Apple Pulp'da Sitoplazmik Ca2+'yı Fluo-4/AM ile Boyama

Özet

Elma hamuru hücrelerinin izole protoplastları sitoplazmik Ca²⁺ konsantrasyonu tespit etmek için kalsiyum floresan reaktif ile yüklendi.

Özet

Sitosoleik Ca^2+, bitki gelişiminde önemli bir rol oynar. Kalsiyum görüntüleme sitoplazmada Ca²⁺ dinamik değişiklikleri tespit etmek için en çok yönlü yöntemdir. Bu çalışmada enzimatik hidroliz ile pulpa hücrelerinin uygulanabilir protoplastlarını elde ettik. İzole protoplastlar 37 °C'de 30 dakika boyunca küçük moleküllü floresan reaktif (Fluo-4/AM) ile inkübe edildi. Floresan problar sitosolik Ca^2+'yı başarıyla lekeledi, ancak vakuollerde birikmedi. La³⁺, bir Ca^{2 +} kanal engelleyici, sitoplazmik floresan yoğunluğunu azalttı. Bu sonuçlar Fluo-4/AM'nin meyve etinde sitosolik Ca²⁺ değişikliklerini tespit etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Özetle, protoplastları meyvenin et hücrelerinden etkili bir şekilde izole etmek ve pulpa hücrelerinin sitoplazmında küçük moleküllü kalsiyum floresan reaktif yükleyerek Ca^2+'yı tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Giriş

Ca²⁺ bitki sinyali transdüksiyonu ve metabolizmasında önemli bir rol oynar^1,2. Ayrıca, meyve kalitesi özelliklerini düzenler^3,4, sertlik, şeker içeriği ve depolama sırasında fizyolojik bozukluklara duyarlılık dahil^5,6. Sitoplazmik Ca²⁺ sinyal transdüksiyonunda önemli bir rol oynar ve bitki büyümesini ve gelişimini düzenler⁷. Hücresel kalsiyum homeostaz rahatsızlığı elmalarda acı çukura neden olabilir⁸, armutlarda kahverengi n....

Protokol

1. Protoplast ekstraksiyonu

1. Temel çözeltiyi hazırlayın: 20 mM CaCl₂, 5 mM 2-(N-morfolon)etanesülfonic asit ve 0.4 M D-sorbitol.
   NOT: Temel çözeltinin pH'ı 0,1 M Tris tampon ile 5,8'e ayarlandı, 0,22 μm suda çözünür filtrelerden süzdü ve 4 °C'de depolandı.
2. Enzymatic çözeltiyi hazırlayın: %0,3(w/v) Macerozyme R-10 ve %0,5(w/v) selüloz R-10'u temel çözelti ile karıştırın.
3. 1,5 mL santrifüj tüpüne 0,5 mL enzymatic çözelti ekleyin. Sağlıklı ve olgun bir elma seçin. Daha sonra hamuru 10 x 5 x 1 mm³ boyutunda dilimleyin (Şekil 1A-1C).
4. Elma meyve ham....

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokole uyarak, pulpadan uygulanabilir protoplastlar elde etmek için enzimatik yöntemi kullandık (Şekil 1). Bazı protoplastlarda vakuoller vardı, bazılarında ise yoktu. Protoplastlar, Ca²⁺ floresan göstergesi onlara yüklenmediğinde floresan sergilemezken. Fluo-4/AM protoplastlara yüklendiğinde, sitoplazma, ancak vakuol değil, floresan oldu (Şekil 2). Bu sonuç, Fluo-4/AM'nin sitoplazmada Ca^2+'yı başarıyla lekelediğini ve.......

Tartışma

Bu çalışmada enzimatik hidroliz ile uygulanabilir protoplastlar elde edilmiştir. Bu yöntemin taze elma gerektirdiğini unutmayın. Mevcut protokol, araştırma çalışmalarında kullanılmak üzere çok sayıda protoplastın meyve hamurundan hızlı bir şekilde izole edilmesini sağlar. Bu yöntemin uygulanabilirliği 'Fuji' ile sınırlı değildir; 'Dounan' ve 'Honey Crisp' elma hamurunun protoplastları da aynı protokolle çıkarılabilir (Ek Şekil S4). Enzimolizden sonra protoplast çözeltisi, önceki yöntemlere kıyasla biraz .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 kez; fosfat tamponlu salin	Solarbio	P1022	PBS (fosfat tamponlu çözelti), nispeten kararlı bir iyonik ortam ve pH tamponlama kapasitesi sağlayabilen bir fosfat tampon çözeltisidir. Biyolojide moleküler klonlama ve hücre kültürü için sıklıkla kullanılan bir tampon tuz çözeltisidir. pH değeri 7.4'tür.
2- (N-morfolino) etansülfonik asit	Solarbio	M8010	Biyolojik tampon
CaCl < alt > 2 < / alt > ve orta nokta; 2H2O	Solarbio	C8370	Kalsiyum klorür dihidrat, çoğunlukla granül formda beyaz veya gri bir kimyasaldır.
Selülaz R-10	Yakult Honsha	MX7352	Bitki hücre duvarlarını bozar.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	İyi nemlendirme özelliklerine sahiptir, kurumayı önler ve şeker, tuz vb. kristalleşmesini önler.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127, suda çözünmeyen boyaların ve diğer malzemelerin fizyolojik ortamda çözünmesini teşvik etmek için faydalı olduğu bulunan iyonik olmayan, yüzey aktif madde bir polioldür (yaklaşık 12500 Dalton moleküler ağırlık).
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA, hem floresansını aktive etmek için gerekli olan enzimatik aktiviteyi hem de floresan ürünlerinin hücre içi tutulması için gerekli olan hücre-zar bütünlüğünü ölçen bir canlılık probu olarak hizmet edebilen, hücre bazlı bir esteraz substratıdır.
Fluo-4/	Thermo Fisher Scientific	F14201	Yeşil floresan kalsiyum indikatörü Fluo-4/, kalsiyum indikatörü Fluo-3/'nin geliştirilmiş bir versiyonudur. Fluo-4/daha hızlı yüklenir ve aynı konsantrasyonda daha parlaktır. 488 nm argon iyon lazer ile iyi bir şekilde uyarılabilir.
Floresan mikroskobu	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Floresan görüntüsünü gözlemleyin.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Tek hücreleri ayırmak için bitki dokusunu bozun.
Tris	Solarbio	T8060	Biyokimya ve moleküler biyoloji deneylerinde tamponların hazırlanmasında yaygın olarak kullanılmaktadır.