Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Primer Pankreas Kanseri ve Metastazında Tümör Mikroçevresinin Preklinik Modelleri Olarak Organotipik Dilim Kültürleri

3.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62541

⸱

22 Haziran 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University Medical Center Schleswig-Holstein, 2Institute of Medical and Marine Biotechnology, University of Lübeck, 3Fraunhofer Research and Development Center for Marine and Cellular Biotechnology, 4Institute for Surgical Pathology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Tumorbank Comprehensive Cancer Center Freiburg, Medical Center - University of Freiburg, 6Core Facility Histopathology and Digital Pathology Freiburg, Medical Center - University of Freiburg

Bu makalede

Özet

Bu protokol, organotipik dilim kültürlerinin (OTSC'ler) hazırlanmasını tanımlar. Bu teknik, sağlam çok hücreli dokunun ex vivo olarak yetiştirilmesini kolaylaştırır. OTSC'ler, çok hücreli bir ortamda ilaçlara karşı ilgili yanıtlarını test etmek için hemen kullanılabilir.

Özet

Primer pankreas kanseri ve metastazın gerçekçi preklinik modellerine, tedavi yanıtını ex vivo olarak test etmek ve kişiselleştirilmiş hasta tedavisini kolaylaştırmak için acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Bununla birlikte, şu anda kullanılan modellerde, örneğin hastadan türetilen hücre dizileri ve ksenogreftlerde tümöre özgü mikro ortamın olmaması, yalnızca sınırlı öngörücü içgörülere izin verir. Organotipik dilim kültürleri (OTSC'ler), uzamsal olarak çözülmüş ilaç yanıt testi için hızlı bir şekilde kullanılabilen sağlam çok hücreli doku içerir.

Bu protokol, pankreas kanserinin canlı tümör dilimlerinin oluşturulmasını ve yetiştirilmesini ve metastazını tanımlar. Kısaca doku, düşük eriyik agaroz içinde dökülür ve soğuk izotonik tamponda saklanır. Daha sonra, bir vibratom ile 300 μm kalınlığında doku dilimleri oluşturulur. Hazırlandıktan sonra dilimler, hücre kültürü ekleri ve uygun bir yetiştirme ortamı kullanılarak bir hava-sıvı arayüzünde kültürlenir. Yetiştirme sırasında, hücre farklılaşması ve canlılığındaki değişiklikler izlenebilir. Ek olarak, bu teknik, tedavinin canlı insan tümör dokusuna ex vivo olarak uygulanmasını ve ardından transkriptom ve proteom profili oluşturma gibi aşağı akış analizlerini mümkün kılar.

OTSC'ler, bireysel tedavi yanıtını ex vivo test etmek ve bir tümörün farklı dilimlerinin ilgili yanıtı ile ilişkili bireysel transkriptomik ve proteomik profilleri tanımlamak için eşsiz bir fırsat sağlar. Primer pankreas kanseri ve metastaz tedavisini kişiselleştirmek için terapötik stratejileri belirlemek için OTSC'ler daha fazla araştırılabilir.

Giriş

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) ve ilgili metastazların mevcut preklinik modelleri, hastalarda tedaviye yanıtın zayıf belirleyicileridir, bu da ilaç geliştirmede ve prediktif biyobelirteçlerin tanımlanmasında önemli bir eksikliktir1. Hasta kaynaklı organoidler ve hasta kaynaklı ksenogreftler gibi modeller umut verici olsa da, kullanımları sınırlı kalmaktadır2. Bu in vitro modellerin başlıca sınırlamaları, insan bağışıklığı baskılanmış olmayan türlerde tümör mikroçevresinin ve ksenogreftlemenin olmamasıdır. Özellikle PDAC ve metastazlarında, tümör mikroçevresi, tümör biyolojisindeki önemli işlevleri nedeniyle son yıllarda önemli ölçüde ilgi görmüştür. (miyo-) fibroblastlar, pankreas yıldız hücreleri, bağışıklık hücreleri, kan damarları, hücre dışı matriks, sitokinler ve büyüme faktörleri gibi hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri içerir3. Bu mikroçevre, fonksiyonel olmayan bir tümör bileşeni değildir, ancak tümör ilerlemesini ve metastazı indükler ve radyo ve kemoterapi direncine önemli ölçüde katkıda bulunuyor gibi görünmektedir4. PDAC mikro çevresi sadece ilaç dağıtımını mekanik olarak tehlikeye atmakla kalmaz, aynı zamanda bağışıklık ve ilaç süpürücü aktiviteyede sahiptir 5,6,7. Bu nedenle, hastaların tedavi yanıtını ex vivo olarak yeterince test etmek ve bireyselleştirilmiş klinik tedaviye rehberlik etmek için tümör hücrelerinin ve tümör mikroçevresinin karmaşık etkileşimini yansıtan preklinik modellere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.

Taze tümör örneklerinin ex vivo kültürleri, in situ tümörün yakın bir yaklaşımını temsil eder. Organotipik dilim kültürleri (OTSC'ler) yakın zamanda baş, boyun, meme, prostat, akciğer, kolon ve pankreas kanserleri gibi çeşitli tümörler için geliştirilmiş ve incelenmiştir 8,9,10,11,12. OTSC'lerin, tanımlanmış, dokuya bağlı bir süre boyunca yetiştirme sırasında temel morfolojilerini, proliferatif aktivitelerini ve mikro çevrelerini korudukları gösterilmiştir 11,12,13. PDAC'lerin OTSC'leri, çeşitli in vitro çalışmalarda4-9 gün boyunca canlılıklarını, morfolojilerini ve tümör mikroçevrelerinin çoğu bileşenini korumuştur 5,12,14. Perspektif olarak, bu teknik, tedavinin ex vivo olarak canlı insan tümör dokusuna anında uygulanmasını ve ardından transkriptom ve proteomun profillenmesi gibi aşağı akış analizlerini mümkün kılar.

OTSC'lerin kurulması, ameliyattan hemen sonra tedavi yanıtını ex vivo olarak test etmek için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu nedenle, OTSC'ler prospektif olarak metastatik hastalığın tedavisini kişiselleştirmek için terapötik stratejilerin belirlenmesine izin verecektir. Bu protokol, pankreas kanserinin canlı OTSC'lerinin üretilmesini ve yetiştirilmesini tanımlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Doku örnekleri, Lübeck Üniversitesi'nin yerel etik komitesi tarafından onaylandıktan sonra toplandı ve işlendi (# 16-281).

1. Taze doku toplama ve taşıma

NOT: Kan yoluyla bulaşan patojenlerden kaynaklanan enfeksiyon riskini önlemek için sabitlenmemiş her insan dokusu örneği dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Doku işlemeden önce tüm hastalar HIV, HBV ve HCV için negatif olarak test edilmelidir. Koruyucu bir ceket giyin ve insan dokusu örneklerini eldivenlerle tutun.

  1. Ameliyattan hemen sonra minimum 0,4 x 0,4 cm boyutunda taze, sabitlenmemiş ve dondurulmamış PDAC doku örneğini toplayın ve örneği bir doku saklama solüsyonunda laboratuvara taşıyın.
  2. Mümkün olduğunda, taze dokuyu hemen işleyin.
  3. Alternatif olarak, dokuları gece boyunca 4 ° C'de ıslak buz üzerinde doku saklama solüsyonunda saklayın. Bununla birlikte, doku depolaması canlılığın bozulmasına neden olabilir ve genellikle bundan kaçınılmalıdır.

2. Hazırlık

  1. Düşük erime noktalı agaroz hazırlama
    1. 8 g agarozu 100 mL önceden ısıtılmış Ringer solüsyonunda çözerek 100 mL düşük erime noktalı agaroz (%8) hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.
    2. Tümör rezeksiyonu duyurulduktan sonra, agarozu bir mikrodalgada eritin.
    3. Agarozu önceden ısıtılmış bir su banyosuna (37 °C) yerleştirin ve hazırlamadan önce fizyolojik sıcaklıklara soğumasını bekleyin.
  2. Vibratom kurulumu
    1. Vibratom tutucusuna bir tıraş bıçağı yerleştirin ve varsa üreticinin talimatlarına göre otomatik bir açı ayarı yapın.
    2. Bir soğutma ünitesi veya ıslak buz kullanarak kesme odasının ceketini soğutun.
    3. Kesme haznesini yaklaşık 100 mL fizyolojik bir kesme solüsyonu (örn. Ringer solüsyonu) ile doldurun.
    4. Monte edilmiş tıraş bıçağını önceden soğutulmuş kesme solüsyonuna yerleştirin ve tıraş bıçağının soğumasını bekleyin.

3. Düşük erime noktalı agarozda doku gömülmesi

  1. Doku örneğini soğutulmuş (4 ° C) PBS ile yıkayın ve dokuyu PBS'ye buz üzerinde büyük (~ 14 cm) bir Petri kabına yerleştirin.
  2. Kesme verimliliğini engelleyebileceğinden, makroskopik olarak görülebilen fazla bağ dokusunu bir neşter kullanarak buz üzerinde çıkarın.
  3. Dokuyu küçük bir Petri kabına (~ 3 cm) yerleştirin.
  4. Doku yönünü, makroskopik olarak görünür kalan bağ dokusu, Petri kabının alt düzlemi ile aynı yönelime sahip olacak şekilde ayarlayın. Petri kabının alt kısmı, kesme düzlemi ile aynı yöne sahiptir.
  5. Hazırlanan düşük erime noktalı agarozu küçük Petri kabına dökün.
  6. Gerekirse, forseps kullanarak dokunun yönünü yeniden ayarlayın.
  7. Agarozun daha hızlı sertleşmesi için Petri kabını ıslak buzun üzerine yerleştirin.
  8. Dokuyu bir neşter kullanarak dikkatlice kesin ve dokunun her iki tarafında en az 5 mm çevreleyen agaroz bırakın.
  9. Gömülü dokuyu dikkatlice aktarın ve süper yapıştırıcı kullanarak numune tutucuya yapıştırın.
  10. Birkaç saniye sonra numune tutucuyu kesme haznesine yerleştirin.
  11. Gerekirse, dokunun yönünü tıraş bıçağına doğru ayarlayın.

4. Agaroz gömülü dokunun vibratom kullanılarak dilimlenmesi

  1. Doku örneğinin boyutuna göre kesme aralığının (y ekseni) dış sınırlarını tanımlayın.
  2. Bıçağı doku bloğunun üst kısmına doğru ayarlayın.
  3. Kesme hızını 0,04 mm/sn'ye, kesme genliğini 1 mm'ye ve dilim kalınlığını 300 μm'ye ayarlayın.
  4. İlk dilimleri dikkatlice kesin ve dilimleri ıslak buz üzerinde önceden soğutulmuş (4 °C) kesme solüsyonu ile ayrı bir kaba aktarın.

5. Organotipik dilim kültürlerin kültürü

  1. Kuyu başına 1 mL uygun yetiştirme ortamı içeren 6 oyuklu bir plaka hazırlayın.
    1. Orta A: İleri DMEM/F12, %10 FBS, %1 Penisilin/Streptomisin.
    2. Orta B: RPMI 1640, %10 FBS, %1 Penisilin/Streptomisin, 4 μg/mL İnsülin, 8 ng/mL EGF, 0.3 μg/mL hidrokortizon.
      NOT: Optimal kültür koşulları için ortam, dokuya ve hastaya bağlı olarak değişebilir. Biri DMEM/F12'ye (orta A), ikincisi RPMI'ye (orta B) dayalı olmak üzere iki farklı doku kültürü ortamı karşılaştırıldı. Bu ortamlar arasında önemli bir fark tespit edilmedi. Bu protokolde gösterilen tüm deneyler için ortam A kullanılmıştır.
  2. 6 oyuklu plakayı ortamla birlikte bir inkübatöre yerleştirin ve ekimden önce sıcaklık ve pH'ın ayarlanmasına izin verin.
  3. Dilimleri, bir bakış filtresi kullanarak hücre kültürü eklerine (örneğin, 0,4 μm gözenek boyutuna sahip hidrofilik PTFE ekler) yerleştirin.
  4. Yüklenen filtreyi steril bir beze yerleştirerek fazla kesme solüsyonunu çıkarın.
  5. Yüklenen filtreyi hazırlanan 6 oyuklu plakaya yerleştirin. Ek parçaya herhangi bir ek ortam eklemeyin.
  6. 6 oyuklu plakayı bir inkübatöre yerleştirin (37 °C,% 5 CO2).
  7. 5.1, 5.2 ve 5.5 adımlarını yeni bir 6 oyuklu plaka ile tekrarlayarak ortamı her 2 günde bir değiştirin.
    NOT: Organotipik dilim kültürleri, bireysel araştırma sorusuna bağlı olarak çeşitli süreler boyunca kültürlenebilir.

6. Resazurin canlılık testi

NOT: Resazorin canlılık testi, canlı hücrelerde floresan olmayan mavi resazurinin kırmızı floresan resorufin'e indirgenmesine dayalı olarak organotipik dilim kültürlerinin genel metabolik aktivitesini ölçer15. Testin hücreler üzerinde toksik etkisi yoktur ve bireysel araştırma sorusuna bağlı olarak kültürlere tekrar tekrar uygulanabilir. Canlılık, her 2-3 günde bir resazurin testi kullanılarak ölçüldü.

  1. Resazorin stok çözeltisinin hazırlanması
    1. Steril davlumbazın ışığını kapatın, çünkü resazurin stok çözeltisi ışığa duyarlıdır.
    2. 1x PBS'de 10 mg / mL resazurin sodyum tuzu içeren bir stok çözeltisi hazırlayın.
    3. Stok solüsyonunu kullanılana kadar buzdolabında 4 °C'de ışık korumalı alikotlarda saklayın.
  2. Genel dilim canlılığının değerlendirilmesi
    1. Steril davlumbazın ışığını kapatın, çünkü resazurin stok çözeltisi ışığa duyarlıdır.
    2. Resazorin stok çözeltisini 1:250 uygun bir ortamla seyreltin.
      NOT: Seyreltme için kullanılan ortam, yetiştirme için kullanılanla aynı olmalıdır (orta A veya orta B).
    3. Dilim başına 1 mL nihai resazurin çözeltisi hazırlayın ve boş kontrol için 1 mL daha ekleyin, ör. 6 dilim için 28 μL resazurin stok çözeltisini 7 mL ortamda seyreltin.
    4. Resazorin çözeltisini, oyuk başına 1 mL seyreltilmiş resazurin çözeltisi ile 6 oyuklu plakalara dağıtın.
    5. Yetiştirme filtrelerini dilimlerle birlikte resazurin çözeltisi ile kuyulara aktarın. Resazorin çözeltisi ile bir kuyu boş kontrol olarak boş tutulur.
      NOT: Deneysel prosedürü basitleştirmek için, bu adım ortamın değiştirilmesiyle birleştirilebilir (adım 5.7). Bununla birlikte, ek canlılık ölçümlerine ihtiyaç duyulması durumunda, tahlil, dilim kültürlerinin yetiştirilmesi sırasında herhangi bir zamanda yapılabilir.
    6. Doku dilimlerini 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 1 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
    7. Dilim kültürüne devam edilirse, kültür ortamı ile yeni 6 oyuklu plakalar hazırlayın (bkz. adım 5.1 ve 5.2).
    8. Yetiştirme filtrelerini dilimlerle birlikte resazurin solüsyonundan çıkarın ve yüklü filtreyi steril bir beze yerleştirerek fazla solüsyonu çıkarın.
    9. Yetiştirme filtrelerini dilimlerle birlikte önceden hazırlanmış kültür plakasına aktarın.
    10. Her 6 oyuktan 100 μL resazurin çözeltisi alın ve 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Boş kontrolden, 96 oyuklu plakanın ayrı kuyucuklarına üç numune (3 x 100 μL) yerleştirin.
    11. Üreticinin talimatlarına göre bir plaka fotometre ile sönmeyi ölçün. Uyarma dalga boyu 545 nm'ye ve emisyon dalga boyu 600 nm'ye ayarlanmıştır.

7. OTSC'lerin formalin fiksasyonu ve parafin gömülmesi

  1. Ekili doku dilimlerini dikkatli bir şekilde plastik bir gömme kasetine aktarın. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Yetiştirme filtresini monte edilmiş dilimle birlikte bir Petri kabına yerleştirin.
    2. Bir neşter ile, filtre zarını monte edilmiş doku dilimi ile dikkatlice kesin.
    3. Filtre membranını monte edilmiş dilimle birlikte dikkatlice bir biyopsi naylon torbasına aktarın ve bir gömme kasetine yerleştirin.
    4. Daha sonra, plastik gömme kasetlerini önceden soğutulmuş (4 ° C)% 4.5 formalin içeren bir kaba aktarın. Dilimler, daha fazla kullanılana kadar 4 ° C'de formalin çözeltisi içinde tutulabilir, ancak en az 24 saat inkübe edilmelidir.
      NOT: OTSC'lerin kolayca parçalandıkları için çok dikkatli bir şekilde aktarılması gerekir.
  2. Formalinle sabitlenmiş dilim kültürünü 1,5 saat boyunca akan musluk suyuyla dikkatlice durulayın.
  3. Formalinle sabitlenmiş doku dilimini %70 etanol (3 saat için 2x), %95 etanol (gece boyunca 1x, 3 saat için 1x) ve ardından mutlak etanol (3 saat için 1x, gece boyunca 1x) içinde inkübe ederek dehidre edin.
  4. Formalinle sabitlenmiş doku dilimini iki kez ksilen içinde 3 saat inkübasyon ile temizleyin.
  5. Dokuyu 60 ° C'de parafin ile daldırın (gece boyunca 1 kez, 2 saat boyunca 1 kez). Dokuyu bir parafin bloğuna, bir doku gömme kalıbına gömün.
  6. Parafine gömülü doku bloğunu 4 μm kalınlığında bir mikrotom ile bölümlere ayırın ve damıtılmış su içeren 40 ° C'lik bir su banyosunda yüzdürün. Bölümleri cam slaytlara aktarın.
  7. Dokuyu cama bağlamak için parafin bölümlerini 60 ° C'de 1 saat inkübe edin. Slaytları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.

8. Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyama

  1. Ksilen içinde inkübasyon yoluyla (5 dakika boyunca 3 kez) adım 7.7'deki bölümleri deparafinize edin.
  2. Mutlak alkol (5 dakika için 2x), %95 alkol (5 dakika için 2x) ve %70 alkol (5 dakika için 1x) içinde inkübe ederek yeniden hidratlayın. Damıtılmış su ile kısa bir süre durulayın.
  3. Mayer hematoksilen solüsyonunda 5 dakika boyayın. Akan musluk suyu ile 10 dakika durulayın.
  4. 40 s boyunca% 0.5 Eozin çözeltisinde karşı leke. Damıtılmış su ile durulayın.
  5. Sırasıyla% 70 alkol (maksimum 1 dakika),% 95 etanol (3 dakika boyunca 2x) ve mutlak alkol (3 dakika boyunca 2x) içinde inkübasyon ile dehidrat.
  6. Üç ksilen değişiminde temizleyin (her biri birkaç saniye). Bir damla montaj ortamı yerleştirin ve slaytları bir lamel ile örtün.

9. OTSC'lerin İmmünohistokimyası

  1. Bölümleri ksilen 2x içinde 10 dakika inkübasyon yoluyla deparafinize edin, ardından 10 dakika boyunca 1: 1 etanol / ksilol uygulayın.
  2. Slaytları %100 etanole (3 dakika için 2x), %96 etanole (3 dakika için 2x), %70 etanole (3 dakika için 1x) ve ardından %50 etanole (3 dakika için 1x) aktarın.
  3. Antijenik epitopun maskesini çıkarmak için antijen alımı yapın. Slaytları bir mikrodalgada sitrat tamponunda 900 W'ta 5 dakika, ardından 600 W'ta 8 dakika 2 kez ısıtın. Slaytların 20 dakika oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
  4. PBS 3x'te bir çalkalayıcıda 3 dakika yıkayın.
  5. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100'de (slayt başına 200 μL) inkübasyon yoluyla hücre zarlarının geçirgenliğini gerçekleştirin.
  6. Çalkalayıcıda her biri 3 dakika olmak üzere üç değişiklik için PBS'de yıkayın.
  7. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için bölümleri metanol (slayt başına 200 μL) içinde nemlendirilmiş bir odada 10 dakika boyunca metanol içinde% 3 H2O2 çözeltisi ile inkübe edin.
  8. PBS 3x'te bir çalkalayıcıda 3 dakika yıkayın.
  9. 200 μL bloke edici tampon (PBS'de 1:50 at serumu) ekleyin ve oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 25 dakika inkübe edin.
  10. Slaytı bir kağıt mendil üzerinde eğerek slaytlardaki engelleme tamponunu boşaltın.
  11. Slaytlar üzerine antikor seyrelticide 200 μL uygun şekilde seyreltilmiş primer antikor uygulayın ve gece boyunca 4 ° C'de nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. Negatif bir kontrol olarak, birincil antikor ile aynı seyreltmede fare immünoglobulinlerinin uygun izoformunu kullanın.
  12. Bir çalkalayıcıda PBS'de 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  13. Slaytlara 200 μL biyotinile edilmiş ikincil antikor (PBS'de 1:50 çözelti) uygulayın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
  14. Bir çalkalayıcıda PBS'de 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  15. Uygulamadan önce avidin/biotin bazlı peroksidaz kompleksini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Slaytlara 200 μL avidin-biotin-peroksidaz kompleksi uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  16. Bir çalkalayıcıda PBS'de 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  17. 200 μL DAB substrat solüsyonu uygulayın (kullanımdan hemen önce taze yapılmış: 1 mL substratta 1 damla DAB), slayt başına 200 μL. İstenilen renk yoğunluğuna ulaşılana kadar renk gelişimine 1-3 dakika izin verin.
  18. Akan musluk suyu ile 10 dakika durulayın.
  19. Kenarları 5 dakika boyunca Hematoxylin'e batırarak slaytları lekeleyin.
  20. Akan musluk suyu ile 10 dakika durulayın.
  21. Sulu montaj ortamı ve lameller kullanarak slaytları örtün. Monte edilen slaytlar oda sıcaklığında kalıcı olarak saklanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1, taze, dondurulmamış tümör dokusundan OTSC'leri kültürlemek için iş akışına genel bir bakış sağlar. Primer PDAC ve metastaz örnekleri cerrahi rezeksiyondan hemen sonra toplandı ve doku saklama solüsyonunda 4 ° C'de ıslak buz üzerinde gece boyunca saklandı. Örnekler işlendi ve dilimler protokolde tarif edildiği gibi kültürlendi. Her OTSC'nin makroskopik morfolojisi, yetiştirme sırasında büyük ölçüde değişmedi. Bununla birlikte, OTSC'lerin yüzey alanının boyutu, 6 günlük ekim sırasında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Taze tümör örneklerinin OTSC'leri, in situ tümörün yakın bir yaklaşımıdır. Tanımlanmış, dokuya bağlı bir süre boyunca yetiştirme sırasında temel morfolojilerini, proliferatif aktivitelerini ve mikro çevrelerini korurlar 11,12,13. Bu teknik, tedavinin ex vivo olarak canlı insan tümör dokusuna hemen uygulanmasını ve ardından transkriptom ve proteomun profillenmesi gibi aşağı akış analizlerini sağlar. OTSC'lerin s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir potansiyel çıkar çatışması açıklamadılar.

Teşekkürler

R. Braun, Lübeck Klinisyen Bilim İnsanı Okulu (DFG #413535489) ve Lübeck Üniversitesi Genç Finansman Programı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Gelişmiş DMEM/F-12 OrtaGibco12634028
Agaroz Düşük EriyikRoth6351.2Ringer çözeltisinde %8
Antikor Seyreltici, Arka Plan AzaltıcıDakoS3022
AquaTexMerck108562
Biyoetanol (%99, denatüre)CHEMSolute2,21,19,010
Sitrik Asit monohidratSigma AldrichC7129
Bölünmüş Kaspaz-3 (Asp175) (5A1E) Tavşan mAbHücre Sinyalizasyon Teknolojisi96641:400 seyreltme
Derby Extra Çift Kenar Güvenlik Tıraş BıçaklarıDerby Tokai
Gömme kasetleriRothH579.1
Eosin Y-çözeltisi %0,5 suluMerck10,98,44,100
Eukitt Hızlı sertleşen montaj ortamıSigma-Aldrich3989
Fetal sığır serumuGibco10270106
Formaldehit çözeltisi %4,5, tamponluBü Mayer Roth
130-097-794
HidrokortizonSigma Aldrich (Merck)H0888
Hidrojen peroksit %30Merck1,08,59,71,000
Sıvı DAB+ Substrat Kromojen SistemiDakoK3468
MACS Doku Depolama SolüsyonuMilteniy Biotech130-100-008
MetanolMerck10.600.092.500
Mikroskop Slaytları Superfrost PlusThermo ScientificJ1800AMNZ
Milicell Hücre Kültürü Eki, 30 mm, hidrofilik PTFE, 0.4 &; mikro; mMillipore (Merck)PICM0RG50
Monoklonal fare anti-insan  Sitokeratin 7 (Klon OV-TL 12/30)DakoM70181:200 seyreltme
Monoklonal fare anti-insan Ki67 Klon MIB-1DakoM72401:200 seyreltme
Monoklonal fare Anti-vimentin (Klon V9)DakoM07251:200 seyreltme
Negatif kontrol Fare IgG2aDakoX09431:200 seyreltme
Negatif kontrol Fare IgG1DakoX093101-21:200 seyreltme
Parafin (erime sıcaklığı 56 derece ; - 58 derece;)Merck10,73,37,100
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)Gibco15140122
PBS pH 7,4 (1x) Akış Sitometrisi SınıfıGibcoA12860301
Resazurin sodyum tuzu; PBSSigma AldrichR70171:250 seyreltme içinde 10
Ringer çözeltisiFresenius Kabi2610813
RPMI-1640 OrtaSigma Aldrich (Merck)R8758
Doku kültürü test plakası 6TPP92006
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1
VECTASTAIN Elite ABC-Peroksidaz KitiVektör LaboratuvarlarıPK-6200
Ksilen (ekstra saf)JTbaker8,11,85,000
Ekipman
ClarioStar Mikroplaka OkuyucuBMG Labtech
Parafin Gömme Merkezi E61110Leica
Döner Mikrotom Mikrom HM355STermo Bilimsel Bölüm
Transfer Sistemi Mikrom STSTermo Bilimsel
VT 1200S VibratomLeica
T865'e göre hem şap çözeltisi asit hem Chemik B211101000 alien İnsülin insan Sigma Aldrich (Merck)12643 mg / ml

Kaynaklar

  1. Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nature Reviews. Clinical Oncology. 17 (2), 108-123 (2020).
  2. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  3. Waghray, M., Yalamanchili, M., di Magliano, M. P., Simeone, D. M. Deciphering the role of stroma in pancreatic cancer. Current Opinion in Gastroenterology. 29 (5), 537-543 (2013).
  4. Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  5. Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).
  6. Hessmann, E., et al. Fibroblast drug scavenging increases intratumoural gemcitabine accumulation in murine pancreas cancer. Gut. 67 (3), 497-507 (2018).
  7. Feig, C., et al. The pancreas cancer microenvironment. Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).
  8. Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
  9. Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
  10. Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).
  11. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8352-8356 (2010).
  12. Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
  13. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
  14. Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Science Reports. 9 (1), 2133(2019).
  15. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  16. Beutler, B., Cerami, A. Tumor necrosis, cachexia, shock, and inflammation: a common mediator. Annual Review of Biochemisty. 57, 505-518 (1988).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Pankreas Kanseri ModelleriEx Vivo la TestleriDoku Dilimi K lt rVibratom KesitlemeHava S v Aray zTranskriptom ProfillemeProteom ProfillemeCleaved Caspase 3 Boyamas
Primer Pankreas Kanseri ve Metastazında Tümör Mikroçevresinin Preklinik Modelleri Olarak Organotipik Dilim Kültürleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.