Yöntem makalesi

Megakaryosit Farklılaşması ve Trombosit Oluşumunu İncelemek için Hücre Kaynağı Olarak Leukodepletion Filtreleri-Türetilmiş CD34+ Hücreler

DOI:

10.3791/62499

⸱

20 Mayıs 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1BPPS UMR-S 1255, FMTS, Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, lökofilter türevi CD34+ hematopoetik progenitörlerin elde edilmesi ve bunların kültür ortamında trombositleri serbest bırakabilen proplatelet taşıyan megakaryositlere in vitro farklılaşması ve olgunlaşması ile ilgili tüm adımları ayrıntılı olarak açıklar. Bu prosedür, megakaryopoezleri kontrol eden hücresel ve moleküler mekanizmaların derinlemesine analizi için yararlıdır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan hematopoetik progenitörlerin proplatletleri uzatabilen ve trombositleri serbest bırakabilen megakaryositlere in vitro genişlemesi ve farklılaşması, trombosit biyogenezinin altında kalan mekanizmaların derinlemesine incelenmesini sağlar. Mevcut kültür protokolleri çoğunlukla kemik iliği veya kordon kanından elde edilen hematopoetik progenitörlere dayanır ve bir dizi etik, teknik ve ekonomik endişeyi yükseltir. Periferik kandan CD34 hücreleri elde etmek için zaten mevcut protokoller varsa, bu makale kan merkezlerinde kolayca bulunan leukodepletion filtrelerinden CD34+ hücreleri elde etmek için basit ve optimize edilmiş bir protokol önermektedir. Bu hücreler, sekiz kan bağışına karşılık gelen kan transfüzyon ürünlerinin hazırlanmasında kullanılan leukodepletion filtrelerinden izole edilmiştir. Bu filtrelerin atılması gerekir. Cd34+ hücreleri olarak tanımlanan hematopoetik progenitörleri bu filtrelerden toplamak için ayrıntılı bir prosedür açıklanmıştır. Fenotipik evrimlerini tartışırken proplateletleri genişleten olgun megakaryositler elde etme yöntemi de ayrıntılı olarak açıktır. Son olarak, protokol, morfolojik ve işlevsel olarak yerel olanlara benzer trombositleri verimli bir şekilde serbest bırakmak için kalibre edilmiş bir pipetleme yöntemi sunar. Bu protokol, alttaki mekanizmaları parçalamak ve in vivo trombosit verimine yaklaşmak için sürecin çeşitli adımlarında hareket eden farmakolojik bileşiklerin değerlendirilmesi için bir temel görevi görebilirsiniz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan trombositleri, megakaryopoez (MKP) olarak bilinen sabit ve ince ayarlı bir üretim sürecinden kaynaklanan özel büyük poliploid hücrelerden, megakaryositlerden (MK) gelir. Bu sürecin en başında, kemik iliği ortamıyla temas halinde (sitokinler, transkripsiyon faktörleri, hematopoetik niş) çoğalabilecek ve hematopoetik progenitörlere (HP) dönüşebilecek ve olgunlaşmamışMK'larayol açan hematopoetik progenitörlere (HP) dönüşebilecek hematopoetik kök hücreler vardır. Çeşitli sitokinlerin ve özellikle MKP'nin ana sitokini olan trombopoietin (TPO) etkisi altında; MK daha sonra olgunlaşmanın iki ana aşamasından geçecektir: endokatoz ve sınır membranlarının (DMS) gelişimi. Bu tamamen olgun MK daha sonra sitoplazmik uzantılar yayabileceği bir sinüzoid damara yakın görünür, kan akışı altında serbest bırakılacak ve daha sonra fonksiyonel trombositler halinde yeniden şekillendirilecek proplateletler2. 19943'te TPO'nun klonlanması, HP farklılaşmasına ve MK olgunlaşmasına izin veren in vitro kültür tekniklerinin geliştirilmesini hızlandırarak MKP'nin çalışmasında bir destek sağladı.

Kan trombositlerini etkileyen birçok patoloji vardır, hem trombosit sayısı (artış veya azalma) hem de fonksiyon4,5. MKP in vitro'yu insan HP'sinden geri alabilmek, bu sürecin altında kalan moleküler ve hücresel mekanizmaların ve nihayetinde hastaların terapötik yönetiminin anlaşılmasını artırabilir.

çeşitli insan HP kaynakları uygundur: kordon kanı, kemik iliği ve periferik kan6,7,8. HP'nin periferik kandan toplanması, kordon kanından veya kemik iliğinden iyileşmelerinden daha az lojistik ve etik sorunları gündeme getirmektedir. HP lökerez veya buffy coat'dan kurtarılabilir, ancak bu kaynaklar pahalıdır ve kan merkezlerinde her zaman mevcut değildir. Daha az pahalı ve daha kolay gerçekleştirilen diğer protokoller, önceden CD34 tahrikli izolasyon4,8'egerek kalmadan insan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC' ler) doğrudan iyileşmesine izin verir. Bununla birlikte, megakaryositlerin saflığı bu yöntemle tatmin edici değildir ve MK'ye optimal farklılaşma için PBMC'den CD34+ hücre seçimi önerilir. Bu, beyaz kan hücrelerini çıkarmak ve böylece olumsuz immünolojik reaksiyonlardan kaçınmak için kan bankalarında rutin olarak kullanılan lökoredüksiyon filtrelerinden (LRF) bir HP saflaştırması uygulamamıza neden oldu9. Nitekim, 1998'den beri Trombosit konsantreleri Fransa'da otomatik olarak leukodeplet edilmiştir. Bu işlemin sonunda LRF atılır ve LRF'de tutulan tüm hücreler yok edilir. Bu nedenle, LRF'lerdeki hücreler ek ücret ödemeden kolayca kullanılabilir. LRF'ler, lökerez veya buffy coats tarafından elde edilene yakın bir hücresel içeriğe sahiptir, özellikle CD34 + HP bileşimlerinde onları son derece çekici bir kaynak10. Bir insan HP kaynağı olarak LRF, hücrelere sağlam fonksiyonel kapasiteler sağlamak için zaten gösterilmiştir11. Bu kaynak laboratuvar araştırmaları için bol ve uygun fiyatlı olma avantajına sahiptir. Bu bağlamda, bu makalede art arda açıklanmaktadır: i) CD34+ HP'nin LRF'lerden çıkarılması ve seçilmesi; ii) HP'nin megakaryositik yola olan bağlılığını ve proplatelet yayabilen MK'nın olgunlaşmasını yeniden düzenleyen iki fazlı optimize edilmiş bir kültür; iii) trombositleri bu MK'dan verimli bir şekilde serbest bırakmak için bir yöntem; ve iv) fenotipleme MK ve kültürlü trombositler için bir prosedür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrol insan örnekleri, araştırmanın yapıldığı kan transfüzyon merkezi (Etablissement Français du Sang-Grand Est) tarafından işe alınan yazılı bilgilendirilmiş onay veren volonteer kan bağışçılarından alınmıştır. Tüm prosedürler Fransa Yükseköğretim ve Araştırma Bakanlığı tarafından tescil ve onaylanmış ve AC_2015_2371 numarası altında tescil edilmiştir.Bağışçılar, numunelerin araştırma amacıyla kullanılabilmesi için CODHECO numarası AC- 2008 - 562 onay formunda onay vermiştir. Helsinki bildirgesine göre insan çalışmaları yapıldı.

1. LRF'den CD34+ hücrelerinin (HP) çıkarılması ve seçimi

  1. Reaktifin hazırlanması (bir LRF için)
    1. 25 mL filtrelenmiş elüsyon tamponu hazırlayın: 21,25 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS), 2,5 mL Asit-Sitrat-Dekstroz (ACD) ve 1,25 mL ayrışmış Fetal Sığır Serumu (FBS). 0,22 μm'ye filtreleyin ve 37 °C'ye yerleştirin.
    2. 2 mM etileniamintetraasetik asit (EDTA) ile 500 mL PBS hazırlayın.
    3. 25 mL yoğunluk degrade ortamını (DGM) (1.077 g/mL) iki adet 50 mL tüpe atın.
  2. LRF geri yıkama yöntemleri (Şekil 1)
    NOT: Bu adım, termoplastik borunun steril bağlantısını sağlayan steril bir tüp kaynak makinesi gerektirir.
    1. İlk olarak, LRF'yi boş bir 600 mL transfer çantasına ve LRF'yi bir boru setine bağlayın (Şekil 1A). Biyogüvenlik kabininin altında, ele alınan LRF sayısına (xLRF x 25 mL) karşılık gelen filtrelenmiş ve hazırlanmış elüasyon tamponunun toplam hacmini boş torbaya enjekte edin. Daha sonra, çantanın tüm içeriğini LRF'den hafifçe epire etmek için 30 mL şırıngır kullanarak, hücreleri geri fırlayın ve yeni bir 50 mL tüpe aktarın (Şekil 1B).
    2. Kırmızı kan hücrelerinin çökeltilmesine, hücre süspansiyonunu Dextran% 2 ile yarı yarıya seyreltin ve kırmızı kan hücrelerini toplamak için iyice karıştırın. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika bekleyin.

figure-protocol-1
Şekil 1: LRF geri yıkama yöntemleri. (A) (i) transfer çantasının LRF'ye steril bağlantısı ve (ii) boru LRF'ye ayarlanmıştır. (B) Hücre toplama için şırınnaların bağlantısının temsili şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. PBMC koleksiyonu
    1. Kırmızı kan hücrelerinin tortulaşmasını takiben, süpernatantı çıkarın ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve PBS-EDTA 2 mM ile doldurun. Yukarıda hazırlanmış DGM'ye süpernatantı hafifçe örtün. Yoğunluk gradyanının yüzey düzlemini kırmadan süpernatantın hafifçe akmasını sağlar. Frenleme modunda 30 dakika boyunca RT'de 400 x g'da santrifüj.
    2. PBMC katmanını tek kullanımlık transfer pipeti ile toplayın. Hücreleri her DGM tüpünden yeni bir steril 50 mL tüpe aktarın. Her tüpü PBS-EDTA 2 mM ile doldurun ve 50 mL PBS-EDTA 2 mM'de iki kez 200 x g'da RT'de 10 dakika boyunca fren modunda yıkayın.
    3. Pipet kapalı ve 50 mL PBS-EDTA 2 mM ile hücre pelet havuz.
      NOT: Toplanan hücreleri gece boyunca 4 °C'de ajitasyon altında tutarak işlemi durdurma imkanı vardır. Ardından, oluşan agregaları çıkarmak için süspansiyonu 40 μm hücre süzgeçle filtreleyin.
  2. CD34+ hücre seçimi
    1. Hücre numarasını ve santrifüjü oda sıcaklığında 400 x g'da 10 dakika boyunca mola ile belirleyin.
    2. Üstnatantı tamamen epire edin ve CD34 seçim kitinin üreticisi tarafından ayrıntılı olarak açıklanan uygun PBS-EDTA 2 mM hacminde yeniden biriktirin (108 hücre için 300 μL PBS-EDTA). FcR blokaj Reaktifini ve CD34 Mikrobeadlarını uygun konsantrasyonda ekleyin (108 hücre için 50 μL).
    3. 4 °C'de 30 dakika sonra, hücre süspansiyonu yıkayın ve CD34 seçim kitinin üreticisi tarafından ayrıntılı olarak açıklanan PBS-EDTA 2 mM'nin uygun hacminde yeniden biriktirin (108 hücre başına 500 μL).
      NOT: Seçim, sütun başına en fazla 2 x 109 hücre geçişi için sütunları sıralama üzerine yapılır.
    4. Numuneyi mıknatısın ıslak kolonunun üzerinden geçirin. 3 mL PBS-EDTA 2 mM ile iki kez yıkayın ve hücreleri 5 mL PBS-EDTA 2 mM ile elüte edin. Örneğin saflığını artırmak için aynı yordamı izleyen yeni bir sütunda ikinci bir çalışma gereklidir.
      NOT: Beklenen sayıda 6.1 x 105 hücre/LRF (Şekil 2A). Daha yüksek LRF sayıları için reaktifleri ve yöntemleri buna göre ölçeklendirin.
  3. CD34+ hücre saflığının değerlendirilmesi
    1. CD34+ seçiminden sonra elde edilen 100 μL süspansiyon, 2 μL insan CD34-PE antikoru veya 2 μL IgG - PE (kontrol) aliquot ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatır.
    2. 5 dakika boyunca 400 x g'da 2 mL PBS ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın. Tamamen aspirat süpernatant ve PBS 200 μL resuspend.
    3. Şekil 2A'da ve Tartışma 'da gösterildiği gibi akış sitometrisine göre saflığı analiz edin.






Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LRF'lerden CD34+ hücrelerinin çıkarılması ve seçimi
Burada, Peytour ve ark.9'dantüretilen yöntem, lökosit çıkarılmasından sonra kan bankalarında bulunan atılmış LRF'lerden CD34+ hücrelerin çıkarılmasını ve seçilmesini açıklar. Geri tepme prosedürünü takiben, genellikle 1.03 x10 9 ± 2.45 x 108 hücre/ LRF (Ortalama±SEM; n = 155) % 94.88 ± 0.10 canlılık ile kurtarılır (Şekil 2A i). CD34 pozitif seçimin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kan türevi HP'den proplatelet yayabilen MK üretmek ve trombositleri kültür ortamından serbest bırakmak için bir yöntem açıklanmaktadır. HP, hücresel kan ürünlerindeki kontamine lökositleri gidermek ve advers reaksiyonları önlemek için kullanılan kan bankalarının bir yan ürünü olan LRF'den elde edilir. Bu yöntem nispeten basit olmasına rağmen, birkaç nokta özel ilgiyi hak ediyor.

Hücre süspansiyonunun yoğunluk degrade ortamında (adım 1.3.1) birikmesi, karışımdan (kırmızı içerik) ka...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
7-AADBiolegend558819
ACDEFS-AlsaceNA
Anti-CD34-PE Miltenyi biotec130-081-002
Anti-CD34-PECy7eBioscience25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488Biyoefsane303724
Anti-CD42a-PEBD Biyobilim559919
ApyraseEFS-AlsaceNA
BD Trucount TüpleriBD Biyobilim340334
CD34 Mikro Boncuk Kiti UltraPure, insan Miltenyi biotec130-100-453
SantrifüjHeraeusMegafuge 1.ORVeya eşdeğer malzeme
Compteur ADAM & nbsp;DiagitalBioNAVeya eşdeğer malzeme
CryotubesDutscher55002Veya
leuconostoc spp 'den eşdeğer malzeme Dextran;Sigma31392-50gVeya eşdeğer malzeme
DMSO Hybri-max SigmaD2650
EDTA 0.5 M Gibco15575-039
Eppendorf 1,5 mL Dutscher616201Veya eşdeğeri malzeme
Filtrasyon ünitesi Steriflip PVDFMerck Millipore LtdSE1M179M6
Akış SitometresiBD BioscienceFortessa
İnsan LDLKök Hücre teknolojileri# 02698
ILOMEDINE 0,1 mg / 1 mLBayerMA038EX
UçlarFenwal R4R1401Veya eşdeğer malzeme
Laminer akış başlığı HoltenNAArşivlenmiş ürün
LS Columms Miltenyi Biotec130-042-401 
LenforepKök Hücre7861
Kalem Strep Glutamin (100x)Gibco10378-016
PBS (-)Yaşam Teknolojileri14190-169 Veya eşdeğer malzeme
PGi2SigmaP6188
Poches de transferts 600ml MacopharmaVSE4001XA
Ön Ayırma Filtreleri (30&mikro; m)Miltenyi Biotec130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)Kök hücre teknolojileri#72344
StemSpan Genişletme Takviyesi (100x)Kök hücre teknolojileri#02696
StemSpan-SFEM Kök hücre teknolojileri#09650
Stericup Durapore 0,22µ m PVDFMerck Millipore LtdSCGVU05RE
SVF Hyclone Termos ScientificSH3007103
Şırıngaları 30 mL TerumoSS*30ESE1Veya eşdeğer malzeme
Şırınga filtreleri Millex 0,22µ M PVDFMerck Millipore LtdSLGV033RB
TPOKök Hücre teknolojileri# 02822
Tüpler 50 mLSarstedt62.548.004 PPVeya eşdeğer malzeme
Tüpler 15 mL ve nbsp;Sarstedt62.554.001 PPVeya eşdeğer malzeme
TubuluresB Braun4055137Veya eşdeğer malzeme

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
  2. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  3. de Sauvage, F. J., et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand. Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).
  4. Almomani, M. H., Mangla, A. StatPearls. , (2020).
  5. Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).
  6. Delalat, B., et al. Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells. Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).
  7. Yin, T., Li, L. The stem cell niches in bone. The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).
  8. Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells. Bio-protocol. 5 (21), 1639(2015).
  9. Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy. Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).
  10. Lapostolle, V., et al. Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction. Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).
  11. Ivanovic, Z., et al. Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy. Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).
  12. Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
  13. Do Sacramento, V., et al. Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells. Scientific Reports. 10 (1), 914(2020).
  14. Blin, A., et al. Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics. Scientific Reports. 6, 21700(2016).
  15. Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
  16. Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hematopoetik Progenit rlerManyetik Boncuk Se imiAk SitometrisiYo unluk Gradyan Santrif gasyonuProplatelet UzamasPlatelet Sal n m

İlgili makaleler