Method Article

Biyomembran Kuvvet Probu Spektroskopisi ile Moleküler Yay Sabit Analizi

DOI:

10.3791/62490

⸱

November 20th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology, 5School of Aerospace, Mechanical and Mechatronic Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyomembran kuvvet probu (BFP), yerinde dinamik kuvvet spektroskopisi (DFS) tekniğidir. BFP, canlı hücreler üzerindeki moleküler etkileşimlerin yay sabitini ölçmek için kullanılabilir. Bu protokol, BFP tarafından tespit edilen moleküler bağlar için yay sabit analizi sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir biyomembran kuvvet sondası (BFP) son zamanlarda tek moleküler bağlayıcı kinetiği ölçebilen, ligand-reseptör etkileşimlerinin mekanik özelliklerini değerlendirebilen, protein dinamik konformasyonel değişiklikleri ve daha heyecan verici bir şekilde elucidate reseptör aracılı hücre mekanosensing mekanizmalarını değerlendirebilen bir yerli hücre yüzeyi veya yerinde dinamik kuvvet spektroskopisi (DFS) nanotool olarak ortaya çıkmıştır. Daha yakın zamanda, BFP moleküler bağların yay sabitini ölçmek için kullanılmıştır. Bu protokol, moleküler yay sabit DFS çözümlemesi gerçekleştirmek için adım adım yordamı açıklar. Özellikle, boncuk hücresi ve boncuk-boncuk modları olmak üzere iki BFP çalışma modu tartışılır. Bu protokol, moleküler bağın ve hücrenin yay sabitlerini DFS ham verilerinden türetme üzerine odaklanır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı hücreli bir DFS tekniği olarak, BFP bir insan kırmızı kan hücresi (RBC; Şekil 1) 0.1-3 pN/nm 1,2,3'te uyumlu bir yay sabit aralığına sahip ultra duyarlı ve ayarlanabilir bir kuvvetdönüştürücüye. Ligand-reseptör etkileşimini araştırmak için BFP, DFS ölçümlerini ~1 pN (10-12 N), ~3 nm (10-9 m) ve ~0,5 ms(10 -3 s) kuvvet, mekansal ve zamansal çözünürlük4,5'te etkinleştirir. Deneysel konfigürasyonu iki karşıt mikropipetten oluşur, yani Prob ve hedef. Prob mikropipette bir RBC'yi aspire eder ve bir boncuk, biotin-streptavidin etkileşimi yoluyla tepe noktasında yapıştırılır. Boncuk, ilgi çekici ligand ile kaplanmıştır (Şekil 1A). Hedef mikropipette, sırasıyla Boncuk Hücresi (Şekil 1B) ve Boncuk-Boncuk ( Şekil 1C ) modlarına karşılık gelen,ilgi çekiciyi taşıyan bir hücre veya boncuk aspireeder.

BFP inşaat, montaj ve DFS deneysel protokolleri daha önce ayrıntılı olarak açıklanmıştır1,6. Kısaca, bir BFP dokunma döngüsü 5 aşamadan oluşur: Yaklaşım, impinge, temas, geri çekme ve ayrışma (Şekil 1D). Yatay RBC apeks konumu ΔxRBColarak gösterilir. Başlangıçta, paysız (sıfır kuvvet) RBC deformasyonu ΔxRBC 0'dır( Tablo 1 ). Hedef daha sonra bir piezotranslator tarafından Prob boncuk üzerinde impinge ve geri çekmek için tahrik edilir (Şekil 1D). RBC probu ilk olarak Hedef tarafından negatif RBC deformasyonu ΔxRBC < 0 ile sıkıştırılır. Bir Bond olayında, Geri Çekme aşaması pozitif RBC deformasyonu Δ x RBC> 0(Şekil 2C ve D)ile bir basınçtan çekme faza geçiş yapar. Hooke yasasına göre, BFP rulman kuvveti F = kRBC × ΔxRBColarak ölçülebiliyor, burada kRBC ( Tablo1) BFP'nin RBC yay sabitidir. Bağ yırtılması ve bir dokunma döngüsünün tamamlanması üzerine, prob boncuk ΔxRBC = 0 (Şekil 1D)ile sıfır kuvvet konumuna geri döner.

kRBC'yibelirlemek için, prob mikropipette iç deliğin (Rp), RBC ( R0) ve RBC ile prob boncuk arasındaki dairesel temas alanının (Rc) radiisini ölçüp kaydederiz (Şekil 1A). Daha sonra kRBC, Evan'ın modeline göre hesaplanır (Eq.1) 7,8, BFP ' yi çalıştırmak için sanal bir enstrüman (VI) görevi görür bir LabVIEW programı kullanılarak ( ŞekilS1A)8,9.

Akışkanlar dinamiğinde kRBC için statik denge denklemi, değişkenlerin ve logaritmik terimlerin gösterilmesi. (Eş. 1)

Kurulan bir BFP ve elde edilen DFS ham verileri ile ligand-reseptör çiftinin veya hücrelerinin yay sabitinin nasıl analiz edildiğini sunuyoruz. Glikosillenmiş protein Thy-1 ve K562 hücreli integrin α 5 β1(Thy-1-α 5 β1' in etkileşimineilişkinDFSham verileri; Şekil 3A ve 3B)10 ve fibrinojen ve boncuk kaplı integrin αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Şekil 3C) 11,12 sırasıyla Boncuk Hücre ve Boncuk-Boncuk analiz modlarını göstermek için kullanılmıştır.

BFP Deneysel Hazırlık
BFP deneysel hazırlık ve enstrümantasyonunun ayrıntıları için lütfen daha önce yayınlanan protokollere bakın3. Kısacası, insan RBC karbon/bikarbonat tamponunda Biotin-PEG3500-NHS kullanılarak biyotinillenmiştir. İlgi çekici proteinler, fosfat tamponunda MAL-PEG3500-NHS kullanılarak borosilikat cam boncuklarla birlikte tanımlanmıştır. Biyotinillenmiş RBC'ye bağlanmak için, prob boncuk ayrıca MAL-SA kullanılarak streptavidin (SA) ile kaplanır. Lütfen Malzeme Masası ve Tablo 2'yebakın.

BFP'yi monte etmek için (Şekil 1, sol), prob boncuklarını teslim etmek ve RBC'nin apeksi1,3'e yapıştırmak için 'Yardımcı' olarak adlandırılan üçüncü mikropipette kullanılacaktır. SA kaplamalı prob boncuk ve biyotinilasyonlu RBC arasındaki etkileşim, ligand-reseptör bağından çok daha güçlüdür. Bu nedenle, Ayrışma aşaması, Prob boncukunun RBC'den kopuşundan ziyade ligand-reseptör bağı kopuşsu olarak yorumlanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Çözümlenebilir DFS Olayları Elde Edin

  1. BFP kontrolü ve parametre ayarı(Şekil S1A)için deneyi yazılımda (örneğin LabVIEW VI) başlatın.
  2. BFP Monitörü(Şekil S1B)yazılımında tekrarlayan prob boncuk hedef boncuk / hücre dokunuşlarını gözlemleyin.
  3. DFS yapıştırma olayının ≥% 89'unun tek bir bağ tarafından aracılık ≤ sağladığı impingement kuvvetini ve temas süresini ayarlayarak ilk 50 dokunuşta%20yapışıklık sıklığını test edin ve elde edin 12,13,14.
    NOT: Her Boncuk Hücre/Boncuk çifti için 200 tekrarlayan dokunma döngüsü gerçekleştiriyoruz. Yayınlanabilir veri kalitesi elde etmek için genellikle 3 Boncuk Boncuk veya Boncuk Hücre çifti ≥ gerçekleştiriyoruz.
    1. Verileri, BFP denetimi ve parametre ayarı için yazılım tarafından istenilen, her çiftin sonuna kadar Kullanıcı tarafından yönlendirilen klasöre Zorla ve Zaman şeklinde kaydedin.
  4. Şekil 2A'daörneklenerek Bond olaylarının Kuvvet ve Zaman ham verilerini BFP alım platformunu (Şekil S1C)kullanarak toplayın.
    1. BFP veri analizi yazılımını açın. Sarı klasör simgesine tıklayın ve ilgili ham veri dosyasını çift tıklayarak seçin.
  5. Programı çalıştırın ve olaylar arasında geçiş yapmak için yukarı ve aşağı düğmesini tıklatın. Geçersiz olayları taramak için aykırı dışlama ölçütlerini (Şekil S2)kullanın. Dışa aktarma veri türünü Zorla ve Zaman biçimi olarak seçin ve Çizim Verilerini Dışa Aktar düğmesini tıklatın.

2. Kuvvet ve Zaman Eğrisini Kuvvet ve Yer Değiştirme Eğrisine Dönüştürün

  1. Geri Çekme aşamasına karşılık gelen veri segmentini, yay sabit analiziyle ilgili bir elektronik tabloya (Şekil 2A, kare seçim çerçevesi) dışa aktarın.
  2. Elektronik tablo yazılımını kullanarak Kuvvet ve Zaman Eğrisi karşılaştırmasını çizin. Ayırmaya karşı Kuvvet eğrisini elde etmek için, zaman değerlerini piezo hareket hızıyla (yani, önceden ayarlanmış olarak 4.000 nm/sn) çarparak zaman değerlerini(Şekil 2A, x -eksen) toplam yer değiştirme değerlerine (Δxtot)dönüştürün.
  3. Alınan her yer değiştirme değerinden en küçük öteleme değerini çıkararak ilk veri noktasını sıfırla. Bu yatay dönüşüm, Geri Çekme aşamasının yükselen eğimlerini veya sonraki yay sabit hesaplamasını etkilemez.
  4. Özellikle, BFP, Δ xtot ( Tablo 1 ) RBC, ΔxRBC ( Tablo1), moleküler bağ, Δxmol ( Tablo1) ve Hedef hücre, Δxhücresi (Tablo 1), Eq. 2 olarak toplam deformasyonlarını toplayan bir seri yay sistemi olarak kabul edilir:
    Statik denge denklemi Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell, matematiksel formül. (Eş. 2)
  5. Şekil 2B'degösterildiği gibi Kuvvet (F) ve Yer Değiştirme (Δxtot) eğrisini çizin.

3. Boncuk Hücre Modunun İlkbahar Cnstant Analizi

  1. Kuvvet ve Yer Değiştirme eğrisinde, her birinin basınç fazını ve çekme fazını temsil edebileceği iki farklı eğim tanımlanabilir. Her veri grubuna bir regresyon çizgisi takın (Şekil 2B), burada daha büyük doğrusal oturma eğimi basınçlı fazda toplam yay sabitini temsil eder (Şekil 2B, kırmızı), k1 (Tablo 1) olarak gösterilir; ve daha küçük lineer oturma eğimi, tenslile fazdaki toplam yay sabitini temsil eder (Şekil 2B, mavi), k2 (Tablo 1) olarak açıklamalandırılmıştır.
  2. Adım başına seri olarak bağlanan yaylar için 2.2 açıklama, toplam yay sabitinin, ktot ( Tablo 1 ), RBC, kRBC (Tablo 1), moleküler bağ, kmol (Tablo 1) ve Hedef hücre, k hücresi (Tablo 1) bahar sabiti terslerinin toplamı olarak karşılıklı ifade edin. Boncuk Hücre modunun basınçlı fazı sırasında moleküler bağ gerilmez, bu nedenle kmol dikkate alınmaz. K tot'un bu senaryodaki karşılığı (1/k1)
    Biyolojide hücre kinetiğini temsil eden denklem; Kinetik sabitlerin diyagramı: k1, kRBC, kcell. (Eş. 3).
    Örnek verilerde, kRBC önceden belirlenir (varsayılan olarak 0,25 pN/nm). khücresi, elde edilen k 1 ve kRBC ( Şekil3B)ile Eş3'ten türetilebilir.
  3. Gerilme aşamasında ligand-reseptör çifti arasında yapıştırma oluşur. Bu senaryoda ktot'un karşılıklısını ifade edin (1/k2)
    Kinetik çalışmada kullanılan, 1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcell gösteren seri direnç denklemi. (Eş. 4)
    burada k2 (Tablo 1) çekme aşamasında toplam yay sabitini temsil eder.
  4. 1/ k1'i 1/k2'den çıkarmaktank moltüretin (Eş. 3 ile Eş. 4'ü karşılaştırın).

4. Boncuk- Boncuk Modunun Bahar Sabit Analizi

  1. k1 'i elde etmek için basınç fazı verilerine bir regresyon hattı takın (Şekil 2B, kırmızıyabenzer). Not olarak, Boncuk-Boncuk modunda, Hedef hücre, ilgi çekici ile kaplanmış bir cam boncuk ile değiştirilir (Şekil 1C). Boncuk deformasyonu ihmal edilebilir olduğundan, 1/khücre terimi Ayt. 3 ve Eş. 4'ten buna göre çıkarılabilir. Basınç fazının karşılıklı ktot 'u (1/k1)aşağıdaki gibi ifade edilebilir:
    İlişkiyi gösteren denklem: 1/k1 = 1/kRBC; Biyokimyasal analizde kinetik hız sabitleri için anahtar. (Eş. 5)
  2. k2 'yi elde etmek için çekme fazı verilerine bir regresyon çizgisi takın (Şekil 2B, maviyebenzer). Çekme fazının karşılıklı ktot 'u (1/k2)şu şekilde ifade edilebilir:
    Reaksiyon hızı denklemi, ters hız sabitleri diyagramı; Kinetik analiz için k2, kRBC, kmol terimleri. (Eş. 6)
  3. 1/ k1'i 1/k2'den çıkarmaktank moltüretin (Eq. 5 ile Eq. 6'yi karşılaştırın).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada BFP bahar sabit analizinin protokolünü ortaya koyduk. Boncuk Hücresi analiz modu için, Prob boncuk üzerine kaplanmış glikosillenmiş protein THY-1 ile HedefK562hücresinde ifade edilen 5 β1 α integrin arasındaki moleküler bağın kmol'ını analiz ettik (Thy-1-integrin α5β1; Şekil 3A) 10. Khücresi ayrıca Boncuk Hücresi modundan (K562 Hücresi; Şekil 3B

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özetle, BFP Boncuk-Boncuk ve Boncuk Hücre analiz modlarında DFS ham verilerinin ön işlemesi ve moleküler yay sabitlerinin türetilmesi için ayrıntılı bir veri analizi protokolü sağladık. Moleküler ve hücresel yay sabitlerinin belirlenmesi için gerekli biyomekanik modeller ve denklemler sunulmuştur. Farklı integrinler çalışılmış olsa da, Boncuk-Boncuk modu ve Boncuk Hücresi modu ile ölçülen kmol önemli aralık farklılıklarına sahiptir(Şekil 3A ve Şekil 3...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, mevcut çalışmayla ilgili olarak rapor edecek rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yararlı tartışmalar için Guillaume Troadec'e, donanım danışmanlığı için Zihao Wang'a ve laboratuvar girişimimizi desteklediği için Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning ve Simon Ringer'a teşekkür ederiz. Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Keşif Projesi (DP200101970 - L.A.J.), NSW Kardiyovasküler Kapasite Geliştirme Programı (Erken-Orta Kariyer Araştırmacısı Grant - L.A.J.), Sydney Araştırma Hızlandırıcı ödülü (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations tarafından desteklendi. Sağlık Yatırım Hibesi (2020HIG76 - L.A.J.), Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Fikirler Hibesi (APP2003904 - L.A.J.) ve Sydney Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Başlangıç Fonu ve Ana Ekipman Programı (L.A.J.). Lining Arnold Ju, Avustralya Araştırma Konseyi DECRA üyesidir (DE190100609).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-Merkaptopropiltrimetoksisilan (MPTMS)Uct, Spesiyaliteler, llc4420-74-0Cam boncuk işlevselleştirme
Anhy. Sodyum Fosfat Dibazik (Na2< / sub>HPO<>sub4< / sub>)Sigma-AldrichS7907Fosfat tamponu hazırlama
BFP veri toplama VILabVIEWBFP kontrolü ve parametre ayarı
BFP veri analizi VILabVIEWBFP ham veri analizi
Biotin-PEG3500-NHSJenKemA5026-1RBC biyotinilasyonu
Borosilikat Cam boncuklarDistrilab Parçacık Teknolojisi, Hollanda9002Cam boncuk işlevselleştirme
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA0336Ligand işlevselleştirme
Kamera VILabVIEWBFP izleme
D-glikozSigma-AldrichG7021Tyrode' tampon hazırlama
HepesSigma-AldrichH3375Tyrode' s tampon hazırlama
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1Cam boncuk işlevselleştirme
Potasyum Klorür (KCl)Sigma-AldrichP9541Tyrode' s tampon hazırlama
Sodyum Bikarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Karbonat/bikarbonat tampon hazırlama; Tirode' s tampon hazırlama
Sodyum Karbonat (Na2< / sub>CO3< / sub >)Sigma-AldrichS2127Karbonat / bikarbonat tampon hazırlama
Sodyum Klorür (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tyrode' tampon hazırlama
Sodyum Fosfat Monobazik Monohidrat (NaH < alt > 2 < / sub > PO < sub > 4 < / sub> ve boğa; H2O)Sigma-AldrichS9638Fosfat tamponu hazırlama
Streptavidin-MaleimideSigma-AldrichS9415Cam boncuk işlevselleştirme

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
  2. Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
  3. Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
  4. An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
  5. Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. Receptor-mediated cell mechanosensing. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).
  6. Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
  7. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
  8. Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
  9. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580(1995).
  10. Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886(2014).
  11. Passam, F., et al. Mechano-redox control of integrin de-adhesion. Elife. 7, (2018).
  12. Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
  13. Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
  14. Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
  15. Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
  16. Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
  17. Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biomembrane Force ProbeMolecular Spring ConstantDynamic Force SpectroscopySingle Molecule BindingLigand Receptor InteractionCell MechanosensingBead Cell ModeBead Bead ModeForce Versus DisplacementHooke s Law

Related Articles