Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kemik İliği Türevi Mast Hücre Kültürü için Kristal Nanoselüloz Gömülü Agarose Biyomalzeme Mürekkep İmalatı

2.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62519

⸱

11 Mayıs 2021

 ,  ,  , 
1Nanotechnology Research Center, National Research Council Canada, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

Bu makalede

Özet

Bu protokol, hücre yüzeyi reseptörlerinin, Kit'in (CD117) ve yüksek benzeşimli IgE reseptörlerinin (FcφRI) hücre canlılığı ve fenotipik ekspresyumu açısından fare kemiğinden türetilmiş mast hücreleri ile kristal nanoselüloz (CNC)/agarose kompozit hidrojel biyomalzeme mürekkebinin biyouyumluluğunu hızla değerlendirmek için bir yöntemi vurgulamaktadır.

Özet

Üç boyutlu (3D) biyobaskı, bir desende biriken hidrojel bazlı kompozitleri (veya biyomalzeme mürekkepleri) kullanır ve hücrelerin biriktirdiği bir substrat oluşturur. Birçok biyomalzeme mürekkede birincil hücreler için potansiyel olarak sitotoksik olabileceğinden, bu hidrojel kompozitlerin maliyetli 3D doku mühendisliği süreçlerinde kullanılmadan önce biyouyumlarını belirlemek gerekir. Biyobaskı da dahil olmak üzere bazı 3D kültür yöntemleri, hücrelerin bir 3D matrise gömülmesini gerektirir, bu da hücrelerin mekanik hasar vermeden canlılık ve biyobelirteç ifadesindeki değişiklikler için çıkarılmasını ve analizini zorlaştırır. Bu protokol, hücre canlılığı ve biyobelirteç ifadesi için akış sitometrik tahlilleri kullanılarak fare kemiğinden türetilmiş mast hücreleri (BMMC' ler) ile 24 kuyulu bir kültür sistemine üretilen kristal nanoselüloz (CNC) gömülü agarose kompozitin biyouyumluluğunu değerlendirmek için bir yöntem olan kavram kanıtı olarak tanımlanmaktadır.

CNC/agarose/D-mannitol matrisine 18 saat maruz kaldıktan sonra, BMMC canlılığı propidiyum iyodür (PI) geçirgenliği ile ölçüldüğü gibi değiştirilmedi. Bununla birlikte, CNC /agarose/D-mannitol substratında kültürlenen BMMC'lerin, yüksek benzeşimli IgE reseptörü (FcφRI) ve kök hücre faktörü reseptörü (Kit; CD117), biyoink kompozitteki CNC miktarına bağlı görünmese de. BMMC'lerin uygulanabilirliği, fibriller nanoselüloz (FNC) ve sodyum aljinattan oluşan ticari bir biyomalzeme mürekkede 3D ekstrüzyon biyobaskı kullanılarak üretilen hidrojel iskelelere zaman seyri maruziyetinin ardından da değerlendirildi. 6-48 saat süren bir süre boyunca, FNC/aljinat substratları, akış sitometrisi ve mikroter tahlilleri (XTT ve laktat dehidrogenaz) ile belirlenen BMMC'lerin yaşayabilirliğini olumsuz etkilemedi. Bu protokol, aday biyomalzeme mürekkeplerinin yararları için biyokimyasal uyumluluğunu, mast hücreleriyle baskı sonrası tohumlama için 3D iskeleler olarak hızlı bir şekilde taramak için etkili bir yöntem açıklar.

Giriş

Son zamanlarda 3D kültür sistemlerine ve 3D biyobaskıya olan ilgi, hidrojel ve hidrojel kompozitlere odaklanmıştır. Bu kompozitler viskoz ama gözenekli biyomimetik görevi görmekte ve biyolojik dokularla karşılaştırılabilen ağırlık olarak %99'a kadar su içeriğinden oluşabilir1,2,3. Hidrojel kompozitlerin bu özellikleri, hücrelerin canlılıklarını ve işlevlerini etkilemeden büyümesine izin eder. Bu kompozitlerden biri, hidrojel kompozitlerde takviye malzemesi olarak kullanılan kristal nanoselülozdur (CNC), biyomalzeme implantların geliştirilmesinde hücre iskeleleri ve iki boyutlu (2D) ve 3D in vitro hücre kültüründe4,5. Çoğunlukla, CNC'den oluşan matrisler insan kornea epitel hücrelerine aşırı derecede sitotoksik değildir6, bağırsak epitel hücreleri7, insan kemik iliği türevi mezenkimal kök hücreler8 veya nöron benzeri hücreler9. Bununla birlikte, insan kemik iliği türevi mezenkimal kök hücrelerin metabolik aktivitesi ve çoğalması, ahşap bazlı nanoselüloz kompozitlerin artan viskozitesi ile korelasyonda azalır ve matrisin bileşiminin hücre fonksiyonları üzerindeki zararlı etkileri için dikkatlice test edilmesi gerektiğini düşündürmektedir8.

Benzer şekilde, CNC, 3D immün hücre kültürü sistemlerinde ciddi sonuçlar doğurabilecek içselleştirme üzerine makrofajlarda inflamatuar yanıtlara neden olabilir10,11. Aslında, CNC'nin diğer bağışıklık hücresi yanıtlarını, özellikle mast hücreleri tarafından başlatılan alerjik inflamatuar yanıtları nasıl etkileyebileceğine dair çok az veri vardır. Mast hücreleri, alerjenlere enflamatuar yanıtları aktive etmekten sorumlu yüksek benzeşimli IgE reseptörü FceRI'yi ifade eden granül lökositlerdir. Çoğalmaları ve farklılaşmaları, tirozin reseptörü Kit'i bağlayan kök hücre faktörüne (SCF) bağlıdır. Mast hücreleri dolaşıma giren ve daha sonra tüm insan dokularında her yerde dağılmak için periferik olarak göç eden kemik iliği progenitör hücrelerinden türetilir12. Mast hücreleri 3D doku ortamında işlev görürken, in vitro 3D doku modellerinde immünolojik süreçleri incelemek için ideal bir bağışıklık hücresi adayıdır. Ancak bugüne kadar mast hücrelerini içeren uygulanabilir in vitro 3D doku modeli bulunmamaktadır.

Mast hücrelerinin son derece hassas doğası ve dış uyaranlara pro-enflamatuar yanıtlar verme eğilimleri nedeniyle, daha fazla tartışıldığı gibi, 3D matris bileşenlerinin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi ve mast hücrelerinin 3D iskeleye sokulması için biyobaskı yöntemi gereklidir. Doku yapıları biyomalzemelerin iki geniş kategorisinden yani biyoinks ve biyomalzeme mürekkeplerinden biyofabrik olarak yapılabilir. Biyoinkslerin hücre yüklü hidrojel kompozitler olması, biyomalzeme mürekkeplerin ise Groll ve ark.13,14 tarafından tanımlandığı gibi hücrelerden yoksun hidrojel kompozitler olması ayrımı yatmaktadır. Bu nedenle, biyoinks ile basılan 3B yapılar hidrojel matrisine önceden gömülü hücreler içerirken, biyomalzeme mürekkeplerle basılan 3B yapıların baskı sonrası hücrelerle tohumlandırılması gerekir. Kültür iskelelerinin hidrojel bazlı biyoinks/biyomalzeme mürekkeplerden biyofabrikasyonu en yaygın olarak ekstrüzyon 3D biyobaskı kullanılarak gerçekleştirilir, bu da biyoink/ biyomalzeme mürekkesini pnömatik veya mekanik olarak tahrik edilen bir piston aracılığıyla basınç altında bir mikro ölçekli nozülden ekstrüde eder14. Ekstrüzyon biyobaskıları, biyoink'i 'aşağıdan yukarıya' bir yaklaşımla ardışık olarak üst üste yığılmış 2D kesit desenlerine biriktirerek 3D iskeleler üretmektedir.

Ekstrüzyon biyobaskı ile uyumlu olması için, hidrojel bazlı biyoink/ biyomalzeme mürekkede tiksotropik (kesme-inceltme) özelliklerine sahip olması gerekir, böylece biyoink / biyomalzeme mürekkesinin kurucu hidrojel polimerleri, kesme stresine maruz kaldığında bir mikrokanal nozuldan bir sıvı gibi akar, ancak shear stresinin giderilmesi üzerine viskoz, jel benzeri bir duruma geri döner15 . Yüksek su içeriği nedeniyle, 3D biyobaskı yapısının mimarisini ve yapısal bütünlüğünü korumak için hidrojel bazlı biyoinks / biyomalzeme mürekkeplerin polimerleri fiziksel veya tutarlı bir şekilde çapraz bağlanmalıdır. Hücre yüklü biyoinkslerde, hücreler çapraz bağlama işlemi sırasında doğrudan kimyasal streslere maruz kalır. Biyoink hidrojel matrisi içinde kapsüllenen ekstrüzyon hücrelerin ekstrüzyon süreci de hücreleri kesme stresine maruz kalır ve bu da canlılığın azalmasına ve/veya hücre ölümüne yol açabilir. 3D doku modeli biyobaskı yapıldıktan sonra, hidrojel matrisin kendisi tarafından ortaya çıkan sitotoksiklik seviyeleri ile ekstrüzyon ve çapraz bağlama işlemleri arasında ayrım yapmak zordur. Bu, hücrelerin hidrojel matrisine önceden gömüldüğü 3D iskeleler bağlamında özellikle zordur, bu nedenle hücrelerin sonraki analizler için çıkarılmasını zorlaştırır, bu da mast hücrelerinin yaşayabilirliğine zarar verir.

Mast hücreleri içeren 3D doku yapıları oluşturmaya yönelik daha nazik bir yaklaşım, hücrelerin önceden basılmış, gözenekli biyomalzeme mürekkep 3D iskelelere tohumlamayı içerir, bu da mast hücrelerinin dolaşımdan çevre dokulara göç etme yeteneğini arttırır. Bu hücre tohumlama yaklaşımının yararları iki kattır: (i) mast hücreleri sırasıyla ekstrüzyon ve çapraz bağlama işlemlerinden kesme ve kimyasal gerilmelere maruz kalmaz ve (ii) hücreler canlılıklarını olumsuz etkilemeden analiz için hafifçe yıkanarak maruz kaldıktan sonra 3D iskeleden kolayca çıkarılabilir. 2D hidrojel disklerin aksine 3D biyobaskılı, gözenekli hidrojel iskelelerde mast hücrelerinin hücre canlılığının tohumlandırılmasının ve analiz edilebilmesinin ek yararı, 3D biyobaskılı hidrojel iskelelerin, toplu olarak bulunmayan in vivo dokuların mikro ölçekli topografik özelliklerini, 2D düzlemsel hidrojel diskleri rekapitulate etmesidir. Bu yaklaşım, aday biyoink hidrojel matrislerinin, pahalı 3D doku mühendisliği deneylerine yatırım yapmadan önce mast hücreleri ve diğer immünolojik hücreler üzerindeki potansiyel olarak yıkıcı sitotoksik etkilerini belirlemek için uygun, hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşımdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bu protokol beş bölümden oluşur: (1) fare kemik iliğinin izolasyonu ve fare kemiğinden türetilmiş mast hücrelerinin (BMMC'ler) farklılaşması, (2) CNC/agarose/D-mannitol hidrojel substratlarının 24 kuyulu bir sistemde imalatı ve alt tabakalardaki BMMC kültürü, (3) BMMC'lerin CNC/agarose/D-mannitol hidrojel substratlarından uzaklaştırılması ve akış sitometrisi kullanılarak canlılık ve biyobelirteç ekspresyonunun analizi, (4) Hidrojel iskelelerin piyasada bulunan fibriller nanoselülozdan (FNC)/sodyum aljinat kompozit biyomalzeme mürekkesinden 3D biyobaskı, ve (5) FNC/sodyum aljinat hidrojel iskeleler üzerinde BMMC kültürü ve akış sitometrisi, XTT ve laktat dehidrogenaz (LDH) mikrotiter tahlilleri kullanılarak uygulanabilirlik analizi.

1. BMMC kültürünün üretimi

NOT: Fareler izofluran anestezisi sonrasında CO2 boğulması ile ötenaziye tabi edildi. Kaval kemiği ve uyluk kemiği izole edildi ve tüm kemik iliği hasat edildi. Tüm hayvan çalışmaları, Alberta Üniversitesi Sağlık Bilimi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayıyla Kanada Hayvan Bakım Kılavuzları ve Politikaları Konseyi'ne uygun olarak yürütüldü.

  1. Tablo 1'de listelenen takviyeleri belirtilen son konsantrasyonlara ekleyerek tam RPMI-1640 kültür ortamı hazırlayın. NaOH kullanarak ortamın pH'ını 7,4-7,6'ya ayarlayın, tek kullanımlık, şişe üstü filtre (0,2 μm gözenek boyutu) kullanarak sterilize edin ve 2 aya kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
  2. Yerel Üniversite Hayvan Bakım Komitesi protokolleri ve prosedürlerine uygun olarak farelerden uyluk kemiği elde edin.
    NOT: Bu çalışmada, uyluk kemiği C57BL/6 farelerden izole edildi, ancak çalışmayla ilgiliyse herhangi bir suş kullanılabilir.
  3. Makas kullanarak kalça ekleminden deri ve kası çıkarın ve ardından kalça soketinden hafifçe bükerek uyluk kemiğini hafifçe çekin (Şekil 1). Femoral kafa koparmamaya dikkat edin. Kaval kemiğini makas kullanarak medial fabelladaki uyluk kemiğinden kesin. Kalkaneumun hemen üstünde keserek pençeyi çıkarın ve atın.
  4. Neşter kullanarak, uyluk ve kaval kemiği parçalarından deri ve kıkırdağı çıkarın. Makas kullanarak, uyluk kemiğinin ve kaval kemiğinin her iki ucunda temiz bir kesim yapın, içindeki kırmızı kemik iliğini açığa çinin. Gerekirse, bu noktada fibulayı çıkarın, ancak kemik iliği kızarması sırasında kaval kemiğinin manipülasyonunda yardımcı olabileceğini unutmayın.
  5. 5 mL luer-lock şırınga ile 26 G'lik bir iğne hazırlayın ve yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan yaklaşık 5 mL tam ortamla doldurun.
    NOT: Bu noktada, katkı maddeleri olmadan tamamlanmamış RPMI, reaktiflerden tasarruf etmek için de kullanılabilir.
  6. Femur veya kaval kemiğini tokalarla tutarak, iğneyi kemiğin bir ucuna yerleştirin ve şırıngaya hafifçe bastırın. Kemiği 50 mL steril konik bir tüp üzerinde tutun ve biraz basınç uygulayarak kemiğe yaklaşık 5 mL orta enjekte edin. Kemik iliği parçalarının kemiğin diğer ucundan ince kırmızı kurdeleler olarak ve konik tüpe düştüğünü gözlemleyin.
  7. Aspiratları aşağı çevirin ve tam ortamda yeniden ıslatın veya doğrudan 50 mL tam RPMI-1640 ortamı içeren bir T175 cm2 steril doku kültürü şişesine aktarın. Aspiratları 30 ng/mL fare rekombinant interlökin (IL)-3 ile eksiksiz RPMI-1640 ortamında muhafaza edin.
  8. 1 gün sonra, kültürleri hafif bir mikroskop altında gözlemleyin. Kültür, farklı şekil ve boyutlardaki hücrelerin heterojen popülasyonu ve hatta daha büyük kemik iliği parçalarından oluşacaktır. Yukarıda açıklandığı gibi tam RPMI-1640 ortamını kullanarak her 3-5 günde bir 15 mL taze ortam ekleyerek hücre kültürlerini besleyin ve hücre yoğunluğunun 1 × 106 hücre/mL'yi asla aşmamasını sağlayın. Haftada bir kez, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da hücreleri aşağı çevirin, taze tam RPMI-1640 ortamında yeniden biriktirin ve taze T175 şişelerinde 1:4'ü 50 mL ortama bölün.
  9. 4 hafta sonra, aşağıda açıklandığı gibi akış sitometrisi ile CD117 (Kit) ve FceRI reseptörlerinin yüzey ekspresyonlarını ölçerek hücre saflığını belirleyin (bölüm 3.2).
    NOT: 4 hafta sonra, cd117 (Kit) ve FcφRI için hücrelerin% 99'u çift pozitif olmalıdır.
  10. 4 hafta ve daha sonra, BMMC'leri tam RPMI-1640 ortamında 20 ng/mL IL-3 ile koruyun. Yaklaşık 6 haftada, hücreler bölünmeyi durduracak ve artık bölünme gerektirmeyecektir. Kültürleri her 3-5 günde bir besleyin, hücreleri haftada bir santrifüjleme ile peletleyin ve taze tam RPMI-1640 ortamında yeniden biriktirin.

2. CNC/agarose/D-mannitol hidrojel substratlarının ve BMMC kültürünün imalatı

  1. Bir cam şişede, fosfat tamponlu saline (PBS) (%2 w/v) 10 mL'lik son hacme 0,2 g agarose tozu ekleyin ve çözünmesi için 100 °C'de 1 dakika kaynatın.
  2. %25 w/v karışım hazırlamak için PBS'deki 2,5 g CNC tozunun 10 mL'lik son hacmine çözün.
  3. PBS'deki 2 g CNC tozunun %20 w/v karışımını hazırlamak için 10 mL'lik son hacme kadar çözün ve %20 w/v karışımını seri olarak seyrelterek 10, 5 ve %2 w/v CNC karışımları hazırlayın.
  4. 25, 20, 10, 5 ve 2% w/v CNC karışımlarını 10 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtın (Şekil 2A).
  5. Sıcak agarose çözeltisine (%4,6 w/v) 0,46 g D-mannitol ekleyin ve çözün.
  6. Önceden ısıtılmış 25, 20, 10, 5 ve %2 w/v CNC-PBS karışımlarını sıcak agarose/D-mannitol çözeltisi ile ayrı konik tüplerde 1:1 oranında karıştırarak hidrojel karışımlarında 12,5, 10, 5, 2,5 ve %1 w/v'lik nihai CNC konsantrasyonları elde edin.
  7. Hızlı bir şekilde çalışarak, 24 kuyulu bir kültür plakasına dört katına 2,6 adımda hazırlanan yukarıdaki çözeltilerden 500 μL / kuyu ekleyin ve polimerizasyonu kolaylaştırmak için oda sıcaklığında 30 dakika bekletin (Şekil 2B).
  8. BMMC süspansiyonunun 1000 μL'× 106 hücre/mL'lik bir yoğunlukta bir mikropipettor ile hidrojel substratlarının üzerine dikkatlice katmanlayın ve jel yüzeyine zarar vereceğinden ve parçacıklar oluşturacağından jelin ucuna dokunmaktan kaçının.
  9. BMMC'leri hidrojel substratlarında steril bir inkübatörde (%5 CO2, nemlendirilmiş atmosfer) 37 °C'de 18 saat kuluçkaya yatırın.

3. Akış sitometrik analizleri

  1. PI hariç tutma yoluyla BMMC canlılığının akış sitometrik analizi
    1. BMMC'leri içeren kültür ortamını CNC/agarose/D-mannitol'ün tepesinden dikkatlice çıkarın, jelden kaçının ve hücreleri 1,5 mL'lik bir mikrofuge tüpüne aktarın.
    2. BMMC'leri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da %0,5 w/v sığır serum albümini içeren PBS (pH 7.4) ile iki kez yıkayın ve 180 μL PBS-%0.5 w/v BSA'da 1.5 × 106 hücre/mL'lik son yoğunluğa yeniden depolayın. Hücreleri 96 kuyu yuvarlak alt plakaya aktarın.
      NOT: Tüm PBS-0,5% w/v BSA çözümlerini 0,2 μm gözenek boyutunda şırınna filtresi kullanarak iki kez filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
    3. Hücrelere 20 μL PBS-0,5% w/v BSA veya PBS-0,5% w/v BSA'da hazırlanan 10x PI (100 μg/mL) ekleyin ve 4 °C'de 1 saat veya karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. 578 nm'de floresan emisyonunun tespitini sağlamak için Argon iyon lazer (488-514 nm) ve bandpass filtresi ile donatılmış bir akış sitometresi kullanarak floresan verileri elde edin. Oda sıcaklığında 30 μL/dk debide numune başına 20.000 olay elde edin. Verileri aşağıda açıklandığı gibi analiz edin (bölüm 3.2.7-3.2.10).
  2. Kit için BMMC'lerin akış sitometrik analizi (CD117) ve FCΦRI yüzey reseptör ekspresyoli
    1. BMMC'leri içeren kültür ortamını CNC/agarose/D-mannitol'ün tepesinden dikkatlice çıkarın, jelden kaçının ve hücreleri 1,5 mL'lik bir mikrofuge tüpüne aktarın.
    2. BMMC'leri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da filtrelenmiş PBS-0,5% BSA ile iki kez yıkayın ve %0,5 w/v BSA (1,5 × 106 hücre/mL) içeren 180 μL PBS'de yeniden depolayın. Yeniden biriktirilen hücreleri 96 kuyulu yuvarlak tabanlı bir tabağa aktarın.
    3. Sırasıyla 0,06 μg/mL CD117 (c-Kit)-fikoerythrin (PE) ve 0,06 μg/mL FcφRIα-allophycocyanin (APC) konsantrasyonu elde etmek için hücrelere 20 μL 10x antikor çalışma çözeltisi ekleyin.
      NOT: 10x antikor çalışma çözümleri filtre sterilize PBS-0.5% w/v BSA olarak hazırlanmalıdır.
    4. Adım 3.2.3'te antikor-florofor konjugelerinden herhangi biriyle lekelenmiş olmayan hücreleri içeren kuyuları ayırmak için sıçan IgG2b φ izotip kontrolü-PE veya Ermeni hamster IgG izotip kontrolü-APC içeren 20 μL 10x izotip kontrol çalışma çözümleri ekleyin.
      NOT: İzotip kontrolleri, sıçan IgG2b φ izotip kontrolü-PE ve Ermeni hamster IgG izotip kontrolü-APC, antikorların BMMC'ye spesifik olmayan bağlanmasını kontrol etmeye yarar. BMMC'ler yüksek fcr seviyelerini ifade etmediklerinden, izotip kontrol antikorları ile nadiren yüksek arka plan floresanları tespit edilir. Filtre sterilize edilmiş PBS-0,5% w/v BSA'da 10x izotip kontrol çalışma çözümlerini hazırlayın.
    5. 96 kuyulu yuvarlak alt plakayı karanlıkta 4 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    6. Her kuyuya 200 μL taze PBS-0.5% w/v BSA tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjlayın. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın. Hücre peletini dokunmadan süpernatant dikkatlice çıkarın; hücre peletinin bozulmadan kalmasını sağlamak için arkada bir süpernatant bırakın.
    7. Yıkadıktan sonra, 0,2 μm gözenek boyutunda şırıngam filtresi ile iki kez steril filtrelenmiş PBS'de (pH 7,4) %0,5 W/V BSA, %0,05 w/v sodyum azit 100 μL'de hücreleri yeniden biriktirin. 3.1.3 adımında yukarıda belirtildiği gibi, bir akış sitometresi kullanarak PE ve APC dedektör kanallarında floresan verileri elde edin.
    8. ".fcs" uzantılı akış sitometrik veri dosyalarını görüntüleyebilen ve analiz edebilen yazılım kullanarak verileri analiz edin.
    9. X ekseni boyunca ileri saçılım (FSC) ve y ekseni boyunca yan dağılım (SSC) çizerek analize başlayın, ve Şekil 3A(i),(ii)'de gösterildiği gibi işlenmemiş ve etiketlenmemiş hücrelerde FSC log10 1.5-5.0 ve SSC log10 0.75-3.25 aralığına sahip korunmuş hücre popülasyonu için kapı.
      NOT: Bu, düşük FSC ve SSC değerlerine sahip hücre kalıntılarının analizden ortadan kaldırılmasını sağlamaya yarar. Mast hücreleri normalde monositler ve lenfositler gibi diğer immünolojik hücre tiplerine kıyasla çok granül (yüksek SSC) hücreler ve büyük (yüksek FSC) hücrelerdir.
    10. Ardından, boya, antikor veya izotip kontrolleri ile boyanmış işlenmemiş örneklerin FSC ve SSC nokta çizilmelerini ve histogram profillerini oluşturun ve kullanılan spesifik antikor-florofor konjuge veya boyanın emisyon spektrumuna göre PE veya APC kanallarında ortalama floresan yoğunluğu (MFI) elde edin. Farklı CNC/agarose/D-mannitol substratları ile inkübe edilmiş ve ilgili izotip kontrolleri, antikorlar veya boya ile boyanmış tüm BMMC örneklerine aynı kapı ve parametre kümesini uygulayın; MPI'ları edinin.
      NOT: Esasen, işlenmemiş lekeli örneklerin FSC vs SSC nokta çizimleri, lekeleme prosedürünün hücre boyutunu (FSC ile ölçülür) veya parçalılığı (SSC ile ölçülür) değiştirmemesini sağlamak için 3.2.9 adımında elde edilen işlenmemiş/lekelenmemiş örneklerden ayırt edilemez olmalıdır (Şekil 3A(i),(ii)).
    11. İstatistiksel bir analiz yazılım paketi kullanarak grafiklerin üretilmesinin ardından 4 bağımsız deneyden her örnek için ortalama MMI'leri ve standart ortalama hatayı (SEM) hesaplayın.
    12. Akış sitometrik veri analiz yazılımında histogram kaplamaları hazırlayın (Şekil 3B, 4A(ii),B(ii)).

4.3D FNC/ sodyum aljinat hidrojel substratlarının biyobaskı

NOT: Bu çalışmada kullanılan 3D biyobaskı, iki bağımsız, sıcaklık kontrollü baskı kafası ile donatılmış bir pnömatik ekstrüzyon sistemidir. 3D biyobaskı için kullanılan biyomalzeme mürekkeme hidrojel iskeleler,(a) kollajen, (b) sodyum aljinat ve (c) D-mannitol'e morfolojik olarak benzeyen yüksek hidratlı fibriller nanoselüloz (FNC) formüle edilmiştir. Steril luer-lock konik biyobaskı nozüllerinin (22, 25 veya 27 G) takılabileceği 3 mL kartuşlarda steril bir hidrojel süspansiyon olarak tedarik edilir.

  1. Bu protokolü, oda sıcaklığının 20-25 °C olduğu oda sıcaklığında baskı kafaları ve baskı yatağı ile kullanın.
  2. Hidrojel kompozitin stabilitesini korumak için biyomalzeme mürekkep kartuşlarını 4 °C'de saklayın. 3D biyobaskı işlemine başlamadan önce buzdolabından bir kartuşu (3 mL) çıkarın ve oda sıcaklığına eşdeğer hale getirmek için izin verin.
  3. INKREDIBLE+ 3D Biyobaskı üzerine Bioink kartuşu montajı
    1. Mavi uç kapaklarını 3 mL biyomalzeme mürekkep kartuşundan çıkarın (Şekil 5B(i)) ve Bioink kartuşunun luer-lock ucuna steril 22 G (mavi) konik biyobaskı nozulu yapıştırın.
      NOT: Kartuşu takmadan ve sonraki kalibrasyon adımlarını gerçekleştirmeden önce istediğiniz konik biyobaskı nozülün biyoink kartuşuna yapıştırması önemlidir, çünkü aksi takdirde 3D biyobaskı ekseninin yanlış kalibrasyonuna neden olur.
    2. Yazıcı kafası 1 (PH1, sol) için hava basıncı besleme borusunu kartuşun karşı ucuna bağlayın ve bağlı konik biyobaskı nozülü ile kartuşu PH1 dikey yuvasına takın (Şekil 5A(ii)).
    3. Kartuşu PH1'e, baskı kafasının altına uzanan konik biyobaskı nozülü ile sıkıca oturtun. Bioink kartuşunu yerine kilitlemek için PH1'deki vidayı parmak sıkına kadar saat yönünde sıkın. PH2 boş bırakılarak 3D biyobaskı yapılabileceğini unutmayın.
  4. 3D biyobaskının x-y-z eksenlerinin kalibre edilmesi
    1. 3D biyobaskıyı açın ve biyobaskı yazılımını bir USB 2.0 kablosuyla 3D biyobaskıya bağlı bir bilgisayarda başlatın.
    2. Yazılımda, yazılımı 3D biyobaskı ile senkronize etmek için CONNECT düğmesini tıklatın.
      NOT: Baskı kafası ultraviyole ışık yayan diyot ışıkları açıp kapattığında ve HEPA filtre fanı tekrar tekrar devreye girdiğinde senkronizasyon başarılı olur. Yazılım, sonraki adımlarda belirtildiği gibi, biyobaskı eksenlerini ve başlangıç noktası kalibrasyonunu taşımadan önce 3D biyobaskı ile senkronize edilmelidir.
    3. 3D biyobaskı ana kontrol menüsünde dört seçeneği gözlemleyin: (i) BIOPRINT HAZIRLA, (ii) BIOPRINT, (iii) KAMU HIZMETLERI MENÜSÜ ve (iv) DURUM EKRANI. BIOPRINT HAZIRLA seçeneğini belirleyin, sonra aşağı kaydırın ve HOME AXES seçeneğini belirleyin.
      NOT: 3D biyobaskı daha sonra sırasıyla y ve x eksenlerini kalibre etmek için baskı kafası montajını geriye ve sola doğru hareket ettirir. Bundan sonra, baskı kafaları en sol konumda duraklatıldığında, biyobaskı, z ekseni kalibrasyon anahtarı (baskı alanında bulunan) baskı kafası 1'e takılan konik biyobaskı nozülüyle temas edene kadar baskı yatağını yükseltecektir.
    4. x-y-z eksenlerinin başarılı kalibrasyonunun ardından, baskı yatağının hafifçe alçaltılmasını ve yazıcı kafalarının baskı yatağının orta noktasının üzerine taşınmasını gözlemleyin (Şekil 5A(i)).
  5. 24 kuyulu plakalarda biyobaskı için biyobaskının başlangıç noktası kalibrasyonu
    1. Steril bir 24 kuyu kültür plakasını kapalı plastik ambalajından çıkarın ve plakanın alt tarafındaki kuyu D1'in orta noktasındaki bir noktayı kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin. Plaka kapağını çıkarın ve 24 kuyulu kültür plakasını baskı yatağının sol ön köşesinde bulunan iyi D1 ile baskı yatağına yerleştirin.
    2. Ana denetim menüsünde , YARDıMCı PROGRAMLAR MENÜSÜ'nü ve ardından EKSENİ TAŞI'yı seçin. PH1'in konik biyobaskı nozülü doğrudan D1 altında işaretlenmiş noktanın üzerine gelene kadar baskı kafalarını x ve y eksenleri boyunca 1 mm'lik artışlarla hareket ettirene kadar hareket ettirenin. Gerekirse, baskı kafalarını 0,1 mm'lik artışlarla hareket ettirerek konik biyobaskı nozülün konumunu noktanın üzerine ince ayar yapın.
    3. 3D biyobaskı kontrol paneli ekranında belirtildiği gibi, doğrudan kuyu D1'in merkezi üzerindeyken konik biyobaskı nozülün x ve y koordinatlarını kaydedin.
      NOT: Burada kullanılan INKREDIBLE+ 3D biyobaskı durumunda x ve y koordinatları aşağıdaki gibidir: x : -46.5 ve y : -27.5. Bu koordinatlar, 24 kuyu plakasında biyobaskı için kuyu D1'in merkezinde başlangıç noktası olarak hizmet eder.
    4. Ardından, D1 kuyusunun altı baskı kafası 1'e takılan konik biyobaskı nozülüne neredeyse dokunana kadar baskı yatağını 1 mm'lik artışlarla kaldırın. Gerekirse baskı yatağının hareketine 0,1 mm'lik artışlarla ince ayar yapın (Şekil 5A(ii)). Ardından, YARDıMCı PROGRAMLAR MENÜSÜNDEN Z EKSENI KALIBRASYON seçeneğini seçin ve STORE Z KALIBRASYON seçeneğini daha fazla seçip onaylayın.
    5. Ana menüye dönün ve BIOPRINT'I HAZIRLA seçeneğini belirleyin. Aşağı kaydırın ve CALIBRATE Z seçeneğini belirleyin.
      NOT: 3B biyobaskı artık z ekseni kalibrasyonunu başarıyla gerçekleştirdikten sonra baskı yatağını düşürecektir (Şekil 5A(iii)).
  6. 24 kuyulu plaka G-code dosyası doğru başlangıç noktası koordinatlarıyla güncelleniyor
    1. Sağlanan 24 kuyulu plaka geometrik kod (G-code) dosyasını biyobaskı yazılımında açın (Ek Dosya 1).
      NOT: Bu 24 kuyulu G-kod dosyası, her kuyuda 2 katmanlı 5 x 5 x 1 mm doğrusal yapıların yazdırılmasını kodlar (Şekil 5C(i),(iii)). Sağlanan G-code dosyaları herhangi bir 3D biyobaskı yazılımı ile kullanılabilir.
    2. G-kod dosyasının Satır 1'inde G0 X-50.0 Y-33.5 ; D1 kuyusunun Merkez Konumu. Satır 1'deki x ve y koordinatlarını 4.5.3 adımında elde edilen değerlerle güncelleyin, yani Satır 1 artık G0 X-46.5 Y-27.5'i okumalıdır; D1 kuyusunun Merkez Konumu. Dosyayı yeni bir adla kaydedin.
      NOT: Bu prosedür, G-code dosyasını kalibre etmeye yarar, böylece baskı, kullanılan belirli 3D biyobaskının x,y koordinatlarına göre kuyu D1'in merkezinde başlar. Bu yaklaşım, herhangi bir ekstrüzyon 3D biyobaskı ile yazdırma için 24 kuyulu plaka G-kod dosyasını kalibre etmek için kullanılabilir. Bu çalışmanın amacı doğrultusunda 24 kuyu plakasının sadece sol yarısı yani A1-3, B1-3, C1-3 ve D1-3 kuyuları basılmıştır. 2 katmanlı 5 x 5 x 1 mm'lik rektilinear yapıların 3 x 4 ızgarada yazdırılmasını kodlayan ayrı bir G-code dosyası da sağlanır (Ek Dosya 2, Şekil 5C(ii)).
  7. Baskı Kafası 1 (PH1) için ekstrüzyon basıncının ayarlanması
    1. Pnömatik pompanın INKREDIBLE+ 3D biyobaskısının arka hava giriş portuna sıkıca bağlandığından emin olun ve pnömatik pompayı açın.
    2. INKREDIBLE+ 3D biyobaskısının sağ tarafında bulunan ileri kontrol düğmesini çıkarın.
      NOT: İleri kontrol düğmesi PH1 için basıncı ayarlarken, arka kontrol düğmesi PH2 için basıncı ayarlar.
    3. Biyobaskı ön tarafında bulunan PH1 ve PH2 için dijital basınç göstergelerinin her biri 0 kPa'ya yakın okuma. PH1 için sol göstergede belirtilen basınç 12 kPa'ya ulaşana kadar ileri kontrol düğmesini saat yönünde yavaşça döndürün (Şekil 5A(iii)).
    4. Takılı kartuşun baskı nozulunun altına, baskı nozuluna dokunmamaya dikkat ederek katlanmış bir kağıt kağıt veya su geçirmez bir parça yerleştirin.
    5. 3D biyobaskıdaki ana kontrol menüsündeN BİYOPRINT HAZIRLA'yı seçin.
    6. PH1'i AÇ'a gidin ve seçin. Biyomalzeme mireksinin baskı nozulundan ekstrüde olmaya başladığını unutmayın. Gerekirse, biyomalzeme mürekkemesi sürekli bir filamentte ekstrüde edilene kadar kontrol düğmesini saat yönünde döndürerek ekstrüzyon basıncını artırın ve yeni basınç ayarını kaydedin. Biyomalzeme mürekkep israfını önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.
    7. Biyomalzeme mürekkebi ekstrüzyonunu durdurmak için PH1'i KAPAT'ı seçin, ekstrüde edilmiş biyomalzeme mürekkebi içeren kağıt mendili veya filmi baskı yerinden çıkarın ve biyobaskı kapısını kapatın.
      NOT: 3D biyobaskı, G-code dosyasının talimatıyla yazdırma sırasında hava basıncı beslemesini otomatik olarak PH1'e açar.
  8. 24 kuyulu plaka formatında rektilinear hidrojel substratların 3D biyobaskı
    1. 3D biyobaskıdaki ana kontrol menüsündeN UTILITIES MENU'yi seçin. Biyobaskı yazılımının G-kod dosyalarını yazdırma için 3D biyobaskıya iletmesine izin verecek DISABLE SD PRINT'e gidin ve seçin.
    2. Biyobaskı yazılımındaki YÜKLE düğmesine tıklayın ve 4.6.2 adımında kaydedilen güncellenmiş 24 kuyu plakalı G-code dosyasını seçin.
    3. Yazılımdaki sağ kontrol panelinde , PRINT PREVIEW sekmesini seçin ve D1'de biyobaskı işlemine başlamak için YAZDıR düğmesine tıklayın.
      NOT: 3 x 4 ızgara kuyu plakası G-code dosyasını kullanıyorsanız, biyobaskı, tam bir 24 kuyu plakası basıldığında A6'nın aksine, 24 kuyu plakasının (Şekil 5C(ii),D'nin A3'ünde sona erer.
    4. Rektilineer yapıların biyobaskısının tamamlanmasının ardından, 24 kuyu plakasını kapağıyla örtün ve sınıf II biyogüvenlik kabinine taşıyın.
    5. Her bir rektilineer yapıyı iki damla steril 50 mM CaCl2 çözeltiye (Şekil 5B(ii)) daldırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya bırakın.
      NOT: Bu, aljinat polimer zincirlerini Ca2+ iyonları ile iyonik olarak çapraz bağlamaya ve rektilineer yapıların yapısal bütünlüklerini korumalarına izin vermeye yarar.
    6. CaCl2 çözeltisini her yapıdan dikkatlice emiş ve fazla CaCl2'yi (Şekil 5D) çıkarmak için 1x PBS'nin (pH 7.4) 1 mL'sinde bir kez durulayın.
    7. Biyobaskılı hidrojel yapılarının susuz kalmamasını önlemek için, BMMC'ler yapıların üzerine tohumlamaya hazır olana kadar 3D biyobaskılı rektilinear yapıları taze 1x PBS'de tutun (Şekil 5D).

5. BMMC'lerin 3D biyobaskılı rektilineer iskelelerde inkübasyonu ve uygulanabilirlik testi

  1. 3D biyobaskılı rektilinear hidrojel iskelelerde BMMC'lerin inkübasyonu
    1. BMMC'lerin tohum aliquotları, tüm tedavilerin aynı anda sona ermesi için üç taraflı olarak dört farklı süre boyunca (örneğin, 6, 18, 24 ve 48 saat) 3D biyobaskılı rektilinear iskelelere yer almaktadır. İşlenmemiş kontrollerle aynı sürelerde üç taraflı olarak boş kuyulara tohumlanmış BMMC'leri kullanın.
    2. BMMC'leri T175 cm2 kültür şişesinden steril 50 mL konik tüpe aseptik olarak aktarın ve BMMC'leri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da peletlayın.
    3. Peleti IL-3'ün 20 ng/mL'sini içeren 50 mL taze tam RPMI ortamında yeniden yaşayın ve hemacytometre kullanarak bir miktar trippan mavi lekeli BMMC sayarak canlı hücre yoğunluğunu hesaplayın.
    4. 5.1.3 adımında hesaplanan hücre yoğunluğuna bağlı olarak, 1 × 106 hücre/mL'lik son yoğunlukta BMMC süspansiyonunun 6 mL'lik bir aliquot'ını hazırlayın.
    5. 48 h inkübasyon kurulumu için, 3D biyobaskılı rektilinear hidrojel iskeleleri içeren A1-3 kuyularından PBS'yi ve her kuyuya pipet 1 mL BMMC (1 × 106 hücre/mL) süspansiyonu aspire edin. Ayrıca pipet 1 mL BMMC (1 × 106 hücre/mL) süspansiyonu, işlenmemiş kontrol görevi görmek için biyobaskılı yapılar olmadan kuyu A4-6'ya sokmaktadır. 24, 18 ve 6 h tedavi süreleri için BMMC ile tohumlama için uygun süreye ulaşılana kadar dehidrasyonu önlemek için biyobaskılı iskeleler (B1-3, C1-3, D1-3) içeren kalan kuyuları katkı maddesi olmadan RPMI'de kuluçkaya yatırın. 24, 18 ve 6 h zaman noktaları için BMMC'lerle tohumlama için uygun zamana ulaşılana kadar kuyuları biyobaskılı iskeleler (B4-6, C4-6, D4-6) olmadan 1 mL PBS ile doldurun.
    6. 24 kuyu plakasını %5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    7. 24 saat inkübasyon kurulumu için, B1-6 kuyularından önceden var olan kültür orta / tamponunu ve bu kuyulara 1 mL BMMC (1 × 106 hücre/mL) süspansiyonu tohumlayın. Plakayı inkübatöre geri verin.
    8. 18 h kuluçka kurulumu için, C1-6 kuyularından önceden var olan kültür orta / tamponunu ve bu kuyulara 1 mL BMMC (1 × 106 hücre/ mL) süspansiyonu tohumlayın. Plakayı inkübatöre geri verin.
    9. 6 h kuluçka kurulumu için, D1-6 kuyularından önceden var olan kültür orta / tamponu ve bu kuyulara 1 mL BMMC (1 × 106 hücre/mL) süspansiyonu soluyun. Plakayı inkübatöre geri verin.
    10. Kuluçka sonlandırma için, (i) PI boyama ve akış sitometrisi, (ii) XTT hücre canlılık tahlil ve (iii) LDH salınım tahlil ile analiz için 24 kuyu plakasının her kuyusundan numune dağıtın. Bu nedenle, yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakasının ve gerekli 1,5 mL mikrobuge tüplerinin kuluçkanın uç noktasından önce iyi etiketlenmesinden emin olun.
  2. XTT metabolik test için hücre örneklemesi
    1. BMMC'leri her kuyudaki kültür ortamında iyice yeniden depola, 3D biyobaskılı hidrojel iskelelere zarar vermemeye ve parçalamamaya dikkat edin.
    2. Homojen BMMC süspansiyonunun 40 μL'lik kısmını her kuyudan 760 μL taze komple RPMI ortamı (son hacim = 800 μL) içeren steril 1,5 mL mikrobuj tüplerine ve karıştırmak için kısaca girdabı aseptik olarak aktarın.
    3. Seyreltilmiş BMMC süspansiyonlarının 100 μL'sini üç taraflı olarak, emicilik ölçümlerini bir mikro plaka spektrofotometresine kaydetmek için uygun düz tabanlı 96 kuyulu bir mikrotiter plakaya dağıtın ( Bkz. Malzeme Masası).
    4. Çok kanallı bir mikropipette kullanarak BMMC hücre süspansiyonu içeren her kuyuya 50 μL XTT çalışma çözeltisi dağıtın.
      NOT: 5 mL XTT reaktifi 100 μL elektron kavrama reaktifi ile karıştırarak XTT çalışma çözümünü hazırlayın. Bu bileşenleri kullanmadan hemen önce 37 °C'lik bir su banyosunda -20 °C'den ısıtın.
    5. 96 kuyu plakasını 37 °C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş atmosferde 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    6. Kuluçkanın sonunda, 96 kuyu plakasını inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Absorbans değerlerini 450 nm'de bir mikro plaka spektrofotometresine kaydedin ve 650 nm'de arka plan çıkarma.
  3. Laktat dehidrogenaz (LDH) tahlili için süpernatant örnekleme
    1. Kalan BMMC süspansiyonlarını (960 μL) 24 kuyulu plakanın her kuyusundan mikro yakıt tüplerine aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da peletin.
    2. Pipet her mikrofuge tüpünden 96 kuyulu bir mikrotiter düz taban plakasına hücre kültürünün üç 100 μL aliquots'u. Her mikrofuge tüpünden arta kalan süpernatantları atın ve 5.4.1-5.4.8 bölümlerinde PI ile daha fazla boyama için BMMC peletlerini saklayın.
    3. Her 100 μL'lik süpernatant aliquotuna LDH çalışma çözeltisinin pipet 50 μL'si.
      NOT: LDH test reaktiflerinin hazırlanması için Ek Dosya 3'e bakın.
    4. Oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat kuluçkaya yaslanın.
    5. Reaksiyonun durdurulması için her kuyuya pipet 50 μL 1 M asetik asit.
    6. Absorbans değerlerini 490 nm'de bir mikro plaka spektrofotometresine kaydedin ve 680 nm'de arka plan çıkarma.
  4. Propidium iyodür (PI) hariç tutma yoluyla BMMC canlılığının akış sitometrik analizi
    1. BMMC peletlerini akış yıkama tamponunda (PBS [pH 7.4] %0.5 w/v BSA içeren) yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da hücreleri peletlayın.
    2. Debi yıkama tamponu ile yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
    3. Her BMMC peletini 400 μL akış yıkama tamponunda yeniden dirildi.
      NOT: Toplamda 24 yeniden sulanan BMMC örneği olacaktır: biyobaskıda hidrojel substratlarda (üç taraflı 4 zaman noktası) kuluçkaya yatırılan 12 BMMC örneği ve biyobaskı yapılı olmayan kuyularda kuluçkaya yatırılan 12 BMMC örneği (üç taraflı 4 zaman noktası).
    4. Yuvarlak tabanlı 96 kuyulu bir mikroter plakada pipet 20 μL akış yıkama tamponu A1-12 ve B1-12 kuyularına. Aynı mikrotiter plakada pipet 20 μL 10x PI boyama çözeltisi (akış yıkama tamponunda 100 μg/mL PI) C1-12 ve D1-12 kuyularına.
    5. Biyobaskılı hidrojel substratlarında inkübe edilen 12 BMMC örneğinin 180 μL'sini kuyu A1-12'ye (kuyu başına bir örnek) dağıtın. Biyobaskılı hidrojel substratlar olmadan kuluçkaya yatırılan 12 BMMC örneğinin 180 μL'sini B1-12 kuyularına dağıtın (kuyu başına bir örnek). A1-12 ve B1-12 kuyularına dağıtılan BMMC örneklerini her tedavi durumu için el değmemiş kontroller olarak kullanın (toplamda 24 kontrol).
    6. Biyobaskılı yapılarda kuluçkaya yatırılan 12 BMMC örneğinden 180 μL'yi C1-12 kuyularına dağıtın (kuyu başına bir örnek). Biyobaskılı yapılar olmadan kuluçkaya yatırılan 12 BMMC örneğinin 180 μL'sini D1-12 kuyularına dağıtın (kuyu başına bir örnek).
      NOT: C1-12 ve D1-12 kuyularındaki BMMC numuneleri 10 μg/mL'lik son etkili PI konsantrasyonunda (toplamda 24 lekeli numune) lekelenecektir.
    7. Plakayı 4 °C'de 1 saat veya karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    8. Kuluçka süresinin sonunda, numuneleri daha önce bölüm 3.1 altında açıklandığı gibi bir akış sitometresi üzerindeki mikroter plakadan doğrudan analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Başarılı bir biyomalzeme mürekkemesinin veya kültür substratının en önemli özelliklerinden biri biyouyumluluktur. Öncelikle, substrat hücresel ölüme neden olmamalıdır. Hücre canlılığını ve nekrozu ölçmek için birkaç mikrotiter tabanlı ve akış sitometrik yöntemi vardır; ancak, bu yöntemler bir hidrojel matrisine gömülü hücreleri analiz etmek için uygun değildir. Bu protokolde, yukarıda belirtilen sınırlama, BMMC'lerin hidrojel substrat veya biyobaskılı iskele üzerine tohumlanarak atlatılır. Belirli bir kuluçka döneminden ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

3D biyomimetik dokuların imalatı, in vivo dokuların fizyolojik analoglarını oluşturmak için hücresel bileşenlerle hücresel matrisin bileşenlerini taklit eden biyoink'in başarılı bir şekilde birleştirilmesini gerektirir. Bu, fizyolojik biyomimetik dokular üretilirken dönüştürülmüş hücrelerin değil, birincil hücrelerin kullanılmasını gerektirir. Bununla birlikte, mast hücreleri gibi birincil immünolojik hücreler, özellikle sinoksik etkilere ve biyoink matrisinin kendisi tarafından ortaya çıkabilecek fenotipik deği...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Bu çalışma Kanada Ulusal Araştırma Konseyi ve Alberta Innovates tarafından desteklendi.

Teşekkürler

Alberta Innovates'e CNC/agarose/D-mannitol matrisini hazırlarken teknik tavsiyeleri için CNC ve Ken Harris ve Jae-Young Cho'yu sağladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca Ben Hoffman, Heather Winchell ve Nicole Diamantides'e INKREDIBLE+ 3D biyobaskı kurulumu ve kalibrasyonu konusundaki teknik tavsiyeleri ve destekleri için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
A< / güçlü>
Asetik Asit (buzul)Sigma AldrichAX0074-6
Agaroz (OmniPur)EMD Millipore Corporation2125-500GM
Ermeni Hamster IgG İzotip Kontrolü, APC (Klon: eBio299Arm)Thermo Fisher Scientific17-4888-82
B
b-MerkaptoetanolFisher ScientificO3446I-100
b-Nikotinamid adenin dinükleotid sodyum tuzu (NAD)Sigma AldrichN0632-5G
BD 5 mL Şırınga (Luer-Lok Ucu)BD309646
BD PrecisionGlide İğnesi 26G x 1/2 inçBD305111
BioLite 24 Kuyulu Çok BoyutluTermo Fisher Scientific930-186
BioLite 96 Kuyulu Çok ÇanaklıThermo Fisher Scientific130-188
BioLite 175 cm2 Şişe BacalıThermo Fisher Scientific130-191
Biyogüvenlik Kabini Sınıf IIMicrozone Corp., KanadaBK-2-6-B3
BSA, Fraksiyon V (OmniPur)EMD Millipore Corporation2930-100GM
< / güçlü >
C57BL / 6 fareJackson Laboratuvarı000664
CD117 (c-Kit) Monoklonal Antikor, PE (Klon: 2B8)Thermo Fisher Scientific12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Kartuş)CELLINK LLCIK1020000303
CELLINK CaCl2 Çapraz Bağlama Maddesi - Steril Şişe 1 x 60 mLCELLINK LLC
CELLINK Boş Kartuşlar 3cc, Uç ve Uç KapaklıCELLINK LLCCSC0103000102
CELLINK HeartWare for PCCELLINK LLCSürüm 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIYOYAZICICELLINK LLCS-10003-001
CELLINK Steril Standart Konik Biyobaskı Nozulları 22GCELLINK LLC
CELLINK Steril Standart Konik Biyobaskı Nozulları 25GCELLINK LLC
CELLINK Steril Standart Konik Biyobaskı Nozulları 27GCELLINK LLC
Hücre Proliferasyon Kiti II (XTT) (Roche)Sigma Aldrich11465015001
Santrifüj (Tezgah Üstü)Eppendorf5804R
Corning Costar  96 İyi Şeffaf Düz Tabanlı İşlem Görmemiş PS MikroplakaSigma AldrichCLS3370
CO2 İnkübatörüBinder GmbH, Almanya9040-0113
CytoFLEX Akış SitometresiBeckman CoulterA00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)Fisher Scientific44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polistiren Konik Tüpler, SterilCorning352095
Falcon 50 mL Polistiren Konik Tüpler, SterilCorning352070
FceR1 alfa Monoklonal Antikor, APC (Klon: MAR-1)Thermo Fisher Scientific17-5898-82
Fetal Sığır Serumu (FBS), nitelikli, ısı inaktiveedilmiş Thermo Fisher Scientific12484028
FlowJo YazılımıBecton Dickinson & Co. ABDSürüm 10.6.2
G
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCSürüm 8.4.3
H
Hemacytometer (Geliştirildi Neubauer 0,1 mmm derinlik vergisi)VWR15170-208
HEPES Sodyum TuzuFisher ScientificBP410-500
I
İyodonitrotetrazolyum klorür (INT)Sigma AldrichI10406-5G
L
L-Glutamin 200 mM (Gibco)Thermo Fisher Scientific25030-081
Lityum L-laktatSigma AldrichL2250-100G
M
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler 100 mL 100x (Gibco)Thermo Fisher Scientific11140-050
1-Metoksi-5-metilfenazinyum metil sülfat (MPMS)Sigma AldrichM8640
Mikrotüpler (1,7 mL şeffaf)AxygenMCT-175-C
Mikrotüpler (2,0 mL şeffaf)AxygenMCT-200-C
MilliQ Academic (MilliQ ultra saf su üretmek için)MilliporeZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filtre Ünitesi (0,2 mm Gözenek boyutu, 500 mL)Thermo Fisher Scientific566-0020
Nalgene Şırınga filtresi (0,2 mm PES, 25 mm)Thermo Fisher Scientific725-2520
P
Penisilin Streptomisin 100 mL (Gibco)Thermo Fisher Scientific15140-122
PBS pH 7.4, Kalsiyum/Magnezyum Yok, 500 mL (Gibco) Thermo Fisher Scientific10010-023
Propidium iyodür, 1.0 mg/mL (İnvitrojen) Thermo Fisher ScientificP3566
R
Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, PE (Klon: eB149/10H5)Thermo Fisher Scientific12-4031-82
Rekombinant Murin IL-3PeproTech, Inc. 213-13
RPMI-1640 Orta 1X + 2.05 mM L-Glutamin (HyClone)GE HealthcareSH30027.01
S
Sarstedt 96 kuyulu yuvarlak tabanlı PS şeffaf mikro test plakası (82.1582.001)Fisher ScientificNC9913213
Sodyum Azide, 500 gFisher ScientificBP922I-500
Sodyum Piruvat (100 mM) 100X (Gibco)Thermo Fisher Scientific11360-070
T
Tris Baz (2-amino-2(hidroksimetil)-1,3-propandiol)Sigma Aldrich252859
Tripan Mavisi çözeltisi (%0.4, mikroskopi için)Sigma Aldrich93595
V
VARIOSKAN LUX Mikroplaka Spektrofotometresi (Tip: 3020)Thermo Fisher ScientificVLBL00D0
CL1010006001 NZ4220005001 NZ4250005001 NZ4270005001

Kaynaklar

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  2. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  3. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
  4. Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , Springer. Cham. 1345-1363 (2019).
  5. Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57(2020).
  6. Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35(2019).
  7. Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613(2020).
  8. Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010(2019).
  9. Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
  10. Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
  11. Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
  12. Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
  13. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001(2019).
  14. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  15. Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
  16. Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
  17. Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B Biyobas mKemik li i Mast H creleriHidrojel skeleAk SitometrisiH cre Canl l k AnaliziBiyobelirte EkspresyonuXTT AnaliziLDH Sal n m
Kemik İliği Türevi Mast Hücre Kültürü için Kristal Nanoselüloz Gömülü Agarose Biyomalzeme Mürekkep İmalatı
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.