Yöntem makalesi

Erkek Aedes aegypti Sivrisineklerinde Çiftleşme Rekabet Gücünü Incelemek için Floresan Boyası Rhodamine B'yi Kullanmak

DOI:

10.3791/62432

⸱

7 Mayıs 2021

 ,  ,  , 
1Environmental Health Institute, National Environmental Agency

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, erkek Aedes aegypti'nin çiftleşme rekabet gücünün bir işaretleyici olarak floresan boyası kullanılarak incelenmesi için bir protokol sunuyoruz. Dişi sivrisinekler çiftleşme için hem işaretli hem de işaretlenmemiş erkeklere maruz kalır. Çiftleşme sonrası spermathecae'leri çiftleşme partnerlerini belirlemek için floresan mikroskop altında incelenir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Steril veya uyumsuz böcek tekniğine dayalı popülasyon bastırma programlarının başarısı, serbest bırakılan erkeklerin vahşi tip dişiler için rekabet etme ve hedef popülasyonda steriliteyi teşvik etme yeteneğine bağlıdır. Bu nedenle, erkek çiftleşme rekabet gücünün laboratuvar değerlendirmesi, serbest bırakma suşunun saha salınmadan önceki kondisyonunu değerlendirmek için gereklidir. Geleneksel olarak, böyle bir test, çiftleşme için iki erkek kümesine (vahşi tip ve serbest bırakma suşları) aynı anda maruz kaldıktan sonra dişiler tarafından üretilen canlı yumurtaların oranını belirleyerek gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu işlem, yumurta üretimi için dişileri önce kanla besleme ve daha sonra yumurta canlılığını belirlemek için yumurtadan çıkan yumurtaları yumurtadan çıkarıp numaralandırma ihtiyacı nedeniyle zaman alıcı ve zahmetlidir.

Dahası, bu yöntem iki steril veya Wolbachiaenfekte sivrisinek hattı arasındaki rekabet derecesini ayırt edemez, çünkü vahşi tip dişi sivrisinekler sadece her ikisiyle çiftleştiğinde canlı olmayan yumurtalar üretecektir. Bu sınırlamaları aşmak için, bu makale, erkekleri RhB içeren sakkaroz çözeltisinde besleyerek işaretlemek için kullanılabilecek floresan boya rhodamine B (RhB) kullanarak laboratuvar ortamlarında erkek sivrisinek çiftleşme rekabet gücünü ölçmenin daha doğrudan bir yöntemini açıklar. Çiftleşme testinden sonra, bir dişinin spermathecae'sinde floresan spermlerin varlığı, çiftleşme eşini belirlemek için kullanılabilir. Bu yöntem uygun maliyetlidir, deneysel süreyi% 90 azaltır ve iki steril veya Wolbachiaenfekte hat arasında çiftleşme zindeliğinin karşılaştırılmasına izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aedes sivrisinek popülasyonlarının bastırılması için steril veya uyumsuz erkeklerin yetiştirilmesi ve salınması şu anda alanda dang ve diğer Aedeskaynaklı hastalık salgınlarını önlemek için yeni bir araç olarak değerlendirilmektedir1. Şu anda saha denemelerinde olan erkek salınımlı bastırma stratejileri arasında genetik yöntem2, ışınlama (Steril Böcek Tekniği, SIT)3, end ösymbiyotik bakteri Wolbachia (Böcek Uyumsuz Tekniği, IIT)4veya ikinci iki tekniğin bir kombinasyonu5,6. Bu yaklaşımların başarısı büyük ölçüde serbest bırakılan erkeklerin vahşi tip erkekleri alt etme ve çiftleşmeyi güvence altına almak için kadın arama yeteneğine bağlıdır. Aksi takdirde, hedef popülasyonda sterilite indüklenemez.

Klasik bir SIT programında, örneğin, erkek çiftleşme zindeliği ışınlama dozu7,8,9,kitle yetiştirme protokolü ve kolonideki akraba evliliği kapsamı10 , 11,12,13,14gibi faktörlerden etkilenebilir. Ayrıca, çiftleşme rekabet gücü üzerine yapılan çalışmalar, vektör kontrol stratejilerini bilgilendirmek için kullanılabilecek sivrisinek çiftleşme davranışı hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

SIT ve IIT'de, erkek sivrisineklerin çiftleşme rekabet gücü tipik olarak hem vahşi tip hem de serbest bırakma suşunun 8 ,11, 15,16kafesteki vahşi tip dişiler için rekabet etmesine izin vererek değerlendirilir. Dişiler daha sonra kanla beslenir ve yumurtaları canlılığı belirlemek için yumurtadan çıkar. Canlı olmayan yumurtaları veya yumurtaları düşük yumurta oranına sahip bırakan dişilerin serbest bırakma suşu erkeklerle çiftleştiği varsayılırken, canlı yumurta üreten kadınların vahşi tip erkeklerle çiftleştiği varsayılır. Çiftleşme rekabet gücü daha sonra Fried Index17ile hesaplanır. Ne yazık ki, bu yöntem kaynak yoğun ve zaman alıcıdır ve genel Fried Index, zayıf yumurta kullanımı ve aşırı desiccation gibi yumurta canlılığını etkileyen dış kafa karıştırıcı faktörlerden etkilenebilir, uyumluluk çaprazında düşük bir tarama oranına neden olabilir ve daha sonra yapay olarak düşük bir Fried Index'e yol açabilir.

Dahası, bu yöntem, Wolbachia'nın farklı suşlarıyla enfekte olan veya farklı ışınlama dozlarına maruz kalan Aedes sivrisinekleri arasında çiftleşme rekabet gücünün doğrudan karşılaştırılmasına izin vermez. Bu nedenle, bu zorlukları ele almak için daha doğrudan bir yöntem gereklidir. Son çalışmalar18,19, erkek sivrisineklerin seminal sıvısını işaretlemek için floresan boya olan RhB'yi kullanmanın etkinliğini göstermiştir. İşaretli seminal sıvı, başarılı çiftleşme üzerine dişi sivrisineklerin spermathecae'sinde aktarılır ve saklanır ve işaretli erkeklerle kadın çiftleşme etkileşiminin doğrudan ölçülmasına izin verir. Rhodamine B, böcekler de dahil olmak üzere hayvanlarda ekolojik ve davranışsal araştırma çalışmaları için biyobelirteç olarak yaygın olarak kullanılan tiyol reaktif florone boyasıdır20. Sivrisinek çalışmaları için, RhB çözünmüş RhB tozu 18 , 19 ,21,22,23,24içeren şeker veya bal suyu ile beslenerek tanıtılır. Alımdan sonra, RhB boyası proteinlere bağlanır ve floresan bir ışık kaynağı altında parlak turuncuyu floresanlayan kırmızımsı pembe bir leke ile vücut dokusunu lekeler.

İşaretin güçlü floresan sinyali ve stabilitesi, böcek seminal sıvılarını lekeleme yeteneği ile birleştiğinde, çiftleşme çalışmaları için işaretli seminal sıvının etiketli erkekten dişi böceğin sperm depolama organlarına transferinin izlenmesini sağlar18,19,21,24. RhB'nin bir erkek çiftleşme rekabetinde kullanılması, sadece kadınların işaretli ve işaretlenmemiş erkeklerle çiftleşme etkileşiminin doğrudan ölçülmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda sonuçlar, tipik olarak yaklaşık 10 ila 14 gün gerektiren yumurta canlılığını belirleme sürecini ortadan kaldırırken 24 saat içinde de elde edilebilir. Ayrıca, bu yöntem, dişi sivrisinekler yumurtlamadan önce kan beslemediğinde veya ölmediğinde potansiyel veri kaybının üstesinden gelir. Bu özellikle çok önemlidir, çünkü dişi sivrisineklerin çiftleşme sonrası toplama sırasında sırt çantası veya mekanik aspiratör kullanarak hasara ve ölüme eğilimli olduğu yarı saha denemelerinde. Kadın doğurganlığını kullanmanın mevcut sınırlamalarını ele almak için, erkek sivrisinek çiftleşme rekabet gücünü doğrudan ölçmek için RhB boyama kullanan alternatif bir yöntem sunuyoruz. Yöntem, iş akışını basitleştirir, deneysel süreyi yaklaşık iki haftadan bir güne kısaltır, daha deneysel çoğaltmaların gerçekleştirilmesine izin verir ve iki serbest bırakma suşu arasında karşılaştırmaya izin verir. Bu protokol, erkek salınıma dayalı sivrisinek popülasyonu bastırma programlarına başlayan laboratuvarlar için uygun olacak ve rutin kalite kontrol ve gerinim değerlendirmesi için kullanılabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sivrisineklerin yetiştiriği

  1. Tüm sivrisinek yetiştirme ve erkek çiftleşme rekabet gücünü 27 ± 1 °C ve% 75-80 bağıl nem standart böcek koşulları altında, 12 saat:12 saat ışık fotoperiyod ile gerçekleştirin: karanlık döngüler.
  2. Bu makalede açıklanan metodolojide kolay referans için iki rakip erkek setini Set A ve Set B olarak belirleyin. Test sırasında zindeliklerinin adil bir şekilde karşılaştırılmasını sağlamak için sivrisinekleri standart koşullar altında arka. Sivrisinekleri 2 L suda 500 larva larva yoğunluğunda arkaleyin ve öğütülmüş balık gıda tozu ad libitumile besleyin.
    NOT: Temsili sonuçların üretilmesi için Set A ve Set B, Wolbachiaenfekte Ae'nin doğuştan ve dışlanmış erkekleriydi. Aegypti, sırasıyla.
  3. Pupal aşamasında cinsiyet erkek ve dişi sivrisinekler ve bunları ayrı ayrı W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm boyutlarında, 150 x 150 ve 160 μm diyafram açıklığına sahip kafeslerde içerir. Tüm yetişkin sivrisinekleri% 10 sakkaroz çözeltisi ile koruyun.

2. Erkek ve dişi sivrisineklerin hazırlanması

  1. Erkek ve dişi sivrisinekleri boyut farklılıklarına göre pupal aşamasında cinsiyet (erkek pupalar dişi pupalardan daha küçüktür)(Şekil 1).
  2. Her sivrisinek seti (Set A veya Set B) için, her biri sakkaroz besleme veya RhB-sakkaroz besleme için prelabelled bir kafese 100 erkek pupa aktarın.
  3. Dişi pupaları kafes başına 40-50'lik küçük gruplar halinde yerleştirin. Imagoes'un ortaya çıkmasından sonra, kafesleri erkek sivrisineklerin varlığı için kontrol edin.
    NOT: Yetişkin erkek sivrisinekler dişilerden daha küçüktür ve daha gür ve kıllı antenlere sahiptir(Şekil 2). Çiftleşme rekabet tahlilleri için sadece bakire dişi sivrisinekler kullanın. Önceden döllenmiş kadınların kullanımı, elde edilen tüm verileri geçersiz kılar. Bu nedenle, pupa aşamasında seks sırasında aşırı özen alınmalıdır. Dişi sivrisinekleri erkek sivrisineklerle kontamine olmuş bir kafesten kullanmayın. Dişilerin ekstra kafesleri hazırlanmalıdır.

3. % 0.2 RhB hazırlanması - sakkaroz çözeltisi

NOT: RhB kuru formda yeşil bir toz ve çözeltide kırmızımsı pembedir. Bu kimyasal madde ele alınırken standart kişisel koruyucu ekipman (KKD: laboratuvar koruma önlüğü, nitril eldivenler ve göz koruması) giyilmelidir. Solunmasını önlemek için RhB tozunu bir duman kaputunda tartın.

  1. %0,2 w/v RhB-sakkaroz çözeltisi hazırlamak için, her 100 mL'lik %10 w/v/ sakkaroz çözeltisi için 200 mg RhB toz çözün. Tüm tozun çözüldüğüne emin olmak için iyice karıştırın.
    NOT: RhB ışığa duyarlı olduğundan, kehribar şişeleri kullanın veya şeffaf şişeleri tamamen alüminyum folyo ile sarın.

4. Erkek sivrisineklerin beslenmesi

NOT: RhB-sakkaroz besleme optimizasyonundan elde edilen veriler Ek Malzeme, bölüm 1'desunulmuştur.

  1. Fitil ile 20 şeker besleyici şişe hazırlayın. Diğer 10 besleyici şişesine 10 mL% 10 sakkaroz ve diğer 10 besleyici şişeye 10 mL% 0.2 RhB-sakkaroz çözeltisi ekleyin (kehribar şişeleri kullanın veya şişeleri alüminyum folyoya sarın).
  2. Besleyici şişeleri, 2.2 ve 2.3 adımlarında hazırlanan ilgili erkek kafeslerine (kafes başına 5 şişe) yerleştirin. Erkek sivrisineklerin çiftleşme deneyinden önce üç gün boyunca beslenmesine izin verin.

5. Erkek sivrisineklerde RhB floresan kontrolü

  1. RhB-sakkarozla beslenen erkek sivrisinekleri aspire edin ve tüm RhB-sakkarozla beslenen erkek sivrisineklerin RhB ile başarıyla işaretlenmiş olmasını sağlamak için floresan stereo mikroskop altında gözlemleyin.
  2. Cıva yakıcı lambayı ve stereo mikroskobu açın. Cıva brülör lambasının ışık kaynağının 10 dakika boyunca stabilize olmasını sağla. Kırmızı floresan protein 1 (RFP1) için floresan filtrelerini ayarlayın (ekscitasyon dalga boyu 540 nm, emisyon dalga boyu 625 nm).
  3. Oral aspiratör cam tüpüne bir seferde az sayıda sivrisinek (dört veya beş) aspire edin. Cam tüpten, floresan stereo mikroskop altında erkek sivrisineklerin vücudunu gözlemleyin. RhB ile işaretlenmiş olmayan erkek sivrisinekleri deneyden hariç tutun.
    NOT: RhB ile işaretlenmiş erkek sivrisineklerin karnı beyaz ışık altında pembe görünecektir (Şekil 3A) ve floresan ışık altında parlak turuncu parlayacaktır (Şekil 3B).
  4. Transfer Seti Bir erkek sivrisinekleri ağ ile sabitlenerek 12 kağıt bardak içine (ağ boyutu 150 x 150, 160 μm diyafram); Her biri 10 sakkarozla beslenen erkek sivrisinek ile 6 bardak ve diğer 6 bardak her biri 10 RhB-sakkarozla beslenen erkek sivrisinekler. B Seti erkek sivrisinekleri için bu adımı tekrarlayın.

6. Çiftleşme rekabet gücü tahlil

  1. Çiftleşme tahlilleri için 44 x 32, 650 μm diyafram açıklığına sahip 12 W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm kafesler kurun. Altı kafesin her birinde, 10 Set A (RhB işaretli) erkek sivrisinek, 10 Set B (işaretsiz) erkek sivrisinek ve 10 bakir yabani tip dişi sivrisinek bulunur. Diğer altı kafeste, 10 Set A (işaretsiz) erkek sivrisinek, 10 Set B (RhB işaretli) erkek sivrisinek ve 10 bakir vahşi tip dişi sivrisinek bulunur. İki çiftleşme kombinasyonunu net bir şekilde ayırt etmek için bu kafesleri etiketle.
    NOT: Deneyime dayanarak, çiftleşme tahlilleri için 60 cm x 60 cm x 60 cm'lik bir kafes kullanılmıştır, çünkü daha küçük bir kafes karışık çiftleşmeyi teşvik edebilir.
  2. 5.4. adımda hazırlanan ilgili erkek bardaklarını, adım 6.1'deki etikete göre çiftleşme kafeslerine yerleştirin. Ağı çıkarın ve erkekleri fincandan çıkarmak için yavaşça bardağa dokunun. Hiçbir sivrisineğin kafesten kaçmamasını sağlamak için kağıt bardağı ve ağı dikkatlice kafesten çıkarın. Erkek sivrisineklerin çiftleşme kafesine en az bir saat alışmasına izin verin.
  3. Oral bir aspiratör kullanarak, bakire vahşi tip dişi sivrisinekleri 12 kağıt bardağa aktarın ve her bardak 10 sivrisinek içerir.
  4. Erkek sivrisinekler için alışma döneminden sonra, her çiftleşme kafesine bir bardak dişi aktarın ve ağı çıkarın. Kalan dişi sivrisinekleri fincandan çıkarmak için fincanı hafifçe itin. Hiçbir sivrisineğin kafesten kaçmamasını sağlamak için kağıt bardağı ve ağı dikkatlice kafesten çıkarın.
  5. Çiftleşmenin 3 saat boyunca gerçekleşmesine izin verin.
    NOT: Önerilen çiftleşme süresi, vahşi tip Ae. aegypti'ninönceki gözlemleri ile belirlenmiştir. 60 cm x 60 cm x 60 cm kafeste tutulan 10 kadın ve 20 erkeği içeren deneylerde, 3 saat içinde % 90 kadın döllenmesi elde edildi(Ek Malzeme, bölüm 2). Ajitasyon kesintiye ve karışık çiftleşmeye yol açabileceği için bu süre zarfında kafesi rahatsız etmeyin. Karışık çiftleşme (dişinin hem işaretli hem de işaretsiz erkeklerle çiftleştiği yer), işaretlenmemiş spermleri floresan mikroskop altında RhB işaretli spermlerden ayırt etmek zor olduğu için RhB işaretli erkeklere karşı bir önyargı ile sonuçlanır.
  6. Çiftleşme deneyini sonlandırmak için, mekanik bir aspiratör kullanarak her kafesten tüm sivrisinekleri çıkarın. Soğuk, sivrisinekleri en az 5 dakika boyunca buz üzerinde uyuşturun. Sivrisinekler tamamen uyuşturulduğu zaman, dişi sivrisinekleri hafifçe toplayın ve ağ ile sabitlenmiş ayrı bir kağıt bardağa barındırın (ağ boyutu 150 x 150, 160 μm diyafram). İlgili etiketi çiftleşme kafesinden kağıt kabına aktararak kağıt bardağı etiketleyin.
    NOT: Bu noktada deneyi duraklatmak ve dişileri% 10 sakkaroz çözeltisi ile korumak mümkündür. RhB işaretli seminal sıvı en az bir hafta boyunca kadın spermathecae içinde sabit kalacaktır. Ölü ve kuruyan örneklerin parçalanması zor olduğu için diseksiyondan önce dişileri canlı tutmak en iyisidir.
  7. Dişi spermathecae puanlamak için, soğuk bir stereo mikroskop altında diseksiyondan önce en az 5 dakika boyunca buz üzerinde dişi sivrisinekleri uyuşturun (Video 1). Spermathecae'yi bileşik ışık mikroskobu (büyütme 100x) altında tohumlama durumları için inceleyin (Şekil 4). Döllenmiş bireyler için, spermathecae'nin RFP1 filtresi ve kamera görüntüleme sistemi ile donatılmış floresan stereo mikroskop altında inceleyerek RhB işaretli seminal sıvı içerip içermediğini belirleyin.
    NOT: Ekli görüntüleme sistemine sahip floresan stereo mikroskop kullanırken, algılama hassasiyetini artırmak için uzun süreli bir maruz kalma süresi (5 s) kullanılması önerilir. Dişi sivrisinek işaretli bir erkekle çiftleştiyse, spermathecae parlak turuncu floresan olacaktır (Şekil 5A). Bununla birlikte, dişi sivrisinek işaretlenmemiş bir erkekle çiftleştiyse, döllenmiş spermathecae floresan olmayacaktır (Şekil 5B).

7. RhB atıklarının bertarafı

  1. Sulu RhB atıklarını genel atık su olarak boşaltmadan önce aktif karbon25 ile tedavi edin. Katı RhB atıklarını (RhB ile işaretlenmiş sivrisinekler, kağıt havlular ve RhB ile ıslatılmış fitiller) kimyasal atık olarak atın. RhB atıklarını işlerken standart KKD yapmayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

w AlbB-SG, Wolbachia'nın wAlbB suşu ile kasten enfekte olmuş lokalize (Singapur) bir Ae. aegypti hattıdır. Bu makalede açıklanan protokolü kullanarak, akraba evliliklerinin erkek çiftleşme zindeliğinde bir kayıpla sonuçlanıp sonuçlanmadiğini belirlemek için bir inbred ve outcrossed line of wAlbB-SG'nin erkek çiftleşme rekabet gücünü değerlendirdik. İnbred hattı böcekçide 11 nesil boyunca korunurken, dış çizgi dişilerin vahşi tip erkek Ae ile tersten dönmesiyle oluşturuldu. aegypti. Doğuştan ve dışlanmış çizgilerden erkekler, vahşi tip vahşi tip dişi Ae. aegyptiile çiftleşmek için birbirleriyle yarıştılar. Çiftleşme rekabet gücü tahlilleri üç taraflı olarak gerçekleştirildi.

Sonuçlar, kadın tohumlama verileri RhB-sakkarozla beslenen erkeklerle çiftleşmeye karşı veya karşı önyargılı olmadığı için RhB'nin erkeklerin zindeliğini etkilemediğini gösterdi (Tablo 1 ve Şekil 6) RhB erkeklerin çiftleşme kondisyonunu etkilemediği için, verileri, inbred veya outcrossed çizgi(Tablo 2 ve Şekil 7)tarafından çiftleştirilmiş döllenmiş kadınların yüzdesine göre analiz etmeye devam ediyoruz. Deneysel triplicates genelinde sonuç tutarlıydı; her üç kopyada da (P ≤ 0.05, Mann-Whitney U-test) dış erkeklerle çiftleşen kadınların önemli ölçüde daha yüksek bir yüzdesi vardı. Bu sonuçlar, laboratuvarda birkaç nesil akraba evliliğinden sonra erkek çiftleşme zindeliğinde potansiyel bir kayıp olduğunu göstermektedir.

Sivrisinek larvaları, erkek ve dişi, sucul larva aşamasını gösteren diyagram, morfoloji farkı.
Şekil 1: Erkek (solda) ve dişi (sağda) Aedes aegypti pupalarının yanal görünümü. Aynı yetiştirme koşulları altında, Ae. aegypti boyuta göre pupal aşamasında seks yapılabilir; erkekler kadınlardan önemli ölçüde daha küçüktür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sivrisinek tanımlama karşılaştırması, ayırt edici özellikleri işaretleyen kırmızı oklu diyagram.
Şekil 2: Erkek (sol) ve kadın (sağda) Aedes aegypti yetişkinlerinin farklılaşması. Yetişkin erkek sivrisinekler (solda) yetişkin dişiden daha gür ve kıllı antenlere sahiptir; kırmızı oklar anteni gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sivrisinek floresan karşılaştırması; doğal ve UV altında modifiye edilmiş; mikroskopi görüntüsü; genetik çalışma.
Şekil 3: Erkek sivrisinin Rhodamine B işareti. (A) Hafif mikroskopi; (B) floresan mikroskopisi. Soldaki sivrisinek işaretsizdir (% 10 w / v sakkarozla beslenir), sağdaki ise işaretlenir (% 0.2 RhB-sakkaroz ile beslenir). İşaretli sivrisinekler, floresan mikroskopisi (B)altında parlak turuncu floresan yapan beyaz ışık altında (A'dasağdaki sivrisinek) görünür pembe bir karına sahiptir. Ölçek çubukları = 5 mm. Kısaltma: RhB = Rhodamine B. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Döllenme analizi için döllenmiş ve döllenmemiş hücrelerin mikroskop görüntüsü, 100 μm ölçek.
Şekil 4: Bileşik ışık mikroskobu (100x büyütme) altında döllenmiş ve döllenmemiş kadın spermathecae. Dişi bir sivrisineğin tohumlama durumu, spermathecae'sini bileşik bir ışık mikroskobu altında gözlemleyerek belirlenebilir. Döllenmemiş bir dişi sivrisinek en az bir doldurulmuş spermatheca içerirken, döllenmemiş bir dişi sivrisinekteki üç spermathecae de boş olacaktır. İplik benzeri, hareketli sperm, bileşik bir ışık mikroskobu altında dolu bir spermatheca'da görülebilir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Görünür ışık altında hücre kümelerinin mikroskopi görüntüsü, 100 mikrometre ölçekli, biyolojik çalışma.
Şekil 5: Floresan stereo mikroskop altında seminal sıvılarla döllenmiş dişi sivrisinek spermathecae. (A) RhB işaretli ve (B) RhB işaretli seminal sıvılarla döllenmiş işaretsiz spermathecae floresan mikroskopisi altında parlak turuncu floresan olacaktır. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sivrisinek çiftleşme çalışması; çiftleşme başarısı üzerinde erkek etkisi; Karşılaştırmalı veri analizi, grafik.
Şekil 6: Deneysel triplicatlarda doğuştan veya dıştan gelen erkekler tarafından karşılıklı işaretle döllenen vahşi tip kadın sayısı. (A) İnbred erkekler RhB ile işaretlenirken, outcross erkekler işaretsizdi. (B) Outcross erkekleri RhB ile işaretlenirken, inbred erkekler işaretsizdi. Daha yüksek sayıda dişinin, işaretleme durumlarına bakılmaksızın outcross erkeklerle çiftleştiği gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sivrisinek çiftleşme başarı tablosu; Akraba ve Çapraz; Çubuk grafik, replikasyon başına çiftleşen dişilerin yüzdesini gösterir.
Şekil 7: 3 deneysel kopyada, doğuştan veya dıştan erkeklerle çiftleşen döllenmiş kadınların oranı. Her deneysel kopya için, outcross erkeklerle çiftleşen kadınların önemli ölçüde daha yüksek bir yüzdesi vardır (P ≤ 0.05, Mann-Whitney U-testi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Hafif stereo mikroskop altında spermathecae için dişi Aedes aegypti diseksiyonu. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız. 

♀ x Inbred (RhB) ♂ ♀ x Outcross (işaretlenmemiş) ♂ b ♀ x Inbred (işaretlenmemiş) ♂ c ♀ x Outcross (RhB) ♂ d Genel tohumlama oranı
(a+b+c+d/120)
Çoğaltma 1113574077.5% (93/120)
Çoğaltma 262983161.7% (74/120)
Çoğalt 363663367.5% (81/120)

Tablo 1: RhB işaretli ve işaretsiz wAlbB-Sg Aedes aegypti inbred ve outcross erkekler ile çiftleşen kadın sayısı. Her kopyada toplam 120 kadın kullanıldı.

Döllenmiş kadın yüzdesi
Doğuştan erkeklerOutcross erkekler
Çoğaltma 119% (18/93)81% (75/93)
Çoğaltma 219% (14/74)81% (60/74)
Çoğalt 315% (12/81)85% (69/81)

Tablo 2: Döllenmiş kadınların yüzdesi wAlbB-Sg Aedes aegypti inbred ve outcross erkekler ile çiftleşir.

Ek Şekil S1: RhB tabanlı ve geleneksel çiftleşme rekabet gücü tahlilleri için iş akışının karşılaştırılması. Geleneksel çiftleşme rekabet gücü testine kıyasla, RhB tabanlı çiftleşme rekabet gücü tahlilleri için basitleştirilmiş ve kısaltılmış iş akışı deneysel süreyi önemli ölçüde azaltır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S2: Kaplan Meier erkek yetişkin Aedes aegypti'nin beslenme sırasında ve sonrasında% 0.2 ve% 0.4 rhodamin B-sakkaroz besleme ile hayatta kalmaeğrileri. Sadece sakkarozla beslenen kontrollere kıyasla, üç günlük beslenme sırasında ve sonrasında(A)erkek vahşi tipi ve(B) wAlbB-Sg Ae. aegypti'nin %0,2 ve %0,4 RhB-sakkarozla sağkalım oranı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S1: W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm kafesteki kadınların tohumlama oranı (10 dişinin 20 erkeğe oranı) 1,2 ve 3-h zaman noktalarında. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. 

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İşaretleme, böcek popülasyon dinamiklerini, dağılım, davranış ve çiftleşme biyolojisini incelemek için entomolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılır26. SIT ve IIT programlarında, dağılımlarını incelemek ve serbest bırakma oranını optimize etmek için serbest bırakma suşunu alan popülasyonundan ayırt etmek için işaretleme gerçekleştirilir. Kullanılanişaretleme yöntemleri arasında larva gıda29, 30,floresan toz 31 ve boya32izotopları içeren genetik işaretleme 27 ,28bulunur. Erkek çiftleşme zindeliğinin kritik bir bileşen olduğu SIT veya IIT kullanarak sivrisinek popülasyonlarının bastırılması için, floresan boyalar sivrisinek çiftleşme biyolojisini incelemek için belirteçler olarak kullanılmıştır18,19.

Geleneksel olarak, serbest bırakma suşunun erkek çiftleşme rekabet gücünün değerlendirilmesi, kadın doğurganlık tahlilleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, bu test çiftleşme sonrası aşağı akış deneysel süreçler nedeniyle zaman alıcı ve emek yoğundur (Ek Şekil S1). Bu işlemler arasında dişilerin kan beslemesi, yumurta toplanması, yumurtaların kuluçkalanması ve yumurtanın canlılığını belirlemek için yumurtadan çıkan yumurtaların oranının numaralandırı. Ortalama olarak, bu test 30 adam-saat ve iki haftalık deneysel çalışma gerektirir (rekabet gücü test kafeslerinin kurulmasından başlayarak) erkek çiftleşme rekabet gücünün nihai belirlenmesine kadar.

makalesi, dişiler ve RhB işaretli erkekler arasındaki çiftleşme etkileşimlerini doğrudan ölçmek için floresan boya, RhB, (sivrisineklere% 0.2 RhB-sakkaroz olarak beslenir, Ek Şekil S2)kullanımını sunar. Bu protokol floresan stereo mikroskop gerektirirken, yukarıda belirtilen zaman alıcı deneysel prosedürleri gerçekleştirme ihtiyacını ortadan ortadan alır. Ortalama olarak, bu RhB tabanlı tahlil, kadın doğurganlık tahlillerinden buna eşdeğer verileri elde etmek için yaklaşık 10 erkek saati ve yaklaşık bir gün gerektirir. Bu >90% zaman tasarrufu, araştırmacıların birden fazla deneysel çoğaltma gerçekleştirmesine izin vererek erkek çiftleşme zindeliğinin daha sağlam bir şekilde doğrulanmasını sağlar. Ek olarak, bu test iki steril veya Wolbachia enfekte sivrisinek hattı arasındaki çiftleşme rekabet gücünü karşılaştırmak için kullanılabilir.

Bu tür bir karşılaştırma geleneksel kadın doğurganlık tahlilleri ile mümkün değildir, çünkü dişiler bu tür her iki çizgiyle çiftleşmede canlı olmayan yumurtalar verirler.  Buna rağmen, deneydeki herhangi bir karışık çiftleşme, hem RhB işaretli hem de işaretlenmemiş erkeklerden seminal sıvı içeren kadın spermathecae'deki işaretsiz spermleri tanımlamak zor olduğu için işaretli popülasyona karşı önyargıya neden olacaktır. Benzer bir sonuç, RhB18kullanılarak Anopheles gambiae'nin çiftleşme rekabet gücünü değerlendiren bir çalışmada yapıldı, böylece çiftleşme testinde kadınların daha büyük bir kısmının işaretli erkekler tarafından çiftleştiği tespit edildi. Poliandry daha önce yarıda kesilmiş bir çiftleşme33ile uğraşan kadınlarda ortaya çıkma olasılığı daha yüksek olduğundan, bu deneylerde daha büyük bir kafes hacminde (0.216 m3)daha az sivrisinek (20 erkek ila 10 kadın) kullanılarak bu çalışmada bunun gerçekleşme olasılığı azaltılmıştır.

Sonuçlar, RhB işaretli nüfusa karşı önyargı göstermedi ve karışık çiftleşmenin sınırlı olduğunu gösterdi. Özetle, erkekleri çiftleşme rekabetinde işaretlemek için RhB'nin dahil olması, erkek çiftleşme kondisyonunu değerlendirmenin ekonomik ve hızlı bir yoludur. Bu yöntem ayrıca, farklı ışınlama dozlarına maruz kalan, farklı yetiştirme rejimlerinde yetiştirilen veya wolbachia'nınfarklı suşları ile enfekte olanlar arasında çiftleşme rekabet gücünün doğrudan karşılaştırılmasını sağlar , herhangi bir erkek salınımlı sivrisinek popülasyonu bastırma programı için erkek çiftleşme uygunluğunun değerlendirilmesi için değerli bir araçtır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Singapur Ulusal Çevre Ajansı (NEA) tarafından finanse edildi. Çalışmanın yayınlanmasına onay verdiği için NEA İcra Kurulu Başkan Yardımcısı (Halk Sağlığı) Bay Chew Ming Fai'ye ve bu çalışmaya verdiği destek için NEA Grup Direktörü (Çevre Sağlığı Enstitüsü Grubu) A/Prof Ng Lee Ching'e teşekkür ederiz. Ayrıca Dr Shuzhen Sim ve Dr Denise Tan'a taslağı düzelttikleri için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bileşik ışık mikroskobuOlympusCX23İspermeçet tohumlaması için puan almak için
Diseksiyon forsepsBioquipRubis forseps (4524)
RFP1 filtreli floresan stereo-ışık mikroskobuOlympusSZX16Rhodamine B floresan sinyalini kontrol etmek için
Sivrisinek kafesleriBugdorm4F3030G 32,5 cm x D 32,5 cm x Y 32,5 cm; 150 x 150 ağ boyutu; 160 ve mikro; m diyafram açıklığı Çiftleşme testinden önce erkek ve dişi yetişkin sivrisineklerin tutulması için
6M610G 60 cm x D 60 cm x Y 60 cm; ağ boyutu 44 x 32; 650 ve mikro; m diyafram açıklığı
Çiftleşme rekabet gücü testi
için Cibinlik150 x 150, 160 ve mikro; m diyafram
açıklığı Rhodamine BSigma AldrichR6626≥ %95 (HPLC)
Stereo-ışık mikroskobuOlympusSZ61Spermathecae diseksiyonu için
SükrozMP BiyomedikalSKU 029047138Gıda sınıfı
TetraMin tropikal pullarTetra77101Larvaları beslemek için balık yemi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Achee, N. L., et al. A critical assessment of vector control for dengue prevention. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003655(2015).
  2. Carvalho, D. O., et al. Suppression of a field population of Aedes aegypti in Brazil by sustained release of transgenic male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003964(2015).
  3. Lees, R. S., Gilles, J. R. L., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B., Bourtzis, K. Back to the future: the sterile insect technique against mosquito disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 156-162 (2015).
  4. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  5. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R. L., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II--A safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), 0135194(2015).
  6. Zheng, X., et al. Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes. Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).
  7. Balestrino, F., et al. Gamma ray dosimetry and mating capacity studies in the laboratory on Aedes albopictus males. Journal of Medical Entomology. 47 (4), 581-591 (2010).
  8. Bellini, R., et al. Mating competitiveness of Aedes albopictus radio-sterilized males in large enclosures exposed to natural conditions. Journal of Medical Entomology. 50 (1), 94-102 (2013).
  9. Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G. Radiation biology of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 6(2009).
  10. Aldersley, A., et al. Too "sexy" for the field? Paired measures of laboratory and semi-field performance highlight variability in the apparent mating fitness of Aedes aegypti transgenic strains. Parasites & Vectors. 12 (1), 357(2019).
  11. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
  12. Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malaria Journal. 8 (2), 4(2009).
  13. Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56124(2017).
  14. Ross, P. A., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. A comprehensive assessment of inbreeding and laboratory adaptation in Aedes aegypti mosquitoes. Evolutionary Applications. 12 (3), 572-586 (2019).
  15. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3294(2014).
  16. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Bourtzis, K., Gilles, J. R. Combining the sterile insect technique with the incompatible insect technique: III-Robust mating competitiveness of irradiated triple Wolbachia-infected Aedes albopictus males under semi-field conditions. PloS One. 11 (3), 0151864(2016).
  17. Fried, M. Determination of sterile-insect competitiveness. Journal of Economic Entomology. 64 (4), 869-872 (1971).
  18. Aviles, E. I., Rotenberry, R. D., Collins, C. M., Dotson, E. M., Benedict, M. Q. Fluorescent markers rhodamine B and uranine for Anopheles gambiae adults and matings. Malaria Journal. 19 (1), 236(2020).
  19. Johnson, B. J., et al. Use of rhodamine B to mark the body and seminal fluid of male Aedes aegypti for mark-release-recapture experiments and estimating efficacy of sterile male releases. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005902(2017).
  20. Fisher, P. Review of using rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
  21. Blanco, C. A., Perera, O., Ray, J. D., Taliercio, E., Williams, L. Incorporation of rhodamine B into male tobacco budworm moths Heliothis virescens to use as a marker for mating studies. Journal of Insect Science. 6, 5(2006).
  22. Mascari, T. M., Foil, L. D. Laboratory evaluation of the efficacy of fluorescent biomarkers for sugar-feeding sand flies (Diptera: Psychodidae). Journal of Medical Entomology. 47 (4), 664-669 (2014).
  23. Sarkar, D., Muthukrishnan, S., Sarkar, M. Fluorescent marked mosquito offer a method for tracking and study mosquito behaviour. International Journal of Mosquito Research. 4, 5-9 (2017).
  24. South, A., Sota, T., Abe, N., Yuma, M., Lewis, S. M. The production and transfer of spermatophores in three Asian species of Luciola fireflies. Journal of Insect Physiology. 54 (5), 861-866 (2008).
  25. Üner, O., Geçgel, Ü, Kolancilar, H., Bayrak, Y. Adsorptive removal of rhodamine B with activated carbon obtained from okra wastes. Chemical Engineering Communications. 204 (7), 772-783 (2017).
  26. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annual Review of Entomology. 46, 511-543 (2001).
  27. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). New Biotechnology. 25 (1), 76-84 (2008).
  28. Ahmed, H. M. M., Hildebrand, L., Wimmer, E. A. Improvement and use of CRISPR/Cas9 to engineer a sperm-marking strain for the invasive fruit pest Drosophila suzukii. BMC Biotechnology. 19 (1), 85(2019).
  29. Botteon, V., Costa, M. L. Z., Kovaleski, A., Martinelli, L. A., Mastrangelo, T. Can stable isotope markers be used to distinguish wild and mass-reared Anastrepha fraterculus flies. PloS One. 13 (12), 0209921(2018).
  30. Hood-Nowotny, R., Mayr, L., Islam, A., Robinson, A., Caceres, C. Routine isotope marking for the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 102 (3), 941-947 (2009).
  31. Schroeder, W. J., Mitchell, W. C. Marking Tephritidae fruit fly adults in Hawaii for release-recovery studies. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 23 (3), 437-440 (1981).
  32. Akter, H., Taylor, P. W., Crisp, P. Visibility and persistence of fluorescent dyes, and impacts on emergence, quality, and survival of sterile Queensland fruit fly Bactrocera tryoni (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 113 (6), 2800-2807 (2020).
  33. Oliva, C. F., Damiens, D., Benedict, M. Q. Male reproductive biology of Aedes mosquitoes. Acta Tropica. 132, Suppl 12-19 (2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Aedes Aegypti MosquitoesMating CompetitivenessRhodamine B MarkingSterile Insect TechniqueWolbachia Infected MosquitoesFluorescent Dye AssaySpermathecae DissectionPopulation SuppressionMark Release RecaptureMosquito Fitness Assessment

İlgili makaleler