Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

4.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62515

⸱

28 Temmuz 2021

 ,  ,  ,  , 
1INSERM, EFS Grand Est, Université de Strasbourg

Bu makalede

Özet

Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.

Özet

Trombositler, kemik iliğinde bulunan özel hücreler olan megakaryositler tarafından üretilir. Megakaryositleri gerçek zamanlı olarak ve doğal ortamlarında görüntüleme imkanı 10 yıldan daha uzun bir süre önce tanımlanmış ve trombosit oluşum sürecine yeni bir ışık tutmaktadır. Megakaryositler, sinüzoid damarların endotel astarı yoluyla proplatlet adı verilen uzun çıkıntıları uzatır. Bu makale, kafatası kemik iliği ve sinüzoid damarlardaki gerçek zamanlı floresan etiketli megakaryositlerde aynı anda görüntü vermek için bir protokol sürmektedir. Bu teknik, enflamatuar reaksiyonları sınırlamak için kafatasını sağlam tutan küçük bir ameliyata dayanır. Fare kafası, hareketlerin nefes almasını önlemek için kafatasına yapıştırılmış bir halka ile hareketsiz hale getirilir.

İki fotonlu mikroskopi kullanılarak, megakaryositler birkaç saate kadar görselleştirilerek sinüzoid damarların içindeki uzama sürecinde hücre çıkıntılarının ve proplatletlerin gözlemlenmesi sağlanabilir. Bu, çıkıntıların morfolojisi (genişlik, uzunluk, daralma alanlarının varlığı) ve uzama davranışları (hız, düzenlilik veya duraklama veya geri çekme aşamalarının varlığı) ile ilgili çeşitli parametrelerin ölçülmesine izin verir. Bu teknik aynı zamanda trombosit hızını ve kan akışı yönünü belirlemek için sinüzoid damarlarda dolaşan trombositlerin eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar. Bu yöntem özellikle genetiği değiştirilmiş fareler kullanarak trombosit oluşumunda ilgi çekici genlerin rolünü incelemek için yararlıdır ve farmakolojik testlere de açıktır (mekanizmaları inceleyin, trombosit üretim bozukluklarının tedavisinde ilaçları değerlendirin). In vivo ve in vitro proplatlet oluşumunun farklı mekanizmalara dayandığı bilindiği için özellikle in vitro çalışmaları tamamlamak için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Örneğin, proplatlet uzaması için in vitro mikrotübüllerin gerekli olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, in vivo, esas olarak kan akış kuvvetleri tarafından teşvik edilen bir iskele olarak hizmet ederler.

Giriş

Trombositler kemik iliğinde bulunan megakaryositlere özel hücreler tarafından üretilir. Megakaryositlerin dolaşımdaki trombositleri serbest bırakmasının kesin yolu, kemikten gerçek zamanlı olayları gözlemlemedeki teknik zorluk nedeniyle uzun süre belirsiz kalmıştır. İki fotonlu mikroskopi bu zorluğun üstesinden gelmeye yardımcı oldu ve trombosit oluşum sürecini anlamada büyük ilerlemelere yol açtı. İlk in vivo megakaryosit gözlemleri 2007 yılında von Andrian ve meslektaşları tarafından yapıldı, floresan megakaryositlerin kafatasından görselleştirilmesiile 1. Bu mümkündü, çünkü genç yetişkin farelerin frontoparietal kafatasındaki kemik tabakası birkaç on mikron kalınlığa sahiptir ve alttaki kemik iliğindeki floresan hücrelerin görselleştirilmesine izin vermek için yeterinceşeffaftır 2.

Daha sonra yapılan çalışmalarda proplatelet oluşumunun çeşitli koşullar altında değerlendirilmesi ve alttaki mekanizmaların deşifre edilmesi için 3 ,4,5,6. Bu çalışmalar, megakaryositlerin proplatlet adı verilen çıkıntıları sinüzoid damarların endotel bariyeri yoluyla dinamik olarak genişlettiklerine dair kesin kanıtlar sağlamıştır(Şekil 1). Bu proplateletler daha sonra hacim olarak birkaç yüz trombosit temsil eden uzun parçalar olarak serbest bırakılır. Trombositler, özellikle akciğerlerde olmak üzere aşağı akış organlarının mikrosirkülasyonunda proplateletlerin yeniden şekillendirilmesinden sonra oluşacaktır7. Ancak bugüne kadar kesin süreç ve moleküler mekanizmalar tartışılmaya devam etmektedir. Örneğin, sitoskeletal proteinlerin proplatletlerin uzamasındaki önerilen rolü in vitro ve in vivo koşullar arasında farklılık gösterir3ve proplatlet oluşumundaki farklılıklar enflamatuar koşullar altında gösterilmiştir6. İşleri daha da karmaşık hale getiren, yeni bir çalışma proplatelet güdümlü konsepte itiraz etti ve in vivo, trombositlerin esasen megakaryosit seviyesinde bir membran tomurcuklama mekanizması ile oluştur olduğunu önerdi8.

Bu makale, canlı farelerde kafatası kemiğinden kemik iliğindeki megakaryositlerin ve proplatletlerin minimal invaziv bir prosedür kullanılarak gözlemlenmesi için bir protokol sunun. Benzer yaklaşımlar daha önce hematopoetik kök ve progenitör hücreler başta olmak üzere diğer ilik hücrelerini görselleştirmek içintanımlanmıştır 9. Burada, özellikle proplatlet morfolojileri ve trombosit hızı olmak üzere ölçülebilen bazı parametreleri detaylandırmak için megakaryositlerin ve trombositlerin gözlemlenmesi üzerinde durulmaktadır. Bu protokol, floresan izleyiciler ve ilaçlar enjekte etmek ve kafatası kemiğinden gözlemlemek için şahdamarına bir kateterin nasıl yerleştirılacağını sunar. Kalvarial kemik küçük bir ameliyat kullanılarak maruz kalır, böylece kemiğe bir halka yapıştırılır. Bu halka, başı hareketsiz hale getirmek ve nefes almaya bağlı hareketleri önlemek ve lensin daldırma ortamı olarak tuzlu su dolu bir bardak oluşturmak için hizmet eder. Bu teknik i) sinüsoid geometrisini ve damar duvarı ile etkileşime giren megakaryositleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için çok uygundur; ii) proplatlet oluşumu, uzama ve salınım sürecinde megakaryositleri takip edin; ve iii) karmaşık sinüzoid kan akışını izlemek için trombosit hareketlerini ölçmek. Bu protokol kullanılarak elde edilen veriler yakın zamanda yayımlanmıştır3.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Avrupa standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi 2010/63/EU ve CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Hayvan Tesisi sözleşmesi N°: G67-482-10, proje anlaşması N°: 2018061211274514).

1. Farelerin hazırlanması ve şahdamarına kateter yerleştirilmesi

NOT: Burada, erkek veya dişi, 5-7 haftalık mTmG muhabir fareleri kullanıldı (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) Pf4-girit fareleri11ile geçti , megakaryositlerde ve trombositlerde yoğun yeşil floresan etiketlemesine izin verdi12. Deneye başlamadan önce, mikroskobun ısıtma odasını birkaç saat önceden ısıtın.

  1. Fareyi görüntüleme odasına taşıyın ve anesteziye devam edin.
    1. Fareyi ketamin (100 μg/g) ve ksilazin (10 μg/g) (5 μL/g) çözeltisinin intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile uyuşturun.
      NOT: Ketamin/ksilazinin tekrarlanan yönetimi burada kullanılır ve iyi çalışır, ancak düzenli reenjeksiyon için kaydın kesilmesini gerektirir. Alternatif olarak, bir anestezi makinesi varsa, anestezi indüksiyonu ketamin/ ksilazin ile yapılabilir ve daha sonra gazların solunması altında tutulabilir (izofluran, hava ve oksijen karışımı).
    2. Hayvanı derin anesteziye ulaşana kadar kafesinde değiştirin. Fareyi sonraki tüm manipülasyonlar için 37 °C'de ısıtılmış ısıtılmış bir tabağa yerleştirin.
      NOT: Hayvan derin anesteziye ulaşırken, mikroskobu ve tüm ekipmanları çalıştırın (bölüm 4.1'e bakın) ve ameliyat yapıldıktan sonra deneye başlamak için gereken farklı parametreleri ayarlayın (bkz. bölüm 4.2). Burada, prosedür sadece 3 saat sürer ve terminaldir. Fare, deneyden sonra uyanmadan ötenaziye tabir edilir. Bu nedenle, cilt ve aletler için etanol dezenfeksiyonı yeterlidir. Bununla birlikte, kurumsal yönergelere bağlı olarak veya prosedür daha uzun sürecekse, betadin / povidone ve alkol içeren üç alternatif önlük gibi daha eksiksiz dezenfeksiyon yöntemleri kullanılmalıdır.
  2. Şahdamarına bir kateter takın.
    NOT: Ameliyat sırasında mikrobiyal kontaminasyondan mümkün olduğunca kaçınmak önemlidir. Ameliyata devam etmeden önce cildi % 70 etanol (EtOH) ile dikkatlice dezenfekte etmeye özen edin. Her zaman sterilize makas ve cımbız kullanın ve düzenli olarak% 70 EtOH'da durulayın. Temiz bir yerde çalışın ve yüz maskesi takın. İntravenöz enjeksiyon için plastik bir tüpün içindeki bir iğneden oluşan 22 G'lik "iğnenin üzerinde" kateter kullanılır (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Fareyi sırtına yerleştirin ve ön bacakları boğazı germek için cerrahi bantla sabitleyin (Şekil 2A). Boğazı% 70 etanol ile dezenfekte edin.
      NOT: Kolaylık sağlamak için ameliyattan önce boğaz tıraş edilebilir. İşlem daha uzun sürerse, uygun aseptik teknik için dikkatli tıraş yapılmalıdır.
    2. Steril makas kullanarak sağ veya sol şahdamarı üzerinde 0,7-1 cm'lik bir kesi yapın. Dış şahdamarını ve pektoral kasın üst kısmını ortaya çıkarmak için bitişik bağ dokusunu uzatın (Şekil 2A).
    3. Kateteri ılık, steril fizyolojik salin ile doldurun. Göğüs kasına nüfuz ettikten sonra kateteri damara yerleştirin (Şekil 2B).
      NOT: Kateterin içindeki hava kabarcıklarından kaçınmaya özen edin. Kas bir sıkıştırma noktası oluşturacağından kanamayı önlemek için kateterin kastan yerleştirilmesi önemlidir. Itgb3-/- fareler gibi hemostaz defektleri olan fareler bile bu yaklaşımla kateter takılması üzerine kanamaz.
    4. İğneyi yavaşça çıkarın ve gerekirse kateteri damarın daha derinlerine dikkatlice hareket ettinin. Şırınnayı bağlayın ve bir damla cerrahi yapıştırıcı ( Malzeme Masası ) ekleyerek kateteri stabilizeetti.
      NOT: Damar daha küçük bir kalibreye sahip olduğu için biraz pratik gerektirse de kuyruk damarına kateter takmak mümkündür. Bu, kuyruk damarı neredeyse hiç görünmeyen koyu saçlı fareleri kullanırken özellikle zordur. Daha büyük kalibresi nedeniyle, kateterin şahdamarı içinde konumlandırılması, daha büyük hacimlerde veya tekrarlanan tedavilerin daha güvenilir bir şekilde enjekte edilmesine izin verebilir. Şırındıcın ilk kez ılık salinle doldurduğunu lütfen unutmayın ve ilaç çözeltisini enjekte etmeden önce ölü hacmi enjekte etmeyi unutmayın.
    5. Fareyi dikkatlice eğilimli bir konuma getirin (Şekil 2C). Kuruluğu önlemek için gözlere jel (Malzeme Tablosu) uygulayın.

2. Kranial halkanın ameliyatı ve montajı

NOT: Fare kurulumu için tam destek 4 adet, bir blok ve bir plaka, fare kafasını tutmak için halka ve halkayı bloğa sabitlemek için bir vidadan oluşur (Şekil 3A). Desteğin tüm unsurları 3D baskı ile i.materialise.com elde edilmiştir. Plaka akrilonitril bütadien stiren (ABS) polimer, paslanmaz çelik blok ve vida ve yüksek dereceli paslanmaz çelik halka (yüksek ayrıntılı paslanmaz çelik) yapılmıştır (Bkz. Boyutlar için Ek Şekil S1 ve 3D baskı dosyaları için Ek Malzemeler). Blok, vidalı veya yapıştırılmış olarak desteğe kalıcı olarak sabitlenir. Halka fare kafatasına sabitlendikten sonra, blok tutucuya vidalanmalıdır (Şekil 3A).

  1. Saç derisindeki saçları dezenfeksiyon için% 70 etanol ile ıslanmış bir kağıt havlu ile nemlendirin. Tüm gevşek saçları ıslak bir kağıt havlu ile çıkarın.
    NOT: Kolaylık sağlamak için ameliyattan önce kafa derisi tıraş edilebilir.
  2. Kalvarium'u steril ince makas ve cımbız kullanarak ortaya çıkarmak için orta çizgide 1 cm'ye kadar ve kulakların arasında bir T oluşturarak kafa derisini kuluçkaya yatırın.
    NOT: Halka ön ve parietal kemikler üst üste gelecek şekilde konumlandırılacaktır (Şekil 3B).
  3. Kafatasını ortaya çıkarmak için steril cımbız kullanın. Periosteumu makas ve cımbızla dikkatlice çıkarın. Görüntülemeyi değiştirebilecek tüm periosteumu ve herhangi bir döküntüyü veya saçı çıkarmak için fizyolojik salin ile ıslatılmış steril bir pamuklu çubuk kullanın.
    NOT: enflamatuar reaksiyonları sınırlamak için kemiğe zarar vermemeye çok dikkat edin.
  4. Salin ile durulayarak kan izlerini çıkarın ve kemiği kuru bir pamuklu çubukla hızla kurutun. Tutkal jelini halkaya uygulayın, açıkta kalan kemiğe yerleştirin ve halkanın kafatasına sıkıca tutturulması için birkaç saniye saklayın.
    NOT: Gözlem alanına istenmeyen otofluoresansa yol açabileceği için tutkal girmemelidir.
  5. Kafatasını fizyolojik saline batırılmış pamuklu çubukla hafifçe nemlendirin.
  6. 1:1 mavi ve sarı bileşenleri dikkatlice karıştırarak silikon diş macunu hazırlayın. Görüntüleme sırasında sızıntıyı önlemek için sızdırmazlık için halkanın etrafına diş macunu uygulayın. Halkaya girmiş olabilecek herhangi bir diş macunu veya yapıştırıcıyı dikkatlice çıkarın.
  7. Yüzüğü tuzlu suyla doldurun ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
    NOT: Salin, mikroskop hedefi için daldırma aracı görevi görür. Hemostazla ilgili kusurları olan fareler kullanırken kanama daha kritik olabilir. Daha fazla görüntülemeyi bulanıklaştırabileceğinden kanın halkaya girmesini önlemek önemlidir.
  8. Fareyi desteğin üzerine yerleştirin ve halkayı blok tutucuya vidala(Şekil 3C). Başı kaldırmak ve yüzüğün kafatasından kopmasını önlemek için hayvanın başının altına katlanmış kompres yerleştirin.
    NOT: Kafa, nefes alma nedeniyle görüntü hareketlerini önleyecek şekilde doğrudan sabitlenir.
  9. Destek ve fare tertibatını ısıtılmış mikroskop haznesindekonumlandırın (Şekil 3D).
    NOT: Takılan kateteri herhangi bir zamanda yerinden çıkarmamaya dikkat edin.

3. Anestezi yapılan farelerin deney sonuna kadar takibi

NOT: Anestezi, 5 μL/g vücut ağırlığı hacminde ve ketamin.c (50 μg/g) ve kslazin (5 μg/g) (1,2 μL/g) karışımında ketin (25 μg/g) enjeksiyonlarının değiştirilmesiyle her 35 dakikada bir yeniden indüklendirilir. Isıtılmış mikroskop odasının edinim sırasında açılması mümkün olmadığı için anestezik izleme, anestezinin tekrar yapılmasından önce ve sonra parmak sıkışması ile gerçekleştirilir. Benzer şekilde, her yeni video kaydına başlamadan önce parmak sıkışması gerçekleştirilir.

  1. Gerekirse, s.c. enjeksiyonu ile alımı durdurun ve anesteziyi yeniden teşvik edin.
    1. Fare kafasını hareket ettirmemeye dikkat etmenin, sırtın derisini sol elin başparmağı ve işaret parmağı arasında kıstırın. Deri altı anesteziyi sağ eli kullanarak arka cildin kıvrımlarına enjekte edin (veya solaklar için tam tersi).
  2. Halkada salin olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse taze salinle doldurun. Sonraki 35 dakika boyunca kayda devam edin ve kayıt süresi boyunca benzer şekilde devam edin.
  3. Deneyin sonunda, fareyi uyanmadan önce servikal çıkık ile ötenazi yapın.
    NOT: Fare, yerel etik ve hayvan refahı komitesi ile aynı fikirde olarak maksimum 3 saat boyunca uyuşturulur.

4. İki fotonlu görüntüleme

NOT: Mikroskop ve ilgili ekipman hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın. Görüntüler rezonans tarayıcı (12 veya 8 kHz) ile kaydedildi. Pikseller her iki yönde de kaydedildikçe hız alımını artırmak için çift yönlü mod kuruldu; bu nedenle, fazdaki herhangi bir uyumsuzluk kontrol paneli "faz düzeltme" ile düzeltilmelidir. Son olarak, satın alma hızı ile sinyal-gürültü oranı arasında bir uzlaşma olarak uyarlanmış bir ortalama kuruldu.

  1. Lazer ve rezonans tarayıcı da dahil olmak üzere iki foton mikroskobu kapatın (çıkış lazer gücü genellikle lazere bağlı olarak ~1.8-2.5 W).
  2. Seçilen floroforlar için uygun lazer dalga boylarını ayarlayın. Yayılan ışıkların geri kazanımı için uygun dalga boylarını ayarlayın.
    NOT: Burada, AlexaFluor-488 ve Qtracker-655'i aynı anda heyecanlandırmak ve tespit etmek için sırasıyla 913 nm dalga boyu ve hibrit dedektörler (500-550 nm ve 575-625 nm) kullanıldı.
  3. İntrajuguler kateteri kullanarak, vaskülatları etiketlemek için floresan izleyiciyi enjekte edin (Qtracker-655; Malzeme Masası). Maksimum 150 μL/deney için saatte bir yenilenen 0,2 μM'de bir çözeltinin 50 μL/faresi enjekte edin.
    NOT: Yüksek moleküler ağırlıklı dektran1gibi diğer izleyiciler kullanılabilir. Bu durumda, kan viskozitesi dekstran ile değiştirilebilir ve bazı hemoheolojik parametreleri değiştirebilirsiniz.
  4. Mikroskop aşamasını destek ve fare ile mikroskop hedefinin altına yerleştirin. Yüzüğün her zaman tuzlu suyla dolu olup olmadığını kontrol edin ve hedefi daldırin. Sinüzoid damarlar boyunca hizalanmış kemik iliği damarlarını (kırmızı) ve megakaryositlerin (yeşil) varlığını bulmak için epifluoresans kullanın.
    NOT: Kafatası kemiği 100 μm2'dendaha düşük bir kalınlığa sahiptir. İlik kemiğin altında bulunur ve floresan yeşil megakaryositler ve Qtracker-655 ile etiketlenmiş yoğun kırmızı anastomozlu sinüzoid damarlar tarafından kolayca tanınır.
  5. Uzun satın almalar (megakaryositler, proplateletler)
    1. İlgi çekici bölgeyi arayın. Yukarıda belirtildiği gibi görüntü alma parametrelerini uygulayın.
    2. Uzun alımlar için (örneğin, proplatelet oluşumunun veya uzamasının görselleştirilmesi), 8 kHz rezonans tarayıcı kullanarak optimize edilmiş aralıklarla (genellikle 0,85 ila 1,34 μm arasında) z yığını görüntüler elde edin.
      NOT: 12 kHz rezonans tarayıcı alım hızını artırabilir.
    3. Tüm megakaryosit ve tekneyi görselleştirmek için 384 x 384 piksel görüntü alın. İyi çözünürlükte hızlı alım için istenildiği gibi hat ortalamasını kullanın. Proplatelet görselleştirme için genellikle 10 s veya 30 s olmak üzere görüntü yığını alımının zaman aralığını belirleyin.
      NOT: Burada, 8 kHz rezonans tarayıcı ile 1 görüntü/10 sn elde etmeyi sağlayan daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için ortalama 8 hat kullanıldı. Canlı edinme sırasında hat ortalamasına izin verildiğine emin olun.
  6. Kısa ve hızlı alım (trombositler)
    NOT: Trombosit hızı gibi hızlı olayların daha kısa sürede eldeılması için kare alma oranını en üst düzeye çıkarmak önemlidir. Uygun alım türünün seçilmesi, kare alım hızını (örneğin, "xyt" alan-zaman alım türü) optimize edecektir.
    1. Simge durumuna küçültün (örneğin, 256 x 90 piksel) ve gerekirse görüntüleme alanını döndürerek görüntü boyutunu damara ayarlayın.
    2. Mevcut en yüksek tarama hızını kullanın.
    3. Çift yönlü tarama kullanın.
      NOT: Çift yönlü tarama için fazın iyi ayarlandığından emin olun.
    4. Görüntü tanımı ve edinmenin hızlılığı arasındaki en uygun uzlaşmayı bulmak için çizgi ortalamasını en aza indirin.
      NOT: Trombosit hızı ölçümleri için, elde edinme hızını artırmaya yardımcı oluyorsa pikselleştirilmiş bir görüntü yeterli olabilir.
    5. Edinme hızlılığını artırmak için z yığınını en aza indirin. Trombosit hızını ölçmek için yalnızca 1 z yığını elde etmek yeterlidir. Trombosit hızını ölçmek için 10-20 s'ye alın.
      NOT: 12 kHz rezonans tarayıcı ile bu koşullar kullanılarak en fazla 133 kare/sn elde edilebilir. Parametreler koşullara uyarlanmalıdır. Bazı gemilerde trombosit hızı, trombosit hızını bu ayarlarla güvenilir bir şekilde ölçmek için çok yüksektir.
  7. Proplatelet genişliği ve uzunluğu ölçümü
    NOT: Leica yazılımında elde edilen LIF dosyalarını ImageJ ile yüklemek için, önce Bio-Formats Importer'ı kullanmak üzere ImageJ'e LOCI eklentisini indirip yükleyin.
    1. Proplatelet genişliği
      1. Filmi ImageJ ile açın. Genişlik ölçümü yapmak için, sadece proplateletlerin filmini kapsız kullanın. Farklı kanalları ayırmak için Görüntü'ye tıklayın| Kanalları renklendir ve Böl 'useçin.
      2. Z yığını filmi için Görüntü'ye tıklayarak her zaman noktası için ortalama bir z-projeksiyonu yapın| Yığınlar ve Z Projesi 'niseçin. Projeksiyon türü için, ortalama Yoğunlukgirin.
      3. Gürültüyü kaldırmak için görüntüyü tedavi edin. İşlem'e tıklayarak arka planı çıkarın| Arka planı çıkarın ve Yuvarlanan top yarıçapını uygulayın: 50,0 piksel. İşlem ve Düzgünleştir 'e tıklayarak görüntüyü pürüzsüzleştirin.
      4. Proplatetin tabanına yakın bir çizgiyi takip edin (megakaryosit yakınında, başka bir nesneden kaçınarak).
        NOT: Analiz Et ve Ölçeği Ayarla 'ya tıklayarak istenen birimdeki değeri elde etmek için görüntünün ölçeğini ayarlamayıunutmayın. Varsayılan olarak, görüntünün birimi piksel cinsindendir.
      5. Yoğunluk profilini çizin, gauss eğrisini takın ve Tam Genişliği Yarım Maksimum (FWHM) olarak hesaplayın. Bunun için, Eklentiler'e tıklayarak aşağıdaki komut dosyasını bir makroya yazın| Yeni'yi seçin ve Makro'yu tıklatarak çalıştırın| Makro çalıştır: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("Gaussian",x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * kare( 2 * log(2) ) * sigma; yazdır(FWHM).
        NOT: Hat taramasında proplatelet yoğunluğuna karşılık gelen tek bir tepe noktası olduğundan emin olun.
      6. Proplatetin ortalama genişliğini elde etmek için 1 dilim üzerinde 4.7.5 adımında açıklanan veya zaman içinde tekrarlanan eylemleri gerçekleştirin
    2. Proplatelet uzunluğu
      1. Proplatlet boyunca, megakaryosit'e yakın tabandan üste doğru bir çizgi takip edin. Proplatelet şeklini izlemek için parçalı bir çizgi kullanın. Her zaman noktası için tekrarlayın.
      2. Yatırım Getirisi Yöneticisi'ni kullanarak her satırı kaydetmeyi unutmayın: Analiz | tıklayın Araçlar'ı seçin ve Yatırım Getirisi Yöneticisi'ni seçin. Bir klasördeki tüm satırları kaydetmek için Seçimi Kaldır'daki Yatırım Getirisi Yöneticisi'ni | Daha fazla ve tıklayın Kaydet. Yatırım Getirisi Yöneticisi'nden, sonuçlar tablosundan her satırın uzunluk değerini (Ölçü) ayıklayın.
        NOT: Analiz Et ve Ölçeği Ayarla'ya tıklayarak istenen birimlerdeki değeri elde etmek için görüntünün ölçeğini ayarlamayı unutmayın. Varsayılan olarak, görüntünün birimi piksel cinsindendir.
  8. Trombosit hızı ölçümü
    NOT: Trombosit hızı, geminin içinde 10-20 sn'nin üzerinde akan floresan trombositlerin video kaydından hesaplanır. Döngüsel olarak tekrarlanan hat tarama verilerini elde etmek için ilk görüntü tedavisi gerçekleştirilir. Hareket, açısı hıza bağlı olan çizgilere yol açar ve hesaplanmasına izin verir. Burada hız, klasik Tekil Değer Ayrışması (SVD) yöntemi15'tendaha sağlam olan Radon dönüşümünü kullanan bir yöntemle hesaplanmıştır.
    1. ImageJ ile görüntü muamelesi
      1. Filmi ImageJ ile açın. İşlem | tıklayarak Gauss Bulanıklaştırma filtresi uygulama Filtreler, Gauss Bulanıklığı'nın öğesini seçin ve Sigma (Yarıçapı): 2,00uygulayın. Akışı ölçmek için küçük bir bölge seçin ve akış yönünü izleyen 3 bitişik çizgiyi izleme.
        NOT: Analiz | tıklayarak yatırım getirisi yöneticisini kullanarak her satırı kaydetmeyi unutmayın Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi. Her satırı eklemek ve kaydetmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi penceresinde Ekle'yi tıklatın; Seçimi Kaldır | önce tıklayın daha fazla ve sonra Tıklayın Kaydet.
      2. ImageJ hat tarama yazılımını kullanarak, Resim | tıklayarak her satır için bir kimograf oluşturun Yığınlar; Yeniden Kaydır'ı seçin ve aşağıdaki parametreleri uygulayın: Çıkış aralığı (mikronlar): 1.000 / Dilim sayısı: 1 / İnterpolasyondan kaçının. Elde eden uzay-zaman görüntülerini kaydedin.
        NOT: Elde eden görüntü, zaman içinde kan akışındaki trombositlerin doğrusal hareketine karşılık gelen çizgileri gösterir. Bir çizginin açısı hızın bir işlevidir.
    2. Matlab veya GNU Octave yazılımı kullanarak hız ölçümü
      NOT: Kan akışındaki trombositlerin hızı, Drew ve işbirlikçileri tarafından açıklanan Radon dönüşümüne dayanan bir hesaplama analizi yöntemi kullanılarak uzay-zaman görüntülerinden tahmin edilmektedir15. Bu matematiksel yöntemin açıklaması bu incelemenin kapsamı dışındadır ve okuyucu, hesaplama15ile ilgili ayrıntılar için Drew ve ark. Hem Matlab kodu hem de daha fazla bilgi https://www.drew-lab.org/code web sitelerinde mevcuttur.
      1. Matlab veya GNU Octave yazılımını kullanarak kodu açın.
        NOT: Kod, istenen çalışmaya göre adaptasyon gerektirebilir.
      2. Değeri, aynı kap kısmında çizilen bitişik çizgilere karşılık gelen 3 uzay-zaman görüntüsünden çıkarın. Geminin bu kısmı için ortalama trombosit akış hızı değerini hesaplayın.
        NOT: Sonucu doğru ölçü birimine (örneğin, μm/s) dönüştürmeyi unutmayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak, floresan izleyici Qtracker-655, kafatası kemik iliğindeki anastomoz ilik sinüzoid damarlarını ve okların tasvir ettiği akış yönünü görüntülemek için intravenöz olarak uygulandı (Şekil 4A, sol). mTmG fareleri kullanılarak, eGFP floresan trombositler her gemi dalında 20 sn'nin üzerinde kaydedildi ve hızları ImageJ ve GNU Octave yazılımı kullanılarak ölçüldü (Şekil 4A, sağ). Akış hızı ve yönündeki heterojenliğe dikkat edin. Sinüzoid damarl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Trombosit oluşum mekanizmaları kemik iliği ortamına oldukça bağlıdır. Bu nedenle intravital mikroskopi, süreci gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için sahada önemli bir araç haline gelmiştir. Floresan megakaryositli fareler, Cre rekombinazını megakaryositlerde ifade eden fareleri koşullu floresan gen ifade kaseti içeren herhangi bir floxed muhabir fare ile geçerek elde edilebilir. Burada, mTmG muhabir fareleri kullanıldı (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) Pf4-cre fareler

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, laboratuvarda tekniği kurduğumuz dönemde iki fotonlu mikroskopi deneyleri konusundaki uzman tavsiyeleri için Florian Gaertner'e (Avusturya Bilim ve Teknoloji Enstitüsü), IGBMC /CBI Görüntüleme Merkezi'ndeki (Illkirch, Fransa) Yves Lutz'a ise uzmanlığı ve iki foton mikroskobu konusundaki yardımı için teşekkür ediyor. Ayrıca jean-Yves Rinkel'e teknik yardımı için ve Ines Guinard'a şekil 1'deki şemanın çizimi için teşekkür ederiz. ARMESA'ya (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) iki foton mikroskobun satın alınmasındaki desteği için teşekkür ederiz. AB, Etablissement Français du Sang (APR2016) ve Agence Nationale de la Recherche'den (ANR-18-CE14-0037-01) doktora sonrası burslarla desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
GNU Oktav yazılımıGNU Projesihttps://www.gnu.org/software/octave/
  Histoakril 5 x 0, 5 mLBraun1050052enjekte edilebilir cerrahi yapıştırıcı çözeltisi
HyD hibrit dedektörler Leica Microsystems 4tunesLeica Microsystems
ImageJGNU projesiGereken minimum sürüm
Imalgene/Ketamin 1000 fl/10 mLBoehring03661103003199göz koruması
25x su objektifi, 0.95 Leica Microsystems sayısal açıklığı ile donatılmış Leica SP8 MP DIVE mikroskobu,AlexaFluor-488 ve Qtracker-655'in aynı anda uyarılması
03700454505621Silikon diş macunu mavi ve sarı
Picodent twinsin hızıRotec13001002
Qtracker 655 vasküler etiketInvitrogenQ21021MPenjekte edilebilir çözelti
Rezonans tarayıcı, 8 veya 12 kHz
Rompun Xylazine %2 fl/25 mLBayer04007221032311
Süper yapıştırıcı jelYüzüğü kemiğe yapıştırmak için
Surflo IV kateter - Mavi 22 GTerumoSR-OX2225C1
Ti:Saph darbeli lazer (Tutarlı) (femtosaniye)Tutarlı
Matlab MathWorks https://www.mathworks.com/ Ocrygel 10 g Laboratoires T.V.M.

Kaynaklar

  1. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
  2. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
  3. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
  4. Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
  5. Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
  6. Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
  7. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  8. Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206(2020).
  9. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683(2014).
  10. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  11. Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
  12. Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
  13. Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361(2012).
  14. Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127(2017).
  15. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  16. Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
  17. Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
  18. Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
  19. Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
  20. Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).
  21. Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).
  22. Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12(2018).
  23. Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
  24. Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Megakaryosit G r nt lemeProplatelet Olu umuSin zoid DamarlarTrombosit H zIn Vivo MikroskopiFloresan zleyicilerKemik li i CerrahisiKan Ak Kuvvetleri
In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.