Trowell tipi organ kültürü yöntemi, diş gelişimini yöneten karmaşık sinyal ağlarını çözmek ve daha yakın zamanlarda, sürekli büyüyen fare kesici dişinin kök hücrelerinde yer alan düzenlemeleri incelemek için kullanılmıştır. Floresan muhabir hayvan modelleri ve canlı görüntüleme yöntemleri, dental kök hücrelerin ve bunların spesifik niş mikro çevrelerinin derinlemesine analizini kolaylaştırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Trowell Tipi Organ Kültürünün Diş Kök Hücrelerinin Düzenlenmesini Incelemek İçin Kullanılması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Organ gelişimi, işlevi ve yenilenmesi, kök hücre nişleri adı verilen ayrı anatomik boşluklarda bulunan kök hücrelere bağlıdır. Sürekli büyüyen fare kesici dişi, dokuya özgü kök hücreleri incelemek için mükemmel bir model sağlar. Kesici dişin epitel dokusuna özgü kök hücreleri, dişin proksimal ucunda, servikal döngü adı verilen bir niş içinde bulunur. Dişin kendiliğinden keskinleşen ucunun sürekli aşınmasını dengelemek için sürekli bir hücre akışı sağlarlar. Burada, kök hücreleri ve nişlerini barındıran fare kesici dişinin proksimal ucunun izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu, doku parçalarının (eksplantlar) in vitro kültürünün yanı sıra metal bir ızgara tarafından desteklenen bir filtre üzerindeki sıvı/hava arayüzündeki kalın doku dilimlerini sağlayan modifiye edilmiş bir Trowell tipi organ kültürü protokolüdür. Burada açıklanan organ kültürü protokolü , in vivo olarak mümkün olmayan doku manipülasyonlarına olanak tanır ve floresan muhabir (ler) in kullanımı ile birleştirildiğinde, kök hücreler de dahil olmak üzere zaman içinde canlı dokulardaki ayrık hücre popülasyonlarının tanımlanması ve izlenmesi için bir platform sağlar. Bu sistemde çeşitli düzenleyici moleküller ve farmakolojik bileşikler, kök hücreler ve nişleri üzerindeki etkileri açısından test edilebilir. Bu sonuçta kök hücre düzenleme ve bakımını incelemek için değerli bir araç sağlar.
Giriş
Fare kesici dişleri, diş bileşenlerinin kesintisiz üretimini destekleyen kök hücrelerin (SC) ömür boyu korunması nedeniyle sürekli büyür. Bunlar, diğer hücrelerin yanı sıra emaye üreten ameloblastlar üreten epitel SC'leri ve dentin üreten odontoblastlar üreten mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) içerir1. Sürekli büyüyen kesici dişlerdeki epitel SC'leri başlangıçta etiket tutucu hücreler 2,3 olarak tanımlandı ve o zamandan beri Sox24 de dahil olmak üzere bir dizi iyi bilinen kök genini ifade ettiği gösterildi. Bu hücreler, diğer organlardaki epitel SC'leri ile orta....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol hayvanların kullanımını içerir ve tüm prosedürler Helsinki Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Etik Kurulları ve Hayvan Tesisi tarafından onaylanmıştır.
1. Organ kültürü yemeğinin hazırlanması
- Tüm prosedürleri laminer bir akış davlumbazında gerçekleştirin. Çalışma yüzeylerini %70 etanol ile temizleyin ve otoklavlanmış cam aletler ve çözeltiler kullanın. Makası ve diğer metal ekipmanları bir cam boncuk sterilizatöründe sterilize edin.
- Etanol çıkarmak için normalde %70 etanolde depolanan filtreleri, 1x PBS'de üç kez yıkayarak hazırlayın (Şekil 1). Filtreleri dikdörtgen par....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Epitel SC'leri, kesici dişin proksimal ucunda bulunan servikal döngü adı verilen bir niş içinde bulunur (Şekil 3A). Servikal döngüler, gevşek düzenlenmiş epitel hücrelerinin bir çekirdeği olan stellat retikulumu çevreleyen iç ve dış emaye epitelinden oluşan morfolojik olarak farklı yapılardır (Şekil 3B, C). Her kesici dişte iki servikal döngü vardır (Şekil 3A), ancak sadece labial servikal döngü SC'leri içerir. Epit.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İn vitro organ kültürü, organ büyümesini ve morfogenezi yöneten endüktif potansiyeli ve epitelyal-mezenkimal etkileşimleri incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Thesleff laboratuvarı, Trowell tipi organ kültürünün Saxén modifikasyonunun nasıl uyarlanacağını ve diş gelişimini incelemek için nasıl kullanılacağını göstermiştir14. Floresan muhabirlerindeki tekrarlanabilir koşullar ve ilerlemeler, bunu diş morfogenezini ve içindeki farklı hücre popülasyonlarını izlemek için yararlı bi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma Jane ve Aatos Erkko Vakfı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 mL plastik şırıngalar | |||
| Terumo | |||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu | Gibco | 14287 | |
| Ekstra İnce Bonn Makası | FST | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS Güney Amerika (CE) | LifeTechn. | 10270106 | aliquotes'a bölün, -20°'de saklayın; C |
| Cam boncuk sterilizatörü, Steri 250 Saniye Sterilizatör | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptid) | Gibco | 35050-038 | |
| İzopor Polikarb.Filtreler, 0,1 um 25 mm çapında | MerckMillipore | VCTP02500 | Oda sıcaklığında% 70 etanolde saklayın. |
| L-Askodik Asit | Sigma | A4544-25g | , MilliQ'da 100 mg / ml seyreltilmiş, filtre strerilize edilmiş ve 20&mu'ya bölünmüş; l aliquotes, karanlıkta sakla, -20&�; C |
| Düşük erime noktalı agaroz | TopVision | R0801 | |
| Metal ızgaralar | Ticari olarak temin edilebilir veya paslanmaz çelik ağdan kendi kendine üretilmiştir (korozyona dayanıklı, ağ boyutu 0,7 mm). Yaklaşık 30 mm çapında bir disk kesin ve kenarlarını 3 mm yükseklik verecek şekilde bükün. Delik açmak için çivi kullanın. | ||
| Mikro forseps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehit | Sigma-Aldrich | ||
| Penisilin-Streptomisin (10.000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri kapları, Soda-Kireç camı | DWK Yaşam Bilimleri | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, havalandırmalı | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, havalandırmasız klasik | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Küçük makas |
Kaynaklar
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch a....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
