekil 1. Zebra balığı xenograft protokolünün akış şeması özeti Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Zebra balığı embriyo enjeksiyonu için malzemeler: A. Borosilikat iğne B. %2 Agarose tabağı. C Saç tokası halkası D. Saç tokası döngüsü yapmak için adımlar: 1. 1 saç tüp dışında yaklaşık 1 santimetre saç bırakarak bir cam kılcal tüp içine yerleştirin. 2-3. Saçın dış ucunu forseps yardımıyla cam kılcal boruya kıvırın ve ~0,5 mm uzunluğunda bir döngü oluşturur. 4. Kılcal borunun kenarını bir damla oje ile kapatın. 5-6. Kırılmasını korumak için kılcal damarın etrafına bir parça elektrik bandı kapatın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Zebra balığı embriyolarının döllenme sonrası 48 saatte temsili stereomikroskop görüntüleri (48 hpf): A-A'. 48 hpf gelişimde zebra balığı embriyosunun normal morfolojisi, mikroenjeksiyon B-B'ye hazır. 48 hpf'de mikroenjeksiyonlar için yeterli gelişim aşamasına ulaşamayan ve zaten bir dereceye kadar kardiyak ödem (siyah ok ucu) ve şişmiş yumurta sarısı sunan bir zebra balığı embriyosunun morfolojisi. A' ve B' sırasıyla A ve B büyütmeleridir. Ölçek çubukları 500 μm'yi temsil eder.

Şekil 4. Zebra balığı mikroenjeksiyon plakası kurulumunun şematik gösterimi: A. Uyuşturulma embriyolarının %3 Agar/%2 Agarose plakada hizalanması. B. Perivitelline alanını (PVS) gösteren siyah bir okla 2 günlük döllenme sonrası zebra balığı embriyosunun grafik gösterimi. C ve D. Kanser hücreleri, döllenme sonrası 48 saatlik bir embriyonun perivitelline uzayına (PVS) enjekte edilen PVS'ye farklı açılarla enjekte edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. Metastatik test. Enjeksiyon sonrası 1 saat (1hpi) enjekte edilen embriyolar dolaşımdaki tümör hücrelerinin yokluğuna (NO_circ) veya varlığına (CIRC) göre sıralanır. Enjeksiyondan 4 gün sonra mikrometastaz sunan her iki gruptaki ksinograftların sayısı ölçülür. (A )NO_circ grubundaki hücreler mikrometastaz oluşturabilmek için tüm metastatik adımlardan geçmek zorunda kalırken, CIRC grubundaki(B)hücreler metastatik basamaklamanın sadece son adımlarından geçerler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. Enjeksiyon sonrası 1 gün ve enjeksiyon sonrası 4 gün xenografts temsili floresan stereomikroskop görüntüleri. Floresan protein TdTomato'yu (kırmızı) ifade eden insan kanser hücreleri 2 dpf zebra balığı embriyosuna mikroenjected edildi. 1 dpi'de, enjekte edilen embriyoları tarayın ve kötü enjekte edilenleri veya embriyoları ödem(A-A'') ile atın, iyi enjekte edilen embriyoları tümör boyutlarına (B-B'') göre sıralayın. C. SW620 ksinograftlarda 1 dpi'de farklı tümör boyutu kategorilerinde bulunan toplam hücre sayısının temsili nicelemesi. Her nokta, 4 dpi'12.At bölümde açıklandığı gibi ölçülen bir ksinograftı temsil eder, larvaları tarar ve farklı sınıfları ölçer: tümör yok (D); PVS 'de tümör (E) ve CHT'de(F)mikrometastaz ile. Ölçek çubukları 500 μm'yi temsil eder.

Şekil 7. Konfokal görüntüleme için ksinograft montajının şematik gösterimi. 1. Kapak Y'de etiketleme örneği, kapak X'te açık mavi çizgi, montaj ortamlarının sızmasını önlemek için petrol jölesi / silikon gresinin uygulandığı çevreyi temsil eder. 2. Konfokal görüntüleme için coverlip X'te ksinograft hizalama örnekleri. 3. Sulu montaj ortamı (mavi ok), kapak kılıfı X' in üstüne Y'yi bağlamak için kullanılır. Düzgün monte edilmiş kapak kılıfları örneği. 5. Kapaklar daha sonra bir cam kaydırağın üzerine yerleştirilir ve şeffaf bantla sabitlenir. 6. Konfokal görüntüleme için hazır monteli ksinograftlar. BioRender.com ile oluşturuldu Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8. Tümör boyutunun konfokal mikroskop görüntüsünün görsel gösterimi. Enjeksiyon sonrası 4 gün A'da bir HCT116 xenograft konfokal görüntüleri. DAPI kanalındaki z-yığın dilimleri serisi 5 μm aralıkla elde edilir. Kırmızı kesikli çizgiler, hücre sayımı için kullanılan üç temsili dilimi daire içine alan çizgiler. B. ImageJ/Fiji yazılımındaki Hücre Sayacı Eklentisi ile DAPI çekirdeklerinin ölçülmesi. C-E. DAPI'da veya fosfo-histon H3 antikor (yeşil) kullanarak mitotik figürleri görselleştirmenin/ölçmenin mümkün olduğu tümör içinde tek hücreli çözünürlük örneği. D ve E, C'nin büyütmeleridir. Ölçek çubukları 50 μm'yi temsil eder.

Şekil 9. Temsili sonuçlar. A-E. HCT116 kolorektal kanser hücre hattı Vybrant CM-DiI ile etiketlendi ve döllenme sonrası 2 günlük PVS (dpf) embriyolara enjekte edildi. Enjeksiyondan sonra, ksinograftlar 34 °C'de inkübe edildi. 1 dpi'de, ksinograftlar tedavi edilmeyen kontrollerde ve FOLFIRI'de tarandı ve rastgele dağıtıldı, art arda 3 gün boyunca tedavi edildi ve 4 dpi'de sabitlendi. A. Nüklei karşıtlığı için anti-cleaved Caspase 3 antikoru ve DAPI kullanılarak apoptotik hücreleri tespit etmek için immünoresans yapıldı. Mitotik indeksin C,apoptoz (% Aktif Caspase3) D'nin ölçülmesi, ve tümör boyutu E, FOLFIRI'nin mitozun önemli bir azalmasına (Mann Whitney Testi, P<0.0001) ve apoptozun önemli bir indüksiyonunu (Mann Whitney testi, P<0.0001), tümör büyüklüğünün% 54 azalmasına neden olduğunu ortaya koydu (P<0.001). Analiz edilen ksinograft sayısı şekilde belirtilir ve her nokta bir xenograft'ı temsil eder. F-H. PVS ve CHT I'deyeşil (insan HLA, ki67 ve hMITO) insan spesifik belirteçleri ile etiketlenmiş enjeksiyon sonrası 4 günde kolorektal kanser ksinograftlarının temsili görüntüleri. J-J'. Lipofilik boyama CellTracker Deep Red (Cy5 - beyaz), CellTracker Green CMFDA (488 - yeşil) ve DAPI karşıtlık ile etiketlenmiş iki farklı insan kolorektal kanser hücre hattı ile enjekte edilen poliklonal ksinograftların konfokal görüntüleri. K-K'. Lipofilik boyama CellTracker Deep Red (Cy5 - beyaz), Vybrant CM DiI (594 - kırmızı) ve DAPI karşıtlık ile etiketlenmiş iki farklı insan kolorektal kanser hücre hattının konfokal görüntüleri. Ölçek çubukları 50 μm'yi temsil eder.

hiç kimse