Yöntem makalesi

Tasarlanmış HEK Hücrelerini Kullanarak MRGPRX2'i Etkinleştiren Peptitlerin Taranır

DOI:

10.3791/62448

⸱

6 Kasım 2021

 ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, Donadeo Innovation Centre for Engineering, University of Alberta, 2School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MRGPRX2 reseptörü ile mast hücrelerini aktive edebilecek kısa peptitlerden oluşan bir kütüphane oluşturma teknikleri açıklanmıştır. İlişkili teknikler kolay, ucuzdur ve diğer hücre reseptörlerine genişletilebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapötik olarak önemli hücre reseptörlerine özgü ligandların tanımlanması, yeni terapötiklerin tasarımı ve geliştirilmesi de dahil olmak üzere birçok uygulama için çok önemlidir. Mas ile ilişkili G-protein reseptörü-X2 (MRGPRX2), mast hücre aktivasyonunu düzenleyen ve böylece genel immün yanıtı yönlendiren önemli bir reseptördür. MRGPRX2 için çok sayıda ligand tanımlanmıştır ve PAMP'ler, defensinler, LL-37 ve diğer protein parçaları (yani bozulmuş albümin) gibi endojen peptitleri içerir. MRGPRX2 spesifik ligandların daha fazla tanımlanması, çok sayıda peptitin (yani peptit kütüphanesinin) taranmışlığını gerektirir; bununla birlikte, mast hücrelerinin in vitro olarak tutulması zor ve pahalıdır ve bu nedenle çok sayıda molekülün taranması için kullanılması ekonomik değildir. Bu makale, HEK hücrelerini ifade eden MRGPRX2 kullanarak küçük peptit moleküllerinden oluşan bir kütüphane tasarlamak, geliştirmek ve taramak için bir yöntem göstermektedir. Bu hücre hattının bakımı nispeten kolay ve ucuzdur ve in vitro yüksek verim analizi için kullanılabilir. Aktivasyonu izlemek için aktivasyon üzerine hücre içi kalsiyum akısını işaretlemek için kalsiyuma duyarlı fura-2 floresan boya kullanıldı. Kalsiyum konsantrasyonunu hesaplamak için 510 nm'de Fura-2'nin floresan yoğunluğunun 340 ve 380 nm'lik ekscitasyon dalga boylarına karşı oranı kullanılmıştır. Bu sistemi doğrulamak için kullanılan peptit kütüphanesi, MRGPRX2'yi yüksek özgüllük ve benzeşim ile bağladığı bilinen endojen proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) salgıya dayanıyordu. Pamp-12'ye uygulanan amino asit kesilmesi ve alanin tarama teknikleri ile sonraki peptitler üretildi. Burada açıklanan yöntem, bağlayıcı etki alanlarını ve reseptör aktivasyonunda önemli rol oynayan diğer önemli parametreleri tanımlamak için büyük bir bileşikler kitaplığını taramak için basit ve ucuz ancak sağlamdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mast hücreleri bağışıklık sisteminin ayrılmaz bir parçasıdır ve hem doğuştan gelen hem de adaptif immün yanıtlarda çok önemli bir rol oynar. Mast hücreleri öncelikle bir antijenin immünoglobulin E (IgE) - FcφRI reseptör kompleksine bağlanması veya yakın zamanda keşfedilen mas ile ilgili G-protein reseptörü-X2 (MRGPRX2)1ile aktive edilir. MRGPRX2 aktivasyonu birkaç bağışıklık ve enflamatuar hastalığa bağlanmıştır ve bu nedenle reseptörün ligandlarına bağlanma mekanizmasını anlamak önemlidir2. Bunun için, HEK hücrelerinde aşırı ifade edilen MRGPRX2 reseptörlerine karşı küçük peptit moleküllerinden oluşan bir kütüphane geli....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Peptit kütüphanesinin tasarımı ve geliştirilmesi

  1. Bilinen bir ligand yani PAMP-1213'edayanan mast hücresi MRGPRX2 reseptörün ligandlarını tanımlamak için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Ligandın N-terminal amino asit kalıntılarını art arda katı fazlı peptit sentezi (SPPS) ile keserek N kesilmiş peptit kütüphanesi oluşturun.
    2. Bilinen ligandın C-terminal amino asit kalıntılarını art arda SPPS ile keserek C kesilmiş peptit kütüphanesi oluşturun.
    3. 1.1.1 ve 1.1.2 sonuçlarına dayanarak, sırasıyla N ve C terminalinden istenen kalıntıları keserek SPPS kullanarak bir N + C kesilmiş peptit kütüphanesi ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tablo 1, terminal amino asit kesilmesi ve alanin taraması yoluyla oluşturulan peptit dizilerini içerir. Tablo 1'degösterildiği gibi, peptit dizisi RKKWNKWALSR, ana PAMP-12 ile ilgili olarak N-terminal fenilalaninden (F) yoksundur ve bu nedenle N kesilmiş kütüphanede temsili bir peptittir. Benzer şekilde, FRKKWNKWALS'da PAMP-12'den türetilen C kesilmiş peptit kütüphanesini temsil eden PAMP-12 C-terminal serini kaldırılmıştır. N+C kesilmiş peptit kütüphanesinde hem N hem de C-terminalinden.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalsiyum sinyali mast hücre degranülasyonu için merkezidir ve reseptör-ligand etkileşimleri, ligand tanımlama ve ilaç keşfi çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır14. MRGPRX2, kaşıntı, astım ve atopik dermatit gibi birçok enflamatuar hastalıkta önemli bir rol oynadığı tespit edilen yakın zamanda keşfedilen bir mast hücre reseptörüdür2. Ayrıca, mrgprx2 reseptör15aracılığıyla enflamatuar yanıt ortaya çıkarmak için onaylanmış birkaç ilaç gösterilmiş.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SR ve LDU, Alberta Innovates Stratejik Araştırma Projesi, NRC ve NSERC-Discovery'nin bu proje için hibesini kabul etmek istiyor.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır Serumu AlbüminiSigma Aldrich5470
Kalsiyum KlorürSigma Aldrich793939
Corning 96 KuyusuSigma AldrichCLS3603
Siyah PolistirenMikroplaka Sigma AldrichCLS3603
DMEMThermo Fischer11995065Yüksek Glikoz
DMSOTermo FischerD12345Steril, biyolojik sınıf
EGTASigma AldrichE3889
Fetal Sığır SerumuThermo Fischer12483-020
Flexstation 3
tamponThermo Fischer15630-080
İyonomisinSigma AldrichI9657
L GlutaminThermo Fischer25030-081
Kalem StrepThermo Fischer15140122
PeptitlerRS SyntehsisCustom≥ % 95 saf;
N terminali - asetil grubu
C terminali - amid grubu
Potasyum KlorürSigma Aldrich12636
Sodyum KlorürSigma AldrichS9888
TritonX-100DOW Kimyasal166704
Fura-2 Thermo Fischer F1221 Glikoz Sigma Aldrich D8270 HEPES FV06060 moleküler cihazlar

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
  2. Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MRGPRX2 ActivationPeptide Library ScreeningEngineered HEK CellsMast Cell ActivationAlanine ScanningCalcium Flux AssayFura 2 DyeSolid Phase Peptide SynthesisFluorescence Plate ReaderAmino Acid Truncation

İlgili makaleler