Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Metastazı Teşvik Etmek İçin İnsan Stroma Kullanan Yumurtalık Kanserinin Ortotopik Bir Fare Modeli

2.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62382

⸱

23 Mart 2021

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Hillman Cancer Center, University of Pittsburgh, 2Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, Magee-Womens’ Hospital, University of Pittsburgh Medical Center

Bu makalede

Özet

İnsan stromal hücreleriyle karıştırılmış yumurtalık kanseri hücrelerinin ortotopik aşılanması, insan yumurtalık kanserinin karakteristiği olan hızlı, yaygın metastatik davranış sergileyen bir fare modeli sağlar. Bu model aynı zamanda tümör hücresi ve stromal hücre etkileşimlerinin yanı sıra tümör ilerlemesi ve metastazındaki rollerinin incelenmesine de izin verir.

Özet

Over kanseri erken, yaygın metastaz ile karakterizedir ve tanı anında metastatik hastalığı olan kadınların% 70'i vardır. Yumurtalık kanserinin zarif transgenik fare modelleri mevcut olsa da, bu fareler pahalıdır ve tümör geliştirmesi uzun zaman alır. İntraperitoneal enjeksiyon ksenogreft modelleri insan stromasından yoksundur ve yumurtalık kanseri metastazını doğru bir şekilde modellemez. Hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) bile insan stromal mikroçevresini tam olarak özetlemez, çünkü seri PDX pasajları önemli insan stroma kaybı gösterir. İnsan yumurtalık kanserini fizyolojik olarak ilgili bir stromal mikro çevre içinde kolayca modelleme yeteneği, karşılanmamış bir ihtiyaçtır. Burada protokol, hasta kaynaklı karsinom ile ilişkili mezenkimal kök hücreler (CA-MSC'ler) ile birlikte insan yumurtalık kanseri hücrelerini kullanan ortotopik bir yumurtalık kanseri fare modeli sunmaktadır. CA-MSC'ler, stromal mikroçevrenin oluşumunu yönlendiren ve yumurtalık kanseri büyümesini ve metastazı destekleyen stromal progenitör hücrelerdir. Bu model erken gelişir ve klinik prezentasyonu taklit ederek metastazı yayar. Bu modelde, lusiferaz eksprese eden yumurtalık kanseri hücreleri, CA-MSC'lerle 1:1 oranında karıştırılır ve NSG farelerinin yumurtalık bursasına enjekte edilir. Biyolüminesans görüntüleme kullanılarak tümör büyümesi ve metastazı zaman içinde seri olarak takip edilir. Ortaya çıkan tümörler agresif bir şekilde büyür ve enjeksiyondan 14 gün sonra abdominal metastaz oluşturur. Fareler, sistemik hastalığın bir belirteci ve artan hastalık yükünün bir göstergesi olarak vücut ağırlığında önemli düşüşler yaşadı. Enjeksiyondan 30. gün sonra, fareler% 100'ünde vücut ağırlığı kaybı ve nekropsi% 60 -% 80 akciğer ve parankimal karaciğer metastazı% 60 - 80 oranında vücut ağırlığı kaybı ve nekropsi doğrulanmış karın içi metastaz >son nokta kriterlerini karşıladı. Toplu olarak, yumurtalık kanseri hücrelerinin ve stroma hücrelerinin ortotopik aşılanması, insan yumurtalık kanserinin erken ve yaygın metastatik davranışını yakından taklit eden tümörler oluşturur. Ayrıca, bu model yumurtalık kanseri hücresinin rolünü incelemek için bir araç sağlar: metastatik ilerlemede stroma hücre etkileşimleri.

Giriş

Yumurtalık kanseri, kadınlarda tüm kanserler arasındaen yüksek ölüm oranına sahip 5. en yüksek ölüm oranına sahip ölümcül bir hastalıktır1. Yumurtalık kanseri olan kadınların çoğu ileri evrede teşhis edilir ve tanı anında hastaların% 70'inde metastatik yayılma mevcuttur. Erken metastazlar ve tanı anında ileri evre gibi faktörler bu hastalıkta görülen yüksek mortalite oranlarına katkıda bulunur. Ayrıca, bu benzersiz hastalık özellikleri, periton boşluğuna hızlı hastalık göçünün çoğaltılması da dahil olmak üzere yumurtalık kanseri fare modellerinin oluşturulması için bir zorluk teşkil etmiştir 2,3,4.

Peritoneal yayılım da dahil olmak üzere yumurtalık kanseri patogenezi, birçok unsuru içeren destekleyici bir tümör mikroçevresinin (TME) oluşumu ile kolaylaştırılır5. Yumurtalık kanseri TME'nin kritik bir bileşeni, karsinom ile ilişkili mezenkimal kök hücredir (CA-MSC). CA-MSC'ler, over kanseri başlangıcını, büyümesini, kemoterapi direncini ve metastazı artıran stromal progenitör hücrelerdir 6,7. CA-MSC'ler ayrıca tümörle ilişkili fibrozu uyararak, anjiyogenezi indükleyerek ve bağışıklık mikroçevresini değiştirerek yumurtalık kanseri TME'nin oluşumunu yönlendirir 6,8,9. CA-MSC'lerin yumurtalık kanseri TME içindeki güçlü işlevleri göz önüne alındığında, insan yumurtalık kanserinin fizyolojik olarak ilgili bir stromal mikroçevre içinde modellenmesi, yumurtalık kanseri ilerlemesi ve metastazı çalışmasında kritik öneme sahiptir.

Son zamanlarda, transgenik fare modelleri, spontan yumurtalık kanseri metastazlarının çalışmasında cazibe kazanmıştır. Bununla birlikte, transgenik fareler maliyetlidir ve metastatik hastalık gelişimi için uzun bir zaman seyri sergiler. İntraperitoneal model ve hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) gibi diğer mevcut fare modelleri nispeten kısa metastatik zaman aralıklarına sahipken, ilgili bir stromal mikroçevrenin olmaması nedeniyle yumurtalık kanseri metastazlarını tam olarak özetlemezler 10,11,12. Bu zorluğun üstesinden gelmek amacıyla, bu çalışma, hastadan türetilen CA-MSC'lerle birlikte insan yumurtalık kanseri hücrelerini kullanan ortotopik bir yumurtalık kanseri fare modeli sunmaktadır. Burada tarif edilen modelde, CA-MSC'lerin yumurtalık kanseri hücreleri ile birleştirilmesi, enjeksiyondan sonraki 30 gün içinde farelerin% 100'ünde karın içi metastaz varlığı ile gösterildiği gibi, erken ve yaygın metastazlı tümörler oluşturur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hasta örnekleri, Pittsburgh Üniversitesi IRB (PRO17080326) tarafından onaylanan protokollere uygun olarak elde edildi. Hayvan deney yöntemleri, Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokol kapsamında gerçekleştirilmiştir.

1. Hasta kaynaklı karsinom ile ilişkili mezenkimal kök hücrelerin (CA-MSC'ler) izolasyonu ve validasyonu

NOT: CA-MSC'ler, fallop tüpü, yumurtalık ve / veya omental metastatik birikintiler dahil olmak üzere cerrahi olarak rezeke edilen insan yumurtalık kanseri dokusundan (bu çalışmada yüksek dereceli seröz karsinom kullanılmaktadır) türetilmiştir. CA-MSC besiyeri, %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS, 1x B27, 20 ng/mL EGF, 1 ng/mL hidrokortizon, 5 μg/mL insülin, 100 μM β-merkaptoetanol, 10 ng/mL β-FGF, %1 penisilin/streptomisin ve 20 μg/mL gentamisin ile takviye edilmiş MEBM'den (meme epitel hücreli bazal ortam) hazırlanır 7,13.

  1. CA-MSC izolasyonu
    1. Steril bir neşter ve forseps kullanarak, doku örneğini yaklaşık 1 mm3 boyutunda parçalara bölün. 6 oyuklu bir hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna üç parça doku yerleştirin.
      NOT: 0.2 g tümör dokusu 12 parçaya bölünebilir ve 6 oyuklu bir hücre kültürü plakasının dört oyuğuna dağıtılabilir.
    2. Her kuyucuk için yaklaşık 1 mL olmak üzere ince bir CA-MSC ortamı tabakası ekleyin. Hücre kültürü plakasını %5 CO2 içinde 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
    3. 24 saat sonra, doku parçalarını rahatsız etmeden ortamı dikkatlice çıkarın. Her kuyucuğa yaklaşık 1 mL taze ortam ekleyin. Doku eklerini bozmadan ortamı yavaşça pipetleyin. Hücre kültürü plakasını %5 CO2'de 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre geri yerleştirin.
      NOT: Dokuyu her gün ters çevrilmiş bir mikroskopla inceleyin ve kültür ortamında ölü hücreler görüntülendiğinde ortamı adım 1.1.3'te açıklandığı gibi değiştirin.
    4. 7 gün sonra, steril forseps kullanarak dokuyu alarak doku parçalarını çıkarın ve yapışık hücreleri bir kez PBS ile yıkayın (Ca2 + / Mg2 + olmayan PBS, kuyu başına 1 mL). Daha sonra, taze CA-MSC ortamı (oyuk başına 2 mL) ekleyin ve hücre kültürü plakasını %5 CO2 içinde 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
  2. CA-MSC'lerin Genişletilmesi
    1. CA-MSC'ler 6 oyuklu plaka içindeki dokudan büyümeye başladığında, hücresel büyümeyi sağlamak için hücreleri her gün ters çevrilmiş bir mikroskopla inceleyin. Hücreler %90 birleşime ulaştığında, aşağıdaki adımlarla devam edin.
    2. Ortamı hücre kültürü plakasından aspire edin, ardından hücreleri bir kez oyuk başına 1-2 mL PBS ile yıkayın (Ca2 + / Mg2 + olmadan PBS).
    3. % 0.05 tripsin /% 0.02 EDTA çözeltisi (tripsin / EDTA) kuyusu başına 300 μL ekleyin. Hücreleri tripsin / EDTA ile kaplamak için hücre kültürü plakasını döndürün ve hücre kültürü plakasını 2-3 dakika veya hücreler ayrılana kadar inkübatöre geri koyun.
    4. Tripsini (oyuk başına 1 mL) etkisiz hale getirmek için taze CA-MSC ortamı ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri büyüme ortamı ile yeniden askıya alın. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri, toplam hacmi 5 mL kültür ortamı olan 25 cm'lik 2'lik bir şişeye aktarın.
      NOT: 6 oyuklu hücre kültürü plakasının üç oyuğundan toplanan hücreler, 25cm2'lik bir şişeye aktarılabilir. Hücreler, cerrahi olarak rezeke edilen insan dokusundan türetildikleri için mikoplazma varlığı açısından test edilmelidir (PCR gibi yerleşik bir mikoplazma tespit protokolünü izleyerek)14,15.
    5. Hücreler %70-80 birleşime ulaştığında, daha önce açıklanan 1.2.2-1.2.4 adımlarını izleyerek hücreleri 25cm2'lik bir şişeden 75cm2'lik bir şişeye aktarın. CA-MSC doğrulaması ve ortotopik aşılama prosedürü için gereken hücre sayısını elde etmek için hücreleri her 5-7 günde bir genişletin.
      NOT: CA-MSC'ler hastadan türetilen hücreler olduğundan, hücresel ikiye katlanma süresi hücre hatları arasında farklılık gösterir. Çoğu CA-MSC'nin sayısının iki katına çıkması için 3-4 gün gerekir. Bununla birlikte, bazı CA-MSC'lerin sayısının iki katına çıkması için 5-7 gün gerekir. CA-MSC'ler 8-10 kez geçilebilir. Geçiş 10'dan sonra, CA-MSC'ler yaşlanabilir veya farklılaşabilir.
  3. CA-MSC doğrulaması
    1. CA-MSC yüzey ekspresyonunun doğrulanması: CA-MSC'lerin daha önce açıklandığı gibi Uluslararası Hücresel Tedavi Derneği kılavuzları tarafından tanımlanan uygun yüzey belirteçlerini ifade etmesini sağlamak için akış sitometrik analizi için 0,5 x 106 CA-MSC (75 cm2'lik bir şişede yaklaşık %70 birleşme) kullanın (CD73/CD90/CD105 pozitif; CD45/CD34/CD14 veya CD11b/CD79a veya CD19/HLA-DR negatif)7,16. Tripsinizasyondan sonra hücre sayısını onaylayın ve ölü hücrelerin tripan mavisi dışladığı bir hemositometre kullanarak sayın.
      NOT: Akış sitometrisi analizi hücrelerin %<90 saf olduğunu gösteriyorsa, hücreleri CA-MSC popülasyonu için sıralayın.
    2. CA-MSC farklılaşmasının doğrulanması: Soy farklılaşmasını doğrulamak için, CA-MSC'leri 2 mL MSC ortamında (farklılaşma koşulu başına bir kuyucuk) 5 x 104 hücre/kuyu hücre yoğunluğunda 6 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna tohumlayın. 24 saat sonra, daha önce tarif edildiği gibi adiposit vs kondrosit vs osteosit farklılaşmasını indüklemek için medyayı uygun farklılaşma ortamına değiştirin 7,16.
      NOT: ISCT yönergelerine göre, MSC'ler en az iki hatta (adiposit, kondrosit veya osteosit) in vitro farklılaşma göstermelidir.
  4. Planlanan fare enjeksiyon prosedürünün olduğu gün, 1.2.2 ve 1.2.4 adımlarını izleyerek hücreleri toplayın. Daha sonra, canlılık için tripan mavisi dışlamalı bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve hücreleri CA-MSC ortamında 1 x 108 hücre / mL (enjeksiyon başına 0.5 x 106 CA-MSC) yoğunlukta yeniden süspanse edin. Asılı hücreleri buzun üzerine yerleştirin.
    NOT: Genel olarak, bir tümör örneğinden (0.2 g doku) en az 1 x 107 CA-MSC türetilebilir. Bu, çoğu fare deneyi için tek bir hastadan türetilen CA-MSC hattının kullanılmasına izin verir. Farklı hastalardan alınan CA-MSC'leri birleştirmek mümkündür, ancak bunların aynı over kanseri histolojik alt tipinden türetilmesini öneririz. Çoğu CA-MSC hattının 1 x 107 hücreye ulaşması 2 ay ve/veya 6-7 geçiş sürer. CA-MSC'ler, standart hücre dondurma ortamı kullanılarak dondurulabilir ve daha sonra kullanılmak üzere süresiz olarak sıvı nitrojen içinde saklanabilir.

2. Yumurtalık kanseri hücrelerinin hazırlanması

  1. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin (penisilin: 100 birim / mL, streptomisin: 0.1 mg / mL) ile DMEM ortamında OVCAR3-Luc hücrelerini koruyun. % 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de kültür hücreleri.
  2. Enjeksiyon gününde, aşağıdaki adımları kullanarak OVCAR3-Luc hücrelerini toplayın.
    1. İlk olarak, ortamı hücre kültürü şişesinden aspire edin ve hücreleri 75cm2 şişe başına 5-7 mL PBS ile bir kez yıkayın (Ca2 + / Mg2 + olmadan PBS). PBS'yi aspire edin ve tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin (75 cm2 şişe başına 2 mL). Daha sonra, hücre kültürü şişesini 3-5 dakika veya hücreler ayrılana kadar inkübatöre geri koyun.
    2. Mikroskopi kullanarak, hücrelerin tam tripsinizasyonunu sağlayın (tüm hücrelerin kültür şişesinden ayrıldığından emin olun). Tripsintasyonu durdurmak için, şişeye taze serum içeren DMEM ekleyin (75 cm2 şişesi başına 2-3 mL) ve hücreleri yeniden süspanse edin. Bir pipet kullanarak hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
    3. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri büyüme ortamı ile yeniden askıya alın. Daha sonra, hücreleri sayın ve 1 x 108 hücre / mL (enjeksiyon başına 0.5 x 106 OVCAR3-Luc hücresi) yoğunlukta büyüme ortamında yeniden askıya alın. Asılı hücreleri buzun üzerine yerleştirin.

3. Ortotopik aşılama

  1. Hücre süspansiyonunun hazırlanması
    1. CA-MSC'leri ve OVCAR-Luc hücrelerini 1:1 oranında karıştırın.
    2. Donmuş bazal membran matrisini bir buz banyosunda çözün. Daha sonra, adım 3.1.1'de hazırlanan hücre süspansiyonunu 1:1 oranında bazal membran matrisine ekleyin (nihai hücre konsantrasyonu: 1 x 106/ 20 μL orta-bazal membran matrisi) ve iyice karıştırın. Hazırlanan hücre süspansiyonları kullanıma kadar buz banyosunda tutulmalıdır.
      NOT: Burada açıklanan, söz konusu modelle ilgili önceki deneyime dayalı olarak 1:1 CA-MSC / OVCAR-Luc oranıdır. Önceki çalışmalar, CA-MSC'lerin doğrudan hasta dokusundan ölçüldüğünde genellikle tümör hücrelerine 1: 10 oranında olduğunu göstermektedir. Aşağıda tartışıldığı gibi, 1: 1 CA-MSC / tümör hücresi oranı ile başlamak, bu modeli kullanarak deneysel son noktalarda hem birincil hem de metastatik bölgelerde tümör hücrelerine yaklaşık 1: 10 CA-MSC oranı verir.
  2. Ameliyat
    NOT: Ameliyat steril koşullarda yapılmalı ve steril cerrahi aletler kullanılmalıdır. Bu ortotopik model için 8 haftalık dişi NSG farelerinin kullanılması önerilir.
    1. İzofluran (indüksiyon için %4, bakım için %2) ve oksijen (%100, akış ölçer 0,5-1 L/dak) ile inhalasyon kullanarak fareyi uyuşturun. Fareyi ameliyat öncesi burun konisi sisteminin üzerine yerleştirin. Ameliyat boyunca anestezi sağlamak için (aşağıdaki ayrıntılı talimatlara bakın), farenin kafasını izofluran buharlaştırıcı burun konisi sistemine yerleştirin.
    2. Fareye deri altına bir insülin şırıngası ile cerrahi öncesi bir analjezik olan 5 mg / kg carprofen enjekte edin.
    3. Makas kullanarak, farenin sol kaudal kısmını kostal kenar boşluğu ile femur arasında tıraş edin. Traş edilen alanı povidon-iyot çözeltisi ve alkollü bezlerle sterilize edin. Ardından, fareyi cerrahi burun konisi sistemine aktarın ve idame anestezisi için izofluranı %1,5'e ayarlayın.
    4. Kostal kenarın yaklaşık 2-3 cm altında 1-2 cm'lik yatay bir cilt kesisi yapın. Parietal peritonu forseps ile kavrayın ve yükseltin (periton parlak görünecek ve yağ dokusu birikintileri ile karakterize edilecektir). Karın boşluğunu açmak için parietal peritonda 1 cm'lik bir kesi yapın.
    5. Periton girişinde fare yumurtalığını (yumurtalık bursası) çevreleyen yağ dokusunun toplanmasını gözlemleyin. Yumurtalık bursasını kavramak ve ortaya çıkarmak için kavisli forseps kullanın. Yumurtalığı forseps ile sıkıca kavrarken, adım 3.1.2'de hazırlanan hücre süspansiyonunun 20 μL'sini bursaya enjekte edin.
    6. Yumurtalığı dikkatlice karın boşluğuna geri koyun. Bir iğneye bağlı emilebilir bir poliglikolik asit 6-0 sütür kullanarak, parietal peritoneal insizyonun kenarlarını yeniden yaklaştırın. Cilt kesisini yara klipsleri ile kapatın.
    7. Fareyi burun konisinden çıkarın ve fareyi, bilincini kazanana ve sternal yaslanmayı koruyana kadar ısınan ışık altında ayrı bir temiz kafese yerleştirin. Ardından, fareyi kafesine geri koyun.
    8. Ameliyattan sonra 3-7 gün boyunca fareleri günlük olarak izleyin. Ağrı kontrolü için fare kafeslerine bir bardak carprofen jel yerleştirin. Ameliyattan 7-10 gün sonra yara klipslerini çıkarın.

4. Tümör büyümesinin ve fare vücut ağırlığının haftalık olarak izlenmesi

  1. İn Vivo Görüntüleme Sistemi (IVIS): Ortotopik aşılamadan sonraki birinci haftadan başlayarak, sonraki 3-4 hafta boyunca her hafta in vivo görüntüleme yapın.
    1. 15 mg'ı 1 mL PBS'de çözerek ve sterilizasyon için 0.22 μm'lik bir zardan süzerek D-lusiferin (ateşböceği lusiferaz substratı) çözeltisini hazırlayın.
    2. IVIS'i üreticinin talimatlarına göre çalıştırın. Living Image Software masaüstü simgesine tıklayın. Ardından, IVIS Edinme Kontrol Paneli'nde Başlat'ı seçin. Bu adım 10-15 dakika kadar sürebilir. Bu süre zarfında, fareleri görüntüleme için hazırlayın.
    3. IVIS'e bağlı izofluran odasını kullanarak her fareyi uyuşturun (% 2 -% 4 izofluran ve oksijen akış ölçer 0.5-1 L / dk'ya kadar). D-lusiferini (100 μL / 10 g vücut ağırlığı) bir insülin şırıngası kullanarak intraperitoneal enjeksiyon yoluyla enjekte edin.
    4. Luciferin enjekte edilen hayvanı izofluran odasına geri yerleştirin.
      NOT: Çalışma boyunca lusiferin enjeksiyonu ile görüntüleme performansı arasındaki süreyi tutarlı tutmak için enjeksiyon süresinin kaydedilmesi önemlidir.
    5. Anestezi uygulanmış fareyi görüntüleme odasına aktarın ve görüntüleme sistemini uygun ayarlara getirin. Ardından, görüntüyü uygun zamanda alın.
    6. Görüntüleri kaydettikten sonra, fareleri görüntüleme odasından çıkarın ve ilgili kafeslerine geri yerleştirin.
      NOT: CA-MSC'ler ayrıca bir floresan etiketi ile etiketlenebilir ve CA-MSC'lerin ve OVCAR3-Luc hücrelerinin migrasyonu/ko-metastazı IVIS üzerinde bir floresan kanalı kullanılarak in vivo olarak izlenebilir.

5. CA-MSC'nin değerlendirilmesi: tümör hücresi metastatik birikintileri

  1. Önceden tanımlanmış son noktalarına ulaştıklarında (asit varlığında kilo alımı %>20), kilo kaybı <%10, tümör ülseri, vücut kondisyon skoru2 veya daha az 17), fareleri kurumsal hayvan refahı standartlarına uygun olarak ötenazi yapın.
  2. Her fare üzerinde ayrı ayrı nekropsi yapın. Herhangi bir asit aspire etmek için intraperitoneal olarak 18 G'lik steril bir iğne yerleştirin. Sonra, torasik ve karın boşluğunu ortaya çıkarın. Murin organlarının tümör tutulumunun görsel muayenesi yoluyla brüt metastatik hastalığı ölçün18.
  3. Steril bir neşter kullanarak tümör dokusunu çıkarın ve i) nihai parafin gömme için paraformaldehit içinde sabitleyin, ii) flaş dondurma ve OTC kriyostat gömme ortamına gömün, iii) aşağı akış DNA, RNA veya protein analizi için flaş dondurma veya iv) akış sitometrisi veya FACS izolasyonu için tek hücrelere ayrışın.
    NOT: CA-MSC'ler bu modelde uygulanabilir durumda kalır ve aşağı akış uygulamaları için yeniden izole edilebilir. Çalışmanın amacına bağlı olarak, CA-MSC'nin tümör hücresi etkileşimleri, immünohistokimyasal yaklaşımlar, akış sitometrik yaklaşımlar veya kültürde yeniden izole hücrelerin korunması yoluyla araştırılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tarif edilen yaklaşım, hastadan türetilen mezenkimal kök hücrelerin (CA-MSC'ler) ve yumurtalık kanseri hücrelerinin yumurtalık bursasına birlikte enjeksiyonu ile yumurtalık kanserinin (özellikle yüksek dereceli seröz karsinom) destekleyici mikro çevresini yakından taklit eder. İlk olarak, CA-MSC'ler, omentumu içeren primer, cerrahi olarak rezeke edilen insan yüksek dereceli seröz yumurtalık kanserinden izole edildi (bu deneyde kullanılan tüm CA-MSC'ler aynı hastadan türetilmiştir). Doku örneklerinin kaplanmasından 2 haft...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Önemli klinik ve araştırma çabalarına rağmen, yumurtalık kanserinin tedavisinde ve önlenmesinde çok az ilerleme kaydedilmiştir1. Yumurtalık kanseri ilerlemesini ve metastazlarını incelemek için çeşitli fare modelleri kullanılmış olsa da, bu modeller önemli sınırlamalarla karşı karşıya kalmıştır. Özellikle, önceki fare modelleri, erken, yaygın karın içi metastazlarınayırt edici özelliği de dahil olmak üzere, yumurtalık kanseri ilerlemesinin ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Doku toplama konusundaki yardımları için Jinekolojik Onkoloji Biyonumune Programı-Promark'a teşekkür ederiz. LGC, Tina's Wish Rising Star Grant ve Mary Kay Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.05 tripsin /% 0.02 EDTASigmaSLCD2568
Anti-insan CD105BD Pharmingen560847
Anti-insan CD73BD Pharmingen555596
Anti-insan CD90BD Pharmingen561443
B27Gibco17504-044
β-FGFGibcoPHG0261
β-merkaptoetanolMP Biyomedikaller194834
CarprofenHenry Schein11695-6934-1
D-lusiferinPerkinElmer122799
DMEDGibco11995-065
EGFGibcoPHG0311
GentamisinGibco15710072
İnsülinGibco16000069
İnsülinGibco12585014
İnsülin şırıngasıBD Pharmingen324704
İn vivo görüntüleme sistemi IVISPerkinElmerIVIS Lumina X5
MatrigelCorning354230
MEBM (meme epitel hücresi bazal ortamı)ATCCPCS-600-030
Mikoplazma test kitiABmG238
NSG fareleriJackson Laboratuvarı5557
OVCAR3ATCCHTB-161
Penisilin / streptomisinGibco15070063
Poliglikolik Asit sütürACE003-2480

Kaynaklar

  1. American Cancer Society. K. S. f. O. C. American Cancer Society. , (2020).
  2. Konecny, G. E., et al. Prognostic and therapeutic relevance of molecular subtypes in high-grade serous ovarian cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (10), (2014).
  3. Verhaak, R. G., et al. Prognostically relevant gene signatures of high-grade serous ovarian carcinoma. The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 517-525 (2013).
  4. Tothill, R. W., et al. Novel molecular subtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinical outcome. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 14 (16), 5198-5208 (2008).
  5. Ghoneum, A., Afify, H., Salih, Z., Kelly, M., Said, N. Role of tumor microenvironment in ovarian cancer pathobiology. Oncotarget. 9 (32), 22832-22849 (2018).
  6. Coffman, L. G., et al. Human carcinoma-associated mesenchymal stem cells promote ovarian cancer chemotherapy resistance via a BMP4/HH signaling loop. Oncotarget. 7 (6), 6916-6932 (2016).
  7. Coffman, L. G., et al. Ovarian carcinoma-associated mesenchymal stem cells arise from tissue-specific normal stroma. Stem Cells. 37 (2), 257-269 (2019).
  8. Spaeth, E. L., et al. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS One. 4 (4), 4992(2009).
  9. Atiya, H., Frisbie, L., Pressimone, C., Coffman, L. Mesenchymal stem cells in the tumor microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1234, 31-42 (2020).
  10. Magnotti, E., Marasco, W. A. The latest animal models of ovarian cancer for novel drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (3), 249-257 (2018).
  11. Connolly, D. C., Hensley, H. H. Xenograft and transgenic mouse models of epithelial ovarian cancer and non-invasive imaging modalities to monitor ovarian tumor growth in situ: applications in evaluating novel therapeutic agents. Current Protocols in Pharmacology. 45 (1), 1-26 (2009).
  12. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. The Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
  13. McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma-associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. The Journal of Clinical Investigation. 121 (8), 3206-3219 (2011).
  14. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (2), 79-85 (2002).
  15. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
  16. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  17. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  18. Fan, H., et al. Epigenomic reprogramming toward mesenchymal-epithelial transition in ovarian-cancer-associated mesenchymal stem cells drives metastasis. Cell Reports. 33 (10), 108473(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Metastatik lerlemeKarsinoma li kili Mezenkimal K k H crelerStromal Mikro evreHasta T revli KsenogreftBiyol minesans G r nt lemeT m r MetastazNSG Fareler

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.