pH'a duyarlı floresan probların işaretlediği eksosit olayları tespit etmek için otomatik bilgisayar görme yazılımı geliştirdik. Burada, füzyon olaylarını tespit etmek, füzyonun mekansal parametrelerini analiz etmek ve görüntülemek ve olayları farklı füzyon modlarında sınıflandırmak için grafiksel bir kullanıcı arayüzü ve RStudio'nun kullanımını gösteriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Eksositozun Otomatik Tespiti ve Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Vezikül SNARE proteinlerine bağlı pH'a duyarlı GFP (pHluorin) timelapse TIRF mikroskopisi, hücre kültüründe tek vezikül ekzosit olaylarını görselleştirmek için etkili bir yöntemdir. Bu tür olayların tarafsız, verimli bir şekilde tanımlanması ve analizini yapmak için MATLAB'da bilgisayar görüşüne dayalı bir yaklaşım geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Analiz ardışık düzeni bir hücre segmentasyonu ve eksosit olay tanımlama algoritması oluşur. Bilgisayarla görme yaklaşımı, floresan çürümesinin yarı ömrü ve ΔF/F zirvesi de dahil olmak üzere tek olayların birden fazla parametresini araştırmak için araçlar ve eksositoz sıklığının tam hücre analizi içerir. Bu ve diğer füzyon parametreleri, farklı füzyon modlarını ayırt etmek için bir sınıflandırma yaklaşımında kullanılır. Burada yeni oluşturulan bir GUI, analiz işlem hattını baştan sona gerçekleştirir. Ripley'in R Studio'daki K işlevinin daha fazla uyarlaması, hem uzay hem de zamandaki füzyon olaylarının kümelenmiş, dağılmış veya rastgele oluşumunu ayırt etmek için kullanılır.
Giriş
VAMP-pHluorin yapıları veya transferrin reseptörü (TfR)-pHuji yapıları, bu pH'a duyarlı floroforlar veziklin ve plazma zarı arasındaki füzyon gözenek açıklığı üzerine hemen asit veziklin lümeni ve floresan içinde söndürüldüğünden, ekzosit olayların mükemmel belirteçleridir1. Füzyon gözenek açıklığını takiben, floresan katlanarak bozunur ve füzyon olayı hakkında bilgi veren bazı heterojenlikler ortaya çıkardı. Burada, eksosit olayları otomatik olarak algılayan ve analiz eden bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) uygulaması açıklanmıştır. Bu uygulama, kullanıcının pH hassas işaretleyiciler2 tarafından ortaya çıkan ekzositik olayları otomatik olarak algılamasına ve sınıflandırma amacıyla kullanılabilecek her olaydan özellikler oluşturmasına izin verir3 (Şekil 1A). Ek olarak, Ripley'in K işlevi kullanılarak ekzosit olay kümeleme analizi açıklanmıştır.
Ekzosit olayların farklı ekzosit modlarına otomatik sınıflandırılması yakın zamanda bildirilmiştir3. İki eksositoz modu, tam vezikül füzyonu (FVF) ve öpücük ve çalıştırma füzyonu (KNR) eksositozu daha öncetanımlanmıştır 4,5,6,7. FVF sırasında füzyon gözenekleri genişler ve vesicle plazma zarına dahil edilir. KNR sırasında, füzyon gözenekleri geçici olarak açılır ve daha sonra 4 ,5,8,9,10'u yeniden kaydırır. Gelişen nöronlarda ikisi FVF, ikisi KNR ile ilgili olmak üzere dört eksositoz modu saptandı. Bu çalışma, hem FVF hem de KNR'nin füzyon gözenek açıklığı veya floresan çürümesi başlamadan önce füzyon gözenek açılmasından sonra gecikme gösteren eksosit olaylardan sonra floresan çürümesine (FVFi ve KNRi) hemen ilerleyen füzyon olaylarına daha da bölünebileceğini göstermektedir (FVFd ve KNRd) (Şekil 1B). Sınıflandırıcı, her füzyon olayı için eksositoz modunu tanımlar. Burada bu analiz, Windows ve Mac tabanlı işletim sistemlerinde MATLAB'a yüklenebilen bir GUI'ye dahil edilmiştir. Tüm analiz dosyaları https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing veya
https://github.com/GuptonLab.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Veri kümelerini ve dizini seçin
- Analiz için veri kümelerini seçmek üzere Veri Kümelerini Bul düğmesini (Şekil 2A, kırmızı kutu 1) tıklatarak verilerin yatırıldığı klasöre (örneğin RawData klasörü) gidin. Veri Dosyaları, Veri Dosyalarını liste olarak otomatik olarak doldurur. Klasörde birden fazla veri kümesi olabilir.
- Dizin Seç düğmesini tıklatın ve analiz edilen dosyaların yatırılacağı dizini (örneğin, Test) seçin (Şekil 2A, kırmızı kutu 2) . Çözümleme düğmesine basıldığında, bu dizinde bir dizi klasör ve bitmiş çözümleme dosyasının yanı sıra ara geçici görüntüler oluşturulur. Bir dizin seçilmezse hatalar üretilir.
2. Piksel boyutunu ve kare hızını ayarlama
- Görüntülerin uygun kare hızını ve piksel boyutunu uygun "Kare Hızı" veya "piksel boyutu" kutusunda(Şekil 2A, yeşil kutu)doldurun. Hiçbir değer sağlanmazsa (varsayılan "0" olarak ayarlanır), program dosyayla ilişkili meta verileri kare hızı ve piksel boyutu için arar. Bu değerler bulunamazsa, program varsayılan olarak ölçüm için piksel başına ve zaman noktaları için kare başına olarak olur.
NOT: Sağlanan örnekte kare hızı 100 ve piksel boyutu 0,08'dir.
3. Maske seçin veya yapın
- Dosya veri kümesi listesindeki veriler için otomatik olarak hücre maskeleri oluşturmak üzere Maske Oluşturucu düğmesini kullanın (Şekil 2A, mavi kutu). Maske Oluşturucu düğmesini kullandıktan sonra, seçilen dizinde MaskFiles adlı yeni bir klasör oluşturulur. "Çalıştır göstergesi" çalışırken sararacak ve tamamlandığında yeşile dönecektir.
NOT: Veri Dosyaları listesindeki her dosya için bir maske, görüntü dosyasının ilk 10 karesinden (veya görüntü dosyasında 10'dan küçükse tüm çerçevelerden) oluşturulur ve uygun adlandırma şeması kullanılarak MaskFiles klasörüne yatırılır (aşağıda açıklanmıştır). - Maske dosyalarının Maske Dosyaları listesini otomatik olarak doldurduğundan emin olun. Kullanıcı doğrudan analize geçebilir.
NOT: Maske dosyalarını her zaman görsel olarak kontrol edin ve tüm ilgi çekici bölgeyi yakaladıklarını onaylayın. Veri dosyasının ve maske dosyasının ilk karesi seçildiğinde kullanıcı arabiriminde görüntülenir. (Şekil 2B). Maske Oluşturucu, düşük sinyalden gürültüye durumunda hatalar üretebilir, bu nedenle maske dosyalarının uygun olduğunu doğrulamak kalite kontrolü için kritik öneme sahiptir. - Maske Oluşturucu'nun kullanımına alternatif olarak, görüntülerin gürültüsüne sinyal yetersizse, ImageJ'de maskeleri el ile oluşturun.
- İlk olarak, ham görüntü dosyasını ImageJ'de açın (Şekil 3A).
- Çokgen Seçimi düğmesini tıklatın ve hücrenin etrafına maske çizmek için tıklatın. Tamamlandığında, çokgeni tamamlamak için son noktayı çift tıklatın.
- Tamamlandığında, | Düzenle'ye gidin Seçim | Maske Oluştur (Şekil 3B). Çokgen çizime göre yeni bir ters maske oluşturulacaktır. Maskeleri seçili dizinde belirlenmiş bir MaskFiles klasörüne kaydedin. Maske dosyası adlandırma düzeni, "_mask_file" tarafından izlenen ilgili tek tek veri dosyalarıyla eşleşmelidir. Örneğin, bir veri dosyası "VAMP2_488_WT_1.tif" olarak adlandırılırsa, karşılık gelen maske dosyasının "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" olarak adlandırılması gerekir.
- Yatırılan özel maske dosyalarının seçilen klasörüne gitmek için Maske Dosyalarını Bul düğmesini kullanın. Maskeler, Maske Dosyalarını liste olarak doldurur.
NOT: Analizi çalıştırmadan önce her veri dosyası için bir maskeye sahip olmak önemlidir.
4. Analiz ve özellik çıkarma
- Dizin seçildikten ve Veri Dosyaları listesi ve Maske dosyaları listesi doldurulduktan sonra, Çözümleme düğmesini (Şekil 4A) tıklatın. Eksosit olayların sınıflandırılması gerekiyorsa, 5.
NOT: Analiz düğmesi tıklatıldığında, verileri analiz etmek için bir dizi otomatik görev gerçekleştirilecektir. Analiz edilen verileri yatırmak için seçilen dizinde tek tek klasörler oluşturur. Çalışırken, "çalıştırma göstergesi" yeşilden sarıya değişecektir (Şekil 4A, kırmızı kutu). Analiz bittikten sonra, bu yeşile dönecektir. - Her veri dosyasına göre adlandırılmış tam çözümleme dosyası kümesine (ayrıca daha sonra sınıflandırmada kullanılacak özellik ayıklama dosyaları) sahip bir DataFiles klasörü(Şekil 4B)bulun.
NOT: Bu analiz dosyalarının açıklaması aşağıda Temsili Sonuçlar bölümünde yer almaktadır.
5. Ekzosit olayların sınıflandırılması
- Eksosit olayların otomatik algılama ile eşzamanlı sınıflandırmasını gerçekleştirmek için Analiz düğmesine tıklamadan önce Sınıflandırma onay kutusunu işaretleyin. Her eksosit olay için, her sınıf için 0-1 arasında bir olasılık puanı atayın. Eksosit olay, bu sınıfın olasılık puanı 0,5'> ise dört sınıftan biri olarak sınıflandırılır.
NOT: Çözümleme tamamlandıktan sonra, seçilen dizinde yeni bir veri dosyası klasörü görünecektir. Klasör, her görüntü dosyasına karşılık gelen analiz dosyalarını içerir.
6. Ripley'in K değerlerini kullanarak eksositozun mekansal analizi
- Ayrı bir "neurite" ve "soma" maske dosyası oluşturun. İlk olarak, somayı neurite'den bölümlendir. Soma'yı nötroritlerden bölümlere ayırmak için tarafsız bir yöntem yoktur, bu nedenle kullanıcı şartlandırma deneyine kör edilmeli ve en iyi yargıyı kullanmalıdır; belirgin neurit uzantıları olmayan bir elipsoid önerilir.
- ImageJ/Fiji'yi açın.
- Maske dosyasını sürükleyip bırakın veya Dosya |'nı kullanın Maske dosyasını açın ve seçin.
- Renk seçici aracını kullanın ve rengi siyaha ayarlamak için maskenin arka planındaki siyah piksellerden herhangi birine tıklayın.
- Somanın etrafına bir anahat çizmek için çokgen seçim aracını veya serbest el kullanın, onu neurites'ten ayırın. Bu, manuel karar vermeyi gerektirir.
- | Düzenle'yi tıklatın Seçim | Maske Yap. Görüntünün geri kalanından daire içine alınmış soma ile yeni bir görüntü açılacaktır. Bu bir soma maske dosyası oluşturacaktır.
- Çizilen bölgeyi taşımadan, özgün maske dosyasının başlığını tıklatın.
- | Düzenle'yi tıklatın Daire içine alınmış somayı doldurmak için doldurun, böylece sadece neurites maske olarak kalır.
- Ayrı neurite ve maske dosyaları elde edildikten sonra, Her iki maske dosyasını da kaydedin.
- Matlab'da "neurite_2D_network" açın.
- MATLAB'da, tüm çözümleme verilerini içeren dizine gidin.
- "Maske adı" yolunu neurite maskesinin adıyla, yani "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif" olarak değiştirin
- "csv_file_name" dosyasını fluorescent_traces.csv bulunduğu yere, yani "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv" olarak değiştirin.
- Neurite maske dosyasını iskeletleştirmek için Çalıştır'ı tıklatın. Bu, neurite maske dosyasının iskeletleştirilmiş bir sürümünü oluşturur ve maskfiles klasörünün altına CSV dosyası olarak yatırır.
- Ardından, soma için bir CSV dosyası oluşturun. Matlab'da "CSV_mask_creator.m" açın.
- Soma maskesinin adına "maske adı" için yola koyun, yani "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- Oluşturulacak "writematrix"i csv dosya adı olarak değiştirin, yani "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- Çalıştır 'ıtıklatın. Bu, yeni VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv dosyasını oluşturur.
- Her maske dosyası için 6.14'i yineleyin.
7. RStudio kurulumu
- Rstudio'yu açın ve ripleys_k_analysis açın. R dosyası.
- Araçlar |'ne giderek RStudio'ya "spatstat" paketini yükleyin Paketleri Yükle ve "spatstat" yazarak ardından Yükle 'yitıklatın.
NOT: Bunun Rstudio Kurulumu başına yalnızca bir kez yapılması gerekir. - Her oturumun başında kitaplık spatstat çalıştırın.
- Bu durumda iki ana değişkene dikkat edin: "neuron_mask" ve "neuron_datapoints." Nöron Maskesi, çalıştıracak maske dosyaları kümesine, yani soma maske dosyalarına işaret ediyor."
NOT: Neurite maske dosyalarından ayrı olarak tüm soma maske dosyalarını birlikte çalıştırın ve bunun tersi de geçerli. - Analiz edilecek nöronların her biri için maske dosyalarının .csv okuyun.
- Ek neuron_mask_n+1 kopyalayarak aynı anda birden çok dosya çalıştırın. Bu, bölüm 8'de açıklanan komut dosyasını kullanarak Ripley'in analizini bir araya getirmek için izin verecektir.
- Şimdi ikinci değişken olan "neuron_datapoints"ı kontrol edin.
- Okuma." X_fluorescent_traces.csv" dosyası analiz programı tarafından oluşturulan (tüm extracted_R dosya özelliklerine göre) ekzosit olayların x,y, t konumları ve 2D ağ için x,y konumlarının neurite özgü dosyası ile. Bu "neuron_datapoints" pozisyonuna geçer.
- RStudio'da Kod | Seç Bölge | Çalıştır Hepsini çalıştır. Bu, gruplanmış Ripley'in K değerlerinin yanı sıra yoğunluk çizimleri de dahil olmak üzere çeşitli çizimler oluşturur.
- Dışa Aktar |'ne giderek çizimleri kaydetme Görüntüyü | Olarak Kaydet Uygun görüntü biçimini ve dizini seçin ve uygun dosya adını girin, sonra Kaydet 'itıklatın.
NOT: Isı eşlemleri için çizim işlevi komut dosyasında "plot(density(soma_data,0.4)" kullanılarak çağrılır. Buradaki "0,4" sayısı, yoğunluk işlevinin ne kadar yumuşatılmış olması gerektiğini temsil eder. Kullanıcı verilerine anlamlı bir şekilde uyacak şekilde değiştirilebilir, ancak farklı ısı eşlemleri arasında karşılaştırmalar yapılacaksa, sayı aralarında aynı olmalıdır. - Rstudio'dan görüntüyü dışa aktar veya kaydet. Isı haritası daha fazla düzenleme gerektiriyorsa, uygun bir dosya türü (SVG veya EPS) seçin.
8. Ripley'in analizi
NOT: Ripleys_k_analysis. R dosyası ayrıca Ripley'in k değer çizimlerini otomatik olarak oluşturdu. Tüm komut dosyasını çalıştırmak aşağıda belirtilen işlevleri otomatik olarak çalıştırır, ancak komut dosyasının her bölümünü ayrı ayrı çalıştırmak veya çözümlemede değişiklik yapmak isterse ayrıntılı olarak dahil edilir.
- İlk olarak, her hücre için zarf işlevini çalıştırın. Bu işlev, ekzosik olay noktası deseninin Ripley'in K değerini test etmek için tam uzamsal rastgeleliği (KSS) simüle etti.
Data_envelope_1 = zarf(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = DOĞRU)
Data_envelope_2 = zarf(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = DOĞRU) - Ardından, bu zarfları bir araya getirin ve grup için bir KSS tahmini oluşturun:
Pool_csr = havuz(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
Ardından, tüm veri noktaları için Ripley'in K işlevini çalıştırın.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, oran = DOĞRU)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, oran = DOĞRU) - Tamamlandığında, Ripley'in K değerlerini bir araya toplayın ve güven aralıklarını aşağıdaki komutla önyükleyin:
Veri havuzu = havuz(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - Bootstrap aşağıdaki komutla:
Final_Ripleys_K = varblock(eğlence = Kest, Data_pool) - Verileri çizin.
- Sabit istatistiksel bir fark gerekiyorsa, puan desenleri grupları arasındaki farkı test etmek için öğrencileştirilmiş permütasyon testi spatstat paketine dahil edilir:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grup, nperm = np).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada GUI (Şekil 2A) TIRF (total iç yansıma floresan) mikroskopisi kullanılarak 3 DIV'de nöronları ifade eden üç VAMP2-pHluorin ekzositik olayları analiz etmek için kullanılmıştır. E15.5 kortikal nöronlar izole edildi, ardından Winkle ve ark., 2016 ve Viesselmann ve ark., 2011 11,12'debelirtildiği gibi protokoller kullanılarak VAMP2-pHluorin ve kaplama ile transfeksiyon yapıldı. Görüntüleme parametrelerinin metodolojisi Urbina ve ar...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Eksosit algılama ve analiz yazılımını kullanırken, lütfen programın yalnızca kayıpsız sıkıştırma .tif dosyalarını giriş olarak kabul ettiğini düşünün. .tif görüntü dosyaları 8 bit, 16 bit veya 32 bit gri tonlamalı (tek kanallı) görüntüler olabilir. Diğer görüntü biçimleri giriş öncesi bu türlerden birine dönüştürülmelidir. Başvuru için, burada kullanılan örnekler 16 bit gri tonlamalı görüntülerdir.
Otomatik algılama işleminin doğasında bulunan timelapse görüntü kümeleri, otomatik arka plan çık...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar açıklayacak bir şey beyan etmezler.
Teşekkürler
Dustin Revell ve Reginald Edwards'a test kodu ve GUI için teşekkür ederiz. R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) ve F31NS103586 (FLU) dahil olmak üzere bu araştırmayı destekleyen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finansman sağlanmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R R | Çekirdek Ekibi | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Kaynaklar
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
