pH'a duyarlı floresan probların işaretlediği eksosit olayları tespit etmek için otomatik bilgisayar görme yazılımı geliştirdik. Burada, füzyon olaylarını tespit etmek, füzyonun mekansal parametrelerini analiz etmek ve görüntülemek ve olayları farklı füzyon modlarında sınıflandırmak için grafiksel bir kullanıcı arayüzü ve RStudio'nun kullanımını gösteriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Eksositozun Otomatik Tespiti ve Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Vezikül SNARE proteinlerine bağlı pH'a duyarlı GFP (pHluorin) timelapse TIRF mikroskopisi, hücre kültüründe tek vezikül ekzosit olaylarını görselleştirmek için etkili bir yöntemdir. Bu tür olayların tarafsız, verimli bir şekilde tanımlanması ve analizini yapmak için MATLAB'da bilgisayar görüşüne dayalı bir yaklaşım geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Analiz ardışık düzeni bir hücre segmentasyonu ve eksosit olay tanımlama algoritması oluşur. Bilgisayarla görme yaklaşımı, floresan çürümesinin yarı ömrü ve ΔF/F zirvesi de dahil olmak üzere tek olayların birden fazla parametresini araştırmak için araçlar ve eksositoz sıklığının tam hücre analizi içerir. Bu ve diğer füzyon parametreleri, farklı füzyon modlarını ayırt etmek için bir sınıflandırma yaklaşımında kullanılır. Burada yeni oluşturulan bir GUI, analiz işlem hattını baştan sona gerçekleştirir. Ripley'in R Studio'daki K işlevinin daha fazla uyarlaması, hem uzay hem de zamandaki füzyon olaylarının kümelenmiş, dağılmış veya rastgele oluşumunu ayırt etmek için kullanılır.
Giriş
VAMP-pHluorin yapıları veya transferrin reseptörü (TfR)-pHuji yapıları, bu pH'a duyarlı floroforlar veziklin ve plazma zarı arasındaki füzyon gözenek açıklığı üzerine hemen asit veziklin lümeni ve floresan içinde söndürüldüğünden, ekzosit olayların mükemmel belirteçleridir1. Füzyon gözenek açıklığını takiben, floresan katlanarak bozunur ve füzyon olayı hakkında bilgi veren bazı heterojenlikler ortaya çıkardı. Burada, eksosit olayları otomatik olarak algılayan ve analiz eden bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) uygulaması açıklanmıştır. Bu uygulama, kullanıcının pH hassas işaretleyiciler2 tarafından ortaya çıkan ekzositik....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Veri kümelerini ve dizini seçin
- Analiz için veri kümelerini seçmek üzere Veri Kümelerini Bul düğmesini (Şekil 2A, kırmızı kutu 1) tıklatarak verilerin yatırıldığı klasöre (örneğin RawData klasörü) gidin. Veri Dosyaları, Veri Dosyalarını liste olarak otomatik olarak doldurur. Klasörde birden fazla veri kümesi olabilir.
- Dizin Seç düğmesini tıklatın ve analiz edilen dosyaların yatırılacağı dizini (örneğin, Test) seçin (Şekil 2A, kırmızı kutu 2) . Çözümleme düğmesine basıldığında, bu dizinde bir dizi klasör ve bitmiş çözüml....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada GUI (Şekil 2A) TIRF (total iç yansıma floresan) mikroskopisi kullanılarak 3 DIV'de nöronları ifade eden üç VAMP2-pHluorin ekzositik olayları analiz etmek için kullanılmıştır. E15.5 kortikal nöronlar izole edildi, ardından Winkle ve ark., 2016 ve Viesselmann ve ark., 2011 11,12'debelirtildiği gibi protokoller kullanılarak VAMP2-pHluorin ve kaplama ile transfeksiyon yapıldı. Görüntüleme parametrelerinin metodolojisi Urbina ve ar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Eksosit algılama ve analiz yazılımını kullanırken, lütfen programın yalnızca kayıpsız sıkıştırma .tif dosyalarını giriş olarak kabul ettiğini düşünün. .tif görüntü dosyaları 8 bit, 16 bit veya 32 bit gri tonlamalı (tek kanallı) görüntüler olabilir. Diğer görüntü biçimleri giriş öncesi bu türlerden birine dönüştürülmelidir. Başvuru için, burada kullanılan örnekler 16 bit gri tonlamalı görüntülerdir.
Otomatik algılama işleminin doğasında bulunan timelapse görüntü kümeleri, otomatik arka plan çık.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar açıklayacak bir şey beyan etmezler.
Teşekkürler
Dustin Revell ve Reginald Edwards'a test kodu ve GUI için teşekkür ederiz. R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) ve F31NS103586 (FLU) dahil olmak üzere bu araştırmayı destekleyen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finansman sağlanmıştır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R R | Çekirdek Ekibi | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Kaynaklar
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal orga....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
