Leishmania enfeksiyonunda fagositoz ile ilişkili mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle meydana gelen erken olayları değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Konfokal Mikroskopi ile Leishmania Fagositozunun İncelenmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Fagositoz, farklı adımları içeren düzenlenmiş bir süreçtir: tanıma, bağlama ve içselleştirme. Profesyonel fagositler, çoklu konakçı hücre reseptörleri tarafından parazit yüzeylerindeki ligandların tanınmasından oluşan fagositoz ile Leishmania parazitlerini alırlar. Leishmania'nın makrofaj membranlarına bağlanması, kompleman reseptörü tip 1 (CR1) ve kompleman reseptörü tip 3 (CR3) ve Desen Tanıma Reseptörleri aracılığıyla gerçekleşir. Lipofosfoglikan (LPG) ve 63 kDa glikoprotein (gp63), makrofaj-Leishmania etkileşiminde rol oynayan ana ligandlardır. Parazit ligandlarının konakçı hücre reseptörleri tarafından ilk kez tanınmasını takiben, parazitler içselleştirilir, hayatta kalır ve parazitoforlu vakuoller içinde çoğalır. Leishmania kaynaklı vakuollerin olgunlaşma süreci, monomerik G proteini Rab 5 ve Rab 7, lizozomal ilişkili membran proteini 1 (LAMP-1), lizozomal ilişkili membran proteini 2 (LAMP-2) ve mikrotübül ile ilişkili protein 1A / 1B-hafif zincir 3 (LC3) dahil olmak üzere hücre içi veziküllerden moleküllerin edinilmesini içerir.
Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle etkileşimi sırasında meydana gelen erken olayları konfokal mikroskopi kullanarak değerlendirmek için (i) bağlanma (ii) içselleştirme ve (iii) fagozom olgunlaşması dahil olmak üzere yöntemleri açıklıyoruz. Enfeksiyon sonucunun bu belirleyicilerini çevreleyen bilgi birikimine ekleyerek, Leishmania enfeksiyonunun patogenezinin anlaşılmasını geliştirmeyi ve yeni kemoterapötik hedefler için nihai arayışı desteklemeyi umuyoruz.
Giriş
Leishmaniasis, Leishmania cinsinin protozoan parazitlerinin neden olduğu, omurgalı konakçıda kutanöz leishmaniasis, mukokutanöz leishmaniasis ve viseral leishmaniasis 1 dahil olmak üzere geniş bir klinik bulgu spektrumuna neden olan ihmal edilmiş tropikal bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), bir milyardan fazla insanın risk altında olduğunu ve yılda bir milyondan fazla yeni vaka bildirildiğini tahmin etmektedir2.
Leishmania spp., monositler, makrofajlar ve dendritik hücreler dahil olmak üzere konakçı hücrelerin içinde hayatta kalan zorunlu hücre içi protozoanlardır
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Ulusal Araştırma Etik Kurulları (ID: 94648218.8.0000.0040) tarafından prosedürlerin onaylanmasını takiben sağlıklı donörlerden hücreler elde edilmiştir.
1. Hücre kültürleri
- İnsan monosit türevi makrofajlar
NOT: Makrofajlara in vitro farklılaşma için insan monosit türevi makrofajlar elde etmek için, sağlıklı donörlerden kan toplayın ve D. English ve B. R. Andersen21 tarafından tanımlandığı gibi periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC) arındırın.- Periferik kanı (50 mL) topladıktan sonra, heparinize bir tüpe dökün ve daha sonra kanı oda sıcaklığında bir fosfat tampon çözeltisinde (PBS) 1....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu rapor, CL'nin L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL formunu sunan hastalardan izole edilen L. braziliensis'in fagositozu sırasında meydana gelen erken olayları değerlendirmeyi amaçlamaktadır. konfokal mikroskopi kullanarak, parazitlerin fagositozu ile ilişkili ana olayları araştırdık: bağlanma, içselleştirme ve fagozom olgunlaşması. İlk olarak L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL bağlanmasını ve fagositozu insan monosit kaynaklı makrofajlar tarafından değerlendirdik.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Leishmania-makrofaj etkileşimi karmaşık bir süreçtir ve hastalık gelişimini etkileyebilecek birkaç adım içerir5. Opsonize edilmemiş Leishmania ve konakçı hücrelerin etkileşiminde yer alan mekanizmaları daha iyi anlamak için, Leishmania enfeksiyonunun erken ve geç evrelerinden fagositozu değerlendirmek için konfokal floresan mikroskobu kullanan bir protokol tanımladık. İmmünoetiketleme ve floresan etiketli proteinlerin ekspresyonu da dahil olmak üzere hücre biyolojisi mek.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama veya analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu. Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.
Teşekkürler
Gonçalo Moniz Enstitüsü, Fiocruz Bahia, Brezilya ve mikroskopi bölümüne yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma INOVA-FIOCRUZ numarası 79700287000 tarafından desteklenmiştir, P.S.T.V. CNPq'dan (305235/2019-2) araştırmalarda verimlilik için bir hibeye sahiptir. Plazmidler Mauricio Terebiznik, Toronto Üniversitesi, CA tarafından nazikçe sağlandı. Yazarlar, İngilizce revizyonu ve el yazması kopya düzenleme yardımı için Andris K. Walter'a teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2-merkaptoetanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-konjuge keçi anti-tavşan IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios site yok | |
| anti-LC3 antikoru | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Sığır serum albümini (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Kırmızı (CMTPX) Boya | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrí fuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Siprofloksasin | Isofarma | X | |
| CO2 inkübatörü | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Konfokal floresan mikroskobu (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Floresan mikroskobu (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamisin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamin | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N-2-hidroksietil piperazin-N'-2-etan-sülfonik asit) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH < alt > 4 < / alt > Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal keçi serumu | Sigma | NS02L | |
| Nükleofektör 2b Cihazı | Lonza | AAB-1001 | |
| Nükleofektör çözeltisi | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehit | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol miristat asetat (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Fosfat tampon çözeltisi (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Altın Antifade kiti | Yaşam Teknolojileri | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta | boy Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider'in Böcek ortamı | Sigma | S0146 | |
| Sodyum bikarbonat | Sigma | S5761 | |
| Sodyum piruvat | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Kaynaklar
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1(201....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
