Yöntem makalesi

HiBiT Tabanlı Bir Biyoreporter Kullanılarak SARS-CoV-2 Reseptör Bağlayıcı Etki Alanı Antikorunun Tespiti

DOI:

10.3791/62488

⸱

12 Ağustos 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Biotechnology, University of Tehran

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özetlenen protokol, HiBiT-reseptör bağlayıcı etki alanı protein kompleksinin üretilmesi prosedürünü ve SARS-CoV-2 antikorlarının hızlı ve hassas tespiti için uygulanmasını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

COVID-19 pandemisinin ortaya çıkması, şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2'nin (SARS-CoV-2) epidemiyolojik etkisini belirlemek için daha iyi serolojik tespit yöntemlerine olan ihtiyacı artırmıştır. SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının sayısının artması, daha iyi antikor tespiti testlerine olan ihtiyacı artırmaktadır. Mevcut antikor algılama yöntemleri hız için hassasiyeti tehlikeye atmaktadır veya hassastır ancak zaman alıcıdır. SARS-CoV-2 nötralize edici antikorların büyük bir kısmı SARS-CoV-2'nin birincil immünojenik bölmelerinden biri olan reseptör bağlayıcı etki alanını (RBD) hedef alıyor. Sars-CoV-2 antikorlarını tespit etmek için son derece hassas, biyolüminesan etiketli bir RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) tasarladık ve geliştirdik. Aşağıdaki metinde HiBiT-RBD kompleksini üretme prosedürü ve bu aracı kullanarak RBD hedefleme antikorlarının varlığını değerlendirmek için hızlı bir test açıklanmaktadır. HiBiT-RBD protein ürününün çok çeşitli sıcaklıklar üzerindeki dayanıklılığı ve 1 saat içinde tamamlanabilen daha kısa deneysel prosedür nedeniyle, protokol hasta serum örneklerinde SARS-CoV-2 antikorlarını tespit etmek için daha verimli bir alternatif olarak düşünülebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sars-CoV21 adlı yeni bir koronavirüsün ortaya çıkışı, 30 Mart 20212 itibarıyla 2 milyon 800 binden fazla can kaybına ve 128 milyon enfeksiyona neden oldu. SARS-CoV-2 klinik tedavileri için güvenilir ve köklü bir tedavi prosedürünün olmaması nedeniyle, daha fazla viral bulaşmayı kısıtlamak ve daha da önemlisi etkili ve sağlam bir tedavi veya aşı geliştirmek için birçok çaba yapılmıştır3. Bugüne kadar, Dünya Sağlık Örgütü tarafından bildirilen çalışmalarda 50'den fazla COVID-19 aşı adayı var4. SARS-CoV-2'ye karşı antikorların tespiti, aşının ve COVID-195'in iyileşmiş hastalarında, humoral yanıtın uzun vadeli stabilitesini belirlemek için son derece önemlidir. Bazı çalışmalar, iyileşen SARS-CoV-2 hastalarının 1 yıl sonra RBD bağlayıcı antikorların çoğunu kaybetme olasılığının olduğunu göstermiştir5,6,7,8,9. Kalıcı bağışıklığı daha iyi anlamak için daha fazla araştırma yapılması gerekir ve daha hassas antikor tespit platformları bu tür çalışmaların daha fazla yapılmasına yardımcı olabilir. Uzun süreli antikor yanıtları öneren hafif SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının sürekli bağışıklığı raporları da ilginç ve değerli bir çalışma alanıdır. Popülasyondaki bağışıklık hakkında daha fazla bilgi sağlamak için bireylerin serasındaki antikorların izlenmesi için hızlı ve doğru bir tespit yöntemi gereklidir.

Diğer koronavirüsler gibi SARS-CoV-2 de viral ve hücre zarlarının füzyonuna yol açan olayların bir basamaklarını başlatmak için anjiyotensin dönüştürücü enzim-2'ye (ACE2) bağlanmak için çıkıntılı başak glikoproteini kullanır6,7. Son zamanlarda yapılan çeşitli çalışmalar, Spike proteininin RBD'sinin SARS-CoV28,9,10,11'e karşı güçlü ve spesifik antikor yanıtının ortaya çıkarırken çok önemli bir role sahip olduğunu kanıtlamaktadır. Özellikle, Premkumar ve ark. tarafından RBD bağlayıcı antikor titresi ile hastaların plazmasının SARS-CoV-2 nötralizasyon gücü arasında gözlenen korelasyonlar, RBD'nin virüs yapısının immünojenik bir bölmesi olmasıyla tutarlıdır9. Bunu göz önünde bulundurarak, SARS-CoV-2 antikor tespiti için mevcut birçok tanı testi zaman ve maliyet yoğundur, uzun bir kuluçka ve yıkama prosedürü gerektirir (enzime bağlı immünosorbent testi [ELISA]) veya hassasiyet ve doğruluktan yoksundur (lateral akış immünoassay [LFIA])12. Bu nedenle, YÜKSEK hassasiyet, hızlı yanıt ve nispeten düşük maliyetli COVID-19 türevi antikor tespitinin nicel ve hızlı bir tamamlayıcı serolojik yöntemi, SARS-CoV-2 epidemiyolojik gözetimi için güvenilir bir serolojik test ihtiyacına hizmet edecektir.

Toplu olarak, mevcut serolojik tahlillerin sınırlamaları, biyolüminesan raporlama sisteminin gelecekteki serosurveylerde potansiyel bir tanı ajanı olarak araştırılmasına neden oldu. Biyolüminesans, ışık emisyonu ile doğal olarak oluşan bir enzim / substrat reaksiyonudur. Nanoluc luciferaz en küçük (19 kDa), ancak Renilla ve firefly luciferase (sırasıyla 36 kDa ve 61 kDa) ile karşılaştırıldığında en parlak sistemdir 13,14. Ayrıca, Nanoluc daha önce bahsedilen sistemler arasında gürültü oranına ve stabilitesine en yüksek sinyale sahiptir. Nanoluc'un yüksek sinyal yoğunluğu, çok düşük miktarlarda muhabir füzyonlarının bile algılanmasını destekler15. Nanoluc İkili Teknolojisi (NanoBiT), nanoluc sisteminin iki segmenti olan bölünmüş bir versiyonudur: küçük BiT (11 amino asit; SmBiT) ve nispeten düşük benzeşimli etkileşimlere sahip büyük BiT (LgBiT) (KD = 190 μM) bir lüminesan kompleksi oluşturmak için16. NanoBiT, protein-protein etkileşimlerinin tanımlanmasını içeren çeşitli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır15,17,18,19 ve hücresel sinyal yolları11,20,21.

Son zamanlarda, LGBiT'ye belirgin şekilde daha yüksek bir benzeğe sahip başka bir küçük peptit (KD = 0.7 nM), yani SmBiT yerine HiBiT Nano-Glo sistemi tanıtıldı. Nano-Glo "ekle-karıştır-oku" testinin yüksek benzeşimi ve güçlü sinyali, HiBiT'i uygun, nicel, parlak bir peptit etiketi yapar. Bu yaklaşımda, HiBiT etiketi minimum yapısal parazit uygulayan bir yapı geliştirilerek hedef proteine eklenir. HiBiT-protein füzyonu aktif olarak LgBiT muadili'ne bağlanacak ve algılama reaktiflerinin varlığında tespit edilebilir biyolüminesans üretmek için son derece aktif bir luciferaz enzimi üretecektir (Şekil 1). Benzer şekilde, SARS-CoV-2'nin kurtardığı bireylerin serasında nötralize edici antikor titresini kolayca ölçmek için HiBiT Nano-Glo tabanlı bir sistem geliştirdik ve yakın zamanda HiBiT etiketli bir SARS-CoV-2 RBD geliştirdik. Bu makalede, standart laboratuvar prosedürleri ve ekipmanları kullanılarak HiBiT-RBD biyoreporterinin üretilmesine ilişkin protokol açıklanmaktadır ve bu biyoreporterin SARS-CoV-2 RBD hedefleme antikorlarını tespit etmek için hızlı ve verimli bir testte nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Aşağıda açıklanan protokol, 20200371-01H protokol koduna göre tüm etik kurallara uyar.

1. HiBiT-RBD biyo-raporlayıcının üretimi ve değerlendirilmesi

  1. Yeterli miktarda HiBiT-RBD biyoreporter üretmek
    1. Hücre kültürüne hazırlanın
      1. %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin/streptomisin içeren tam Dulbecco modifiye Eagle ortasını (DMEM) hazırlayın. Ardından, medyayı 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
      2. Biyolojik güvenlik kabinini (BSC) açın ve kabin yüzeyini sterilize etmek için% 70 v/ v etanol kullanın.
    2. Hücre satırını kültüre edin.
      1. Hücre hattını -80 °C veya sıvı azottan çıkar ve 37 °C'lik bir su banyosunda çözün.
        NOT: Uygun bir hücre hattının kültürde bakımı kolaydır, yüksek transfeksiyon verimliliğine sahiptir ve eksojen protein üretimi için uygundur. Bu protokol için insan embriyonik böbreği, HEK293 hücreleri kullanılmıştır.
      2. Çözülmüş hücreleri en az 10 mL tam orta ile karıştırın, hücre süspansiyonunu 10 cm Petri kabına pipetlayın ve tabaktaki hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı döndürün. Yemeği 37 °C, %5 CO2 ve %85-95 nemde bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
      3. Mikroskop altındaki hücreleri, izdiah seviyesi% 80-90'a ulaşana kadar gözlemleyin. Yüksek izdiahta, ortamı çıkarın, hücreleri ılık fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücreleri yüzeyden ayırmak için% 0.25 tripsin-etilenediamin tetraasetik asit 1 mL ekleyin.
        NOT: HEK293 hücreleri oldukça kolay bir şekilde ayrılır. Bu nedenle, yıkama adımı yanlışlıkla kopma ve hücre kaybını önlemek için çok nazikçe yapılmalıdır.
      4. Yaklaşık 5 dakika sonra, mikroskop altındaki hücrelere bakın. Tüm hücreler yüzüyorsa, en az 4 mL orta ekleyin ve hücre süspansiyonu yeni bir steril tüpe aktarın. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve transfeksiyon için 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 1 × 106 hücre ekleyin.
        NOT: 24 saat sonra hücreler %80 veya daha fazla bir arada olmalıdır.
    3. HiBiT-RBD plazmidinin transfeksiyon
      1. Uygun bir transfeksiyon reaktifi ile HiBiT-RBD ekspresyon plazmidinin 1 μg'sını kullanın. Oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından toplam hacmi plakanın her kuyusuna damla açısından ekleyin.
        NOT: Üreticinin transfection protokolünü izleyin. Bu durumda, DMEM'deki seyreltilmiş plazmidin (1 μg) DMEM ile transfeksiyon reaktifinin bir karışımı (belirli bir miktar) eklenmiştir ( bkz. Malzeme Tablosu). Transeksiyon verimliliğini izlemek için kontrol olarak (örneğin, yeşil floresan protein [GFP]) plazmid içeren bir işaretleyici kullanın.
      2. Ertesi gün, transfeksiyon karışımını içeren ortamı tam ortamla değiştirin. Transeksiyondan 48 saat sonra transfeksiyon kontrolünü iyi gözlemleyin.
        NOT: Transfeksiyon pozitif ve verimliyse (%80'den fazla GFP pozitif), hücreler HiBiT-RBD biyo-raporlayıcının toplanmasına hazır olmalıdır. Yapı ayrıca, toplam süpernatant yerine saflaştırılmış protein elde etmek için kullanılabilecek His etiketini de içerir.
      3. Süpernatant'ı 1,5 mL mikrotüplerde toplayın. Hücrelere 500 μL 1x pasif lizis tamponu (PLB) ekleyin; hücre lizisi için oda sıcaklığında plakayı 15 dakika kuluçkaya yatırın ve sallayın.
        NOT: Süpernatant ve lilat çözeltisi -20 °C'de en az 6 ay boyunca küçük bütünlük kaybı ile korunabilir. Azad ve ark.22'ye göre, muhabir çok çeşitli pH (4-12) ve sıcaklıkta (4-42 °C) stabildir.
  2. Biyoreporterden gelen lüminesan sinyalin luciferaz tahlili ile değerlendirilmesi
    1. Reaksiyon bileşenlerinin hazırlanması
      1. Süpernatant'ı biyo-raporlayıcının kaynağı olarak kullan.
        NOT: Hem süpernatant hem de lisat HiBiT-RBD biyo-raporlayıcı içerir ve test için kullanılabilir. Ancak, aşağıdaki notlarda açıklanan nedenlerden dolayı kaynak olarak süpernatant önerilir.
      2. LgBiT'yi seyreltin ve kullanmadan önce 1x'e kadar substratı seyreltin (stok konsantrasyonu 100x'tir).
        NOT: LgBiT hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın.
    2. Luciferase tahlil
      1. Süpernatant'ın 50 μL'sini her bir kuyudan veya tüpten 96 kuyu plakasına aktarın ve her kuyuya 50 μL 1x LgBiT ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
      2. Luminometre yazılımını açın, her kuyuya 50 μL 1x substrat (furimazine) ekleyin, plakayı luminometreye yerleştirin ve yazılımı çalıştırın.
        NOT: Sinyal ölçümünden önce aktif enzimler tarafından substrat tüketimini önlemek için plakayı okumadan hemen önce substratı ekleyin.

2. Anti-RBD antikorlarının hızlı ve hassas bir testle tespiti

  1. HiBiT-RBD antikor tespit testi
    1. Protokolün bölüm 1.1'inde açıklandığı gibi HiBiT-RBD biyo-raporlayıcıyı hazırlayın.
      NOT : Proteinin olgun glikosilatlı versiyonunu toplamak ve içermesi daha basit olduğu için aşağıdaki test için süpernatantın kullanılması önerilir. Ayrıca, lysate HiBiT-RBD-antikor etkileşimini etkileyebilecek birkaç proteine daha sahiptir.
    2. HiBiT-RBD içeren süpernatant'ın 50 μL'sini 1,5 mL mikrotüpte 1 μg ticari SARS-CoV-2-RBD antikor ile birleştirin. Çözeltiye 20 μL immünoglobulin bağlayıcı protein (protein G) ekleyin. PBS ekleyerek toplam hacmi 300 μL'ye getirin.
      NOT: Karışımın toplam hacmi 150 μL'ye düşürülebilir.
    3. Tüpleri bir tüp çalkalayıcı veya rotator üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. 30 s için 12.000 × g'da santrifüj, süpernatantı atın ve PBS ile yıkayın. Ücretsiz HiBiT-RBD'yi kaldırmak için işlemi üç kez tekrarlayın. 50 μL PBS'de yeniden dirildi ve 96 kuyu plakasına aktarın.
    4. 50 μL 1x LgBiT ekleyin ve 5 dakika bekleyin. Ardından, 50 μL 1x NanoLuc substrat ekleyin. Işıklı işaretini hemen bir luminometre ile okuyun.

3. Hasta serum örneklerinden SARS-CoV-2 spesifik antikorların yüksek verimli tespiti

  1. Protokolün bölüm 1.1'ini izleyerek yüksek verimli bir test için daha büyük miktarlarda HiBiT-RBD biyo-raporlayıcı hazırlayın.
  2. 20 μL manyetik protein G ile 50 μL HiBiT-RBD süpernatantını her numune için 96 kuyu plakasında birleştirin. Her kuyuya 10 μL serum örneği ekleyin ve PBS ekleyerek toplam hacmi 150 μL'ye getirin.
    NOT: Adım 2.1.2'de açıklandığı gibi 1 μg/mL konsantrasyonda hem spesifik olmayan IgG (negatif kontrol) hem de nötralize SARS-CoV-2 antikorunu (pozitif kontrol) kullanın. Ayrıca, aşılanmış farelerden alınan serum örnekleri de antikorlar için değerlendirilebilir. Bu testte, Serum örnekleri Ottawa Hastanesi Genel Kampüsü'nden onaylanmış bir prosedürle ve bireylerin bilgilendirilmiş rızası ile alınmıştır.
  3. Oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 30 dakika kuluçkaya yatır. Protein G-antikor kompleksini çökeltmek için plakayı manyetik bir yıkayıcıya yerleştirin.
    NOT: Manyetik yıkayıcının özel yapısı, kompleksi her kuyunun yan duvarlarına çökeltecektir.
  4. Çözeltiyi her kuyunun orta bölümüne atın ve yıkama için PBS ekleyin. Fazla HiBiT-RBD'yi çıkarmak için yıkama adımını en az üç kez tekrarlayın. 50 μL 1x PBS ve 50 μL 1x LgBiT ekleyin. Oda sıcaklığında en az 5 dakika kuluçkaya yatır.
  5. Luminometre yazılımını hazırlayın ve ardından 50 μL 1x substrat ekleyin. Plakayı makineye yerleştirin, yazılımı çalıştırın ve sinyalleri kaydedin. Serum örneklerinden, kontrol örneklerinden ve arka plandan (boş kuyular) gelen sinyalleri karşılaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uygun protein kaynağını değerlendirmek için hem HiBit-RBD içeren hücre lysate hem de transfected hücrelerin süpernatantından gelen sinyaller kaydedildi (Şekil 2). HiBiT-RBD ve LgBit ayrı ayrı kontrol olarak kullanıldı ve veriler her iki parça birleştirildiğinde güçlü bir sinyale kıyasla düşük arka plan gösterdi. Bu nedenle, Substrat sindirimi ve biyolüminesans aktivitesi için aktif enzim üretmek için LgBiT ile HiBiT-RBD etkileşimi gereklidir (Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SARS-CoV-2 ile enfekte olan insan sayısının artması ve küresel aşılama için devam eden çaba, büyük ölçekli serosurveylerde kullanılabilecek hassas ve hızlı serolojik testler gerektirmektedir. Son araştırmalar, bölünmüş nanoluseferaz bazlı biyo-raporlayıcıların bu tür tahlilleri geliştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Yakın zamanda hasta serumunda SARS-CoV-2'ye özgü antikorları hızlı ve güvenilir bir şekilde tespit etmek için kullanılabilecek bir test tasarlamak için HiBiT-RBD biyoreporterini geliştirdik (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin ve Christiano Tanese De Souza'nın teknik yardımlarını takdir ve teşekkür ederiz. Mina Ghahremani'ye grafik tasarım için de teşekkür ederiz. Bu çalışma için katılan ve kan örneklerini bağışlayan tüm bireylere de teşekkür ederiz. DWC kısmen uOttawa Fakültesi ve Tıp Bölümü tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5x Pasif Lizis TamponuPromegaE194A30 mL
Bio-Plex El Tipi Manyetik YıkayıcıBio-Rad171020100
DMEMSigmaD6429-500ml
Dual-Glo lusiferaz Test SistemiPromegaE2940100 mL kit
Fetal Sığır Serumu (FBS)SigmaF1051
HiBiT-RBD PlazmidGcggatcgggagatcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgccgcata gttaagccagctgctccctgcttgtgtgcgctgagtagtgcgccagtagta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattatggactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc Atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtgtat tagtcatcgctatcatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtgggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatggggtttggccgtcgtaacgccgcgcgtgta cggtggggct ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca ggctctagcggcggcaacatcaaatctgtg cccattcggcgaggtgtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgtgctgtacggcgatgccgt gatcaggacagacaggcaggcaggcgccgactac aactataagctgccgccgactacgccgactac aactataagctgccgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaactactaccag gcaggctgccctgccct ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtgctgtgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgggggagatgggccatc atcaccatcaccactgatag cggccgctctagtagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgtttttgccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtcattctattctggg ggtgga gga ggctgctcgtgctctggctctgggctcctgccgggaa agaaccagctggggctctagggggctcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggtgtggtgcgccctcgggctcgccctta gggttccgatttagtgcttggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcgccacgta gtgggccatcgccctgatagacggttgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttcacactggaacactcaacctgctgctctgctgctgctcta atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtcccagcaggcaggcaagt atgcaaagcatgcatcaattagtcagcaac catagtcccgcccaactccgcccatcccgcc ccctaactcgccgcccccgcccgactaattttttttatttçagcagaggcactaattttattgcagagctagaa gtagtgaggcttggaggcctaggcttttg caaaaagctcgggggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcaacacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagg cgcccggttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacggcagcg cggctatcgtggggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcggctggctggcccgcccgccgccgcgccgcgccgccgcgcggcgcgcc Agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgggcgccggccgctctgccgctggactcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacaggacatagcgttggct acccgtgatgatgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttccgtgcgccctctcgccgcgccgcgccggccgcgccgccgccgccgccg tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccggaatcatgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccacccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttcactgcatt ctagttgtcactcaatgtat cttatcatgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtgtgaaattgtgccgctcaattccaca aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagcactcacatgcgtccactgcct gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggcgggcgctccgctcggctcgctcggctcggcgtccgtccgggtcccggtccgggtccaggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccagcaaaggccgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccggcccgcatcac aaaaatcggctcgtt tccccctgccctctcgtgcgtgtgccctgccgccctgccgcccgtt ccgaccctgccgccgccaccatacctgtccgcc tttcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagtcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcgtcgccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagctagcggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgctgaagccagtctgccaaaa ccaccgctggtagcggtttgca agcagcagattacgcgcgcaaaaaggat ctcaagaagatcctttcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatcctttt�attaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgctgtgtctgtactacgtactacactacggctgtgtagataactac gatacggggggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcaacgccagccagag ccggaagggccgagcgcaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtgtcctgtgtctgtgtcatgtcatg ccatccgtaagatgcttttgactggtgta ctcaaccaagtcattgctcgtgcgccgccgcggcgcggcgcggcggcgcggcggcgcgcggcggcgcgcggcgcggcgcgcggcgcgcgcgcggcgtcggcggcgcgcgcggcgtcggcgcggcgcgcgcggcgtcggcgtcggcggcgtcggcggcgtcgcggcgcggcgtcgcgtcgcgcggcgtcggcgt Gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttttcaccagcgtttc tgggtgaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc
LgBiTPromegaN3030
penisilin StreptomisinThermo Fisher Bilimsel
Pierce Protein G Manyetik BoncuklarThermo Fisher Scientific88848
PolyJet In Vitro DNA Transfeksiyon ReaktifiSignagenSL100688.5
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Nötralize Edici Antikor, Fare MabSinoBiological40592-MM57
Synergy Mx Mikroplaka OkuyucuBioTek96 kuyulu plaka okuyucu luminometre
Tripsin-EDTAThermo Fisher Bilimsel2520056%0.25
15140122

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
  2. Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
  3. Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514(2020).
  4. World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021).
  5. Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
  6. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  7. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215(2020).
  8. Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
  9. Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
  10. Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
  11. Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
  12. Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516(2020).
  13. Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021).
  14. Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
  15. Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
  16. Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27(2016).
  17. Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596(2019).
  18. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).
  19. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).
  20. Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
  21. Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
  22. Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

SARS CoV 2 AntikoruHiBiT BiyoreporterAntikor Tespit AnaliziBiyol minesans ReporterProtein G kt rmeL siferaz AnaliziSerum rne i AnaliziY ksek Kapasiteli AnalizNanoLuc Substrat

İlgili makaleler