Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi
Bu makalede
Özet
Özet
Trombositler, kemik iliğinde bulunan özel hücreler olan megakaryositler tarafından üretilir. Megakaryositleri gerçek zamanlı olarak ve doğal ortamlarında görüntüleme imkanı 10 yıldan daha uzun bir süre önce tanımlanmış ve trombosit oluşum sürecine yeni bir ışık tutmaktadır. Megakaryositler, sinüzoid damarların endotel astarı yoluyla proplatlet adı verilen uzun çıkıntıları uzatır. Bu makale, kafatası kemik iliği ve sinüzoid damarlardaki gerçek zamanlı floresan etiketli megakaryositlerde aynı anda görüntü vermek için bir protokol sürmektedir. Bu teknik, enflamatuar reaksiyonları sınırlamak için kafatasını sağlam tutan küçük bir ameliyata dayanır. Fare kafası, hareketlerin nefes almasını önlemek için kafatasına yapıştırılmış bir halka ile hareketsiz hale getirilir.
İki fotonlu mikroskopi kullanılarak, megakaryositler birkaç saate kadar görselleştirilerek sinüzoid damarların içindeki uzama sürecinde hücre çıkıntılarının ve proplatletlerin gözlemlenmesi sağlanabilir. Bu, çıkıntıların morfolojisi (genişlik, uzunluk, daralma alanlarının varlığı) ve uzama davranışları (hız, düzenlilik veya duraklama veya geri çekme aşamalarının varlığı) ile ilgili çeşitli parametrelerin ölçülmesine izin verir. Bu teknik aynı zamanda trombosit hızını ve kan akışı yönünü belirlemek için sinüzoid damarlarda dolaşan trombositlerin eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar. Bu yöntem özellikle genetiği değiştirilmiş fareler kullanarak trombosit oluşumunda ilgi çekici genlerin rolünü incelemek için yararlıdır ve farmakolojik testlere de açıktır (mekanizmaları inceleyin, trombosit üretim bozukluklarının tedavisinde ilaçları değerlendirin). In vivo ve in vitro proplatlet oluşumunun farklı mekanizmalara dayandığı bilindiği için özellikle in vitro çalışmaları tamamlamak için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Örneğin, proplatlet uzaması için in vitro mikrotübüllerin gerekli olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, in vivo, esas olarak kan akış kuvvetleri tarafından teşvik edilen bir iskele olarak hizmet ederler.
Giriş
Trombositler kemik iliğinde bulunan megakaryositlere özel hücreler tarafından üretilir. Megakaryositlerin dolaşımdaki trombositleri serbest bırakmasının kesin yolu, kemikten gerçek zamanlı olayları gözlemlemedeki teknik zorluk nedeniyle uzun süre belirsiz kalmıştır. İki fotonlu mikroskopi bu zorluğun üstesinden gelmeye yardımcı oldu ve trombosit oluşum sürecini anlamada büyük ilerlemelere yol açtı. İlk in vivo megakaryosit gözlemleri 2007 yılında von Andrian ve meslektaşları tarafından yapıldı, floresan megakaryositlerin kafatasından görselleştirilmesiile 1. Bu mümkündü, çünkü genç yetişkin farelerin frontoparietal kafatasındaki kemik ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri Avrupa standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi 2010/63/EU ve CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Hayvan Tesisi sözleşmesi N°: G67-482-10, proje anlaşması N°: 2018061211274514).
1. Farelerin hazırlanması ve şahdamarına kateter yerleştirilmesi
NOT: Burada, erkek veya dişi, 5-7 haftalık mTmG muhabir fareleri kullanıldı (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) Pf4-girit fareleri11ile geçti , megakaryositlerde ve trombositlerde yoğun y....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol kullanılarak, floresan izleyici Qtracker-655, kafatası kemik iliğindeki anastomoz ilik sinüzoid damarlarını ve okların tasvir ettiği akış yönünü görüntülemek için intravenöz olarak uygulandı (Şekil 4A, sol). mTmG fareleri kullanılarak, eGFP floresan trombositler her gemi dalında 20 sn'nin üzerinde kaydedildi ve hızları ImageJ ve GNU Octave yazılımı kullanılarak ölçüldü (Şekil 4A, sağ). Akış hızı ve yönündeki heterojenliğe dikkat edin. Sinüzoid damarl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Trombosit oluşum mekanizmaları kemik iliği ortamına oldukça bağlıdır. Bu nedenle intravital mikroskopi, süreci gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için sahada önemli bir araç haline gelmiştir. Floresan megakaryositli fareler, Cre rekombinazını megakaryositlerde ifade eden fareleri koşullu floresan gen ifade kaseti içeren herhangi bir floxed muhabir fare ile geçerek elde edilebilir. Burada, mTmG muhabir fareleri kullanıldı (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) Pf4-cre fareler
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, laboratuvarda tekniği kurduğumuz dönemde iki fotonlu mikroskopi deneyleri konusundaki uzman tavsiyeleri için Florian Gaertner'e (Avusturya Bilim ve Teknoloji Enstitüsü), IGBMC /CBI Görüntüleme Merkezi'ndeki (Illkirch, Fransa) Yves Lutz'a ise uzmanlığı ve iki foton mikroskobu konusundaki yardımı için teşekkür ediyor. Ayrıca jean-Yves Rinkel'e teknik yardımı için ve Ines Guinard'a şekil 1'deki şemanın çizimi için teşekkür ederiz. ARMESA'ya (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) iki foton mikroskobun satın alınmasındaki desteği için teşekkür ederiz. AB, Etablissement Français du Sang (APR2016) ve Agence Nationale de la Recherc....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| GNU Oktav yazılımı | GNU Projesi | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoakril 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | enjekte edilebilir cerrahi yapıştırıcı çözeltisi |
| HyD hibrit dedektörler Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU projesi | Gereken minimum sürüm | |
| Imalgene/Ketamin 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | göz koruması |
| 25x su objektifi, 0.95 Leica Microsystems sayısal açıklığı ile donatılmış Leica SP8 MP DIVE mikroskobu, | AlexaFluor-488 ve Qtracker-655'in aynı anda uyarılması | ||
| 03700454505621 | Silikon diş macunu mavi ve sarı | ||
| Picodent twinsin hızı | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vasküler etiket | Invitrogen | Q21021MP | enjekte edilebilir çözelti |
| Rezonans tarayıcı, 8 veya 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine %2 fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Süper yapıştırıcı jel | Yüzüğü kemiğe yapıştırmak için | ||
| Surflo IV kateter - Mavi 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph darbeli lazer (Tutarlı) (femtosaniye) | Tutarlı |
Kaynaklar
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
