Bu protokol, D 2O metabolizmasının tek hücreli uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi ile 2.5 saat içinde hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) testi sunar. Bu yöntem, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücü olan idrar veya tam kan ortamındaki bakteriler için geçerlidir.
Antimikrobiyal dirençli enfeksiyonların yayılmasını yavaşlatmak ve önlemek için, patojenler üzerindeki antimikrobiyal etkileri nicel olarak belirlemek için hızlı antimikrobiyal duyarlılık testine (AST) acil ihtiyaç duyulmaktadır. AST’nin uzun süreli kültüre dayanan geleneksel yöntemlerle tamamlanması genellikle günler alır ve doğrudan klinik örnekler için çalışmazlar. Burada, döteryum oksit (D2O) metabolik katılımının uyarılmış Raman saçılması (SRS) görüntülemesi ile sağlanan hızlı bir AST yöntemi sunulmuştur. D2O’nun biyokütleye metabolik katılımı ve tek bakteri düzeyinde antibiyotiklere maruz kalındığında metabolik aktivite inhibisyonu SRS görüntüleme ile izlenir. Antibiyotiklere maruz kaldıktan sonra bakterilerin tek hücreli metabolizma inaktivasyon konsantrasyonu (SC-MIC), toplam 2.5 saatlik numune hazırlama ve tespitinden sonra elde edilebilir. Ayrıca, bu hızlı AST yöntemi, idrar veya tam kan gibi karmaşık biyolojik ortamlardaki bakteri örneklerine doğrudan uygulanabilir. Döteryum katılımının SRS metabolik görüntülemesi, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücüdür.
Antimikrobiyal direnç (AMR), bulaşıcı hastalığın etkili tedavisi için büyüyen küresel bir tehdittir1. AMR’nin, antibiyotiğe dirençli bakterilerle mücadele için herhangi bir eylemde bulunulmaması durumunda 2050 yılına kadar yılda 10 milyon ölüme ve 100 trilyon dolarlık küresel GSYİH kaybına neden olacağı tahmin edilmektedir 1,2. Bu, antibiyotiğe dirençli bakterilerin ortaya çıkışını yavaşlatmak ve ilgili ölüm oranını azaltmak için enfeksiyöz bakterilerin antibiyotik duyarlılık testi (AST) için hızlı ve yenilikçi tanı yöntemlerine olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır3. Mümkün olan en iyi klinik sonucu sağlamak için, 24 saat içinde etkili tedavinin uygulanması çok önemlidir. Bununla birlikte, disk difüzyonu veya et suyu seyreltme yöntemi gibi mevcut altın standart yöntem, klinik numuneler için ön inkübasyon prosedürü için genellikle en az 24 saat ve minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) sonuçlarını elde etmek için ek 16-24 saat gerektirir. Genel olarak, bu yöntemler klinikte bulaşıcı hastalık tedavisi için acil bir karara rehberlik etmek için çok zaman alıcıdır ve bu da antimikrobiyal direncin ortaya çıkmasına ve yayılmasına yol açar4.
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı teknikler5 gibi genotipik AST yöntemleri, hızlı tespit için geliştirilmiştir. Bu tür teknikler, hızlı AST sonuçları sağlamak için spesifik direnç genetik dizilerini ölçer. Zaman alıcı hücre kültürüne güvenmezler; Bununla birlikte, sadece direnci olan bilinen spesifik genetik diziler test edilir. Bu nedenle, uygulaması çeşitli bakteri türleri veya farklı direnç mekanizmaları ile sınırlıdır. Ayrıca, tedavi kararları için MIC sonuçları veremezler 6,7. Ayrıca, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için yeni fenotipik yöntemler geliştirilmektedir8, mikroakışkan cihazlar 9,10,11,12,13, optik cihazlar14,15,16, nükleik asitlerin kopya numarası 17,18’i ölçen fenotipik AST ve Raman spektroskopik yöntemler 19, 20,21,22,23,24. Bu yöntemler AST sonuçlarını yönlendirmek için gereken süreyi kısaltır, ancak çoğu doğrudan klinik numunelere değil, yalnızca bakteriyel izolatlara uygulanabilir ve yine de uzun süreli ön inkübasyon gerektirir.
Bu çalışmada, SRS görüntüleme ile hücresel metabolik aktivitenin izlenmesi yoluyla idrar ve tam kandaki bakterilerin duyarlılığının hızlı bir şekilde belirlenmesi için bir yöntem sunuyoruz. Su (H2O), canlı hücrelerdeki temel biyomoleküler sentez süreçlerinin büyük çoğunluğunda yer alır. Bir su izotopologu olarak, NADPH’deki redoks-aktif hidrojen atomu ile D2O’daki D atomu arasındaki enzim katalizörlü H / D değişim reaksiyonu yoluyla, döteryum bir hücre25,26 içindeki biyokütleye dahil edilebilir. Deuterated yağ asidi sentez reaksiyonu, NADPH etiketli döteryum tarafından aracılık edilir. D2O’nun amino asitlerin (AA’lar) reaksiyonlarına dahil edilmesi, deuterated protein üretimi26 ile sonuçlanır (Şekil 1). Bu şekilde, tek mikrobiyal hücrelerde yeni sentezlenen C-D bağı içeren biyomoleküller, tespit edilecek genel bir metabolik aktivite belirteci olarak kullanılabilir. De novo sentezlenmiş C-D bağlarını okumak için, biyomoleküllerin spesifik ve kantitatif kimyasal bilgilerini sağlayan çok yönlü bir analitik araç olan Raman spektroskopisi, antimikrobiyal duyarlılığı belirlemek ve test süresini birkaç saate düşürmek için yaygın olarak kullanılmaktadır27,28,29,30 . Bununla birlikte, Raman saçılma işleminin doğal düşük verimliliği nedeniyle, spontan Raman spektroskopisi düşük algılama hassasiyetine sahiptir. Bu nedenle, spontan Raman spektroskopisi kullanarak gerçek zamanlı görüntü sonuçları elde etmek zordur. Tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve uyarılmış Raman saçılması (SRS) dahil olmak üzere tutarlı Raman saçılması (CRS), spontan Raman spektroskopisininkinden daha büyük büyüklük sıraları üretmek için tutarlı ışık alanı nedeniyle yüksek algılama hassasiyetine ulaşmıştır, böylece tek hücre seviyesinde yüksek hızlı, spesifik ve kantitatif kimyasal görüntüleme 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.
Burada, en son çalışmamız40’a dayanarak, bakterilerin normal ortamda, idrarda ve tam kan ortamında tek hücre düzeyinde dahil edilmesinin femtosaniye SRS C-D görüntülemesi ilemetabolik aktivitenin ve antimikrobiyal duyarlılığın hızlı bir şekilde belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Femtosaniye SRS görüntüleme, 2.5 saat içinde tek bakteri seviyesinde antibiyotiklere karşı tek hücre metabolizması inaktivasyon konsantrasyonunun (SC-MIC) izlenmesini kolaylaştırır. SC-MIC sonuçları, et suyu mikrodilüsyonu yoluyla standart MIC testi ile doğrulanır. Yöntemimiz, bakteri üriner sistem enfeksiyonu (İYE) ve kan dolaşımı enfeksiyonu (BSI) patojenlerinin antimikrobiyal duyarlılığını, geleneksel yönteme göre çok daha kısa bir tahlil süresi ile belirlemek için uygulanabilir olup, klinikte tek hücre düzeyinde hızlı fenotipik AST için fırsat yaratmaktadır.
Hızlı AST, tek hücreli SRS metabolik görüntüleme kullanılarak antibiyotik tedavisine bakteriyel metabolik aktivitenin yanıtının numuneden SC-MIC sonuçlarına 2,5 saat içinde değerlendirilmesiyle elde edilebilir. Bakteriyel metabolik aktivitenin ve antimikrobiyal duyarlılığın yanıtı, C-D bağlarının SRS görüntülemesi kullanılarak biyomolekül sentezi için D2O’nun metabolik katılımının izlenmesiyle tespit edilebilir. Su, canlı hücrelerde her yerde kullanıldığından, SRS metabol…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma J.-X.C ve M.S.’ye NIH R01AI141439 ve J.-X.C.’ye R35GM136223 tarafından desteklenmiştir.
Acousto-optic modulation | Gooch&Housego | R15180-1.06-LTD | Modulating stokes laser beam |
Amoxicillin | Sigma Aldrich | A8523-5G | |
Bandpass filter | Chroma | HQ825/150m | Block the stokes laser beam before the photodiode |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016-100G | Cation adjustment |
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth | Fisher Scientific | B12322 | Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75002542 | |
Cover Glasses | VWR | 16004-318 | |
Culture tube with snap cap | Fisher brand | 149569B | |
Daptomycin | Acros | A0386346 | |
Deuterium oxide | 151882 | Organic solvent to dissolve antibiotics | |
Deuterium oxide-d6 | Sigma Aldrich | 156914 | Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system |
Escherichia coli BW 25113 | The Coli Genetic Stock Center | 7636 | |
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher brand | 05-408-129 | |
Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G4918 | |
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters | Millipore-Sigma | SLSV025NB | pore size 5 µm |
ImageJ software | NIH | Version: 2.0.0-rc-69/1.52t | Image processing and analysis |
Incubating orbital shaker set at 37 °C | VWR | 97009-890 | |
Inoculation loop | Sigma | BR452201-1000EA | |
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | Model: insight X3 | Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging |
Lock-in amplifier | Zurich Instrument | HF2LI | Demodulate the SRS signals |
Oil condenser | Olympus | U-AAC | NA 1.4 |
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) | American Type Culture Collection | ATCC 47085 | |
Photodiode | Hamamatsu | S3994-01 | Detector |
Polypropylene conical tube 15 mL | Falcon | 14-959-53A | |
Polypropylene filters | Thermo Scientific | 726-2520 | pore size 0.2 µm |
Sterile petri dishes | Corning | 07-202-031 | |
Syringe 10 mL | Fisher brand | 14955459 | |
UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU 530 | Measuring optical density at wavelength of 600 nm |
Vortex mixer | VWR | 97043-562 | |
Water objective | Olympus | UPLANAPO/IR | 60×, NA 1.2 |