Vakum Yardımlı Sorbent Ekstraksiyonu ile İnsanla İlişkili Numunelerden Aktif Olarak Üretilen Mikrobiyal Uçucu Organik Bileşiklerin Yakalanması

Uçucu organik bileşikler (VOC'ler) bakteriyel tespit ve tanımlama için büyük umut vaat etmektedir, çünkü tüm organizmalardan yayılırlar ve farklı mikroplar benzersiz VOC imzalarına sahiptir. Uçucu moleküller, kronik obstrüktif akciğer hastalığı^{1, idrarda} tüberküloz^{2 3} ve ventilatör ilişkili pnömoni⁴ dahil olmak üzere çeşitli solunum yolu enfeksiyonlarını tespit etmek için invaziv olmayan bir ölçüm olarak kullanılmış, ayrıca kistik fibrozlu (KF) denekleri sağlıklı kontrol deneklerinden ayırt etmek ^5,6. Uçucu imzalar, KF'deki spesifik patojen enfeksiyonları ayırt etmek için bile kullanılmıştır (Staphylococcus aureus ⁷, Pseudomonas aeruginosa ^8,9 ve S. aureus vs. P. aeruginosa¹⁰). Bununla birlikte, bu tür biyolojik örneklerin karmaşıklığı ile, belirli VOC'lerin kaynağını belirlemek genellikle zordur.

Uçucu profilleri çoklu enfekte edici mikroplardan ayırmak için bir strateji, hem mono- hem de ko-kültürdeki mikroorganizmaların kafa boşluğu analizini yapmaktır¹¹. Kafa boşluğu analizi, numunenin kendisine gömülü olanlardan ziyade bir numunenin üzerindeki "kafa boşluğuna" yayılan analitleri inceler. Mikrobiyal metabolitler, karmaşık klinik örneklerde mikrobiyal metabolitlerin kökenini belirlemedeki zorluk nedeniyle mono-kültürlerde sıklıkla karakterize edilmiştir. Bakteriyel mono-kültürlerden uçucuların profilini çıkararak, bir mikrobun in vitro olarak ürettiği uçucu tipler, uçucu repertuarının bir taban çizgisini temsil edebilir. Bakteri kültürlerini birleştirmek, örneğin ortak kültürler oluşturmak ve üretilen uçucu moleküllerin profilini çıkarmak, bakteriler arasındaki etkileşimleri veya çapraz beslenmeyi ortaya çıkarabilir¹².

Uçucu moleküllerin mikrobiyal kökenini tanımlamak için bir başka strateji, kararlı bir izotop ile etiketlenmiş bir besin kaynağı sağlamaktır. Kararlı izotoplar doğal olarak oluşur, farklı sayıda nötrona sahip radyoaktif olmayan atom formlarıdır. 1930'ların başından beri hayvanlarda aktif metabolizmayı izlemek için kullanılan bir stratejide¹³, mikroorganizma etiketli besin kaynağından beslenir ve kararlı izotopu metabolik yolaklarına dahil eder. Daha yakın zamanlarda, klinik bir CF balgam örneği^14'te metabolik olarak aktif S. aureus'u tanımlamak için ağır su (D₂O) şeklinde kararlı bir izotop kullanılmıştır. Başka bir örnekte, P. aeruginosa ve Rothia mucilaginosa^12'nin CF klinik izolatları arasındaki metabolitlerin çapraz beslenmesini göstermek için ¹³C etiketli glikoz kullanılmıştır.

Kütle spektrometresi tekniklerinin ilerlemesiyle, uçucu ipuçlarını tespit etme yöntemleri nitel gözlemlerden daha nicel ölçümlere geçmiştir. Gaz kromatografisi kütle spektrometresi (GC-MS) kullanılarak, biyolojik numunelerin işlenmesi çoğu laboratuvar veya klinik ortam için ulaşılabilir hale gelmiştir. Uçucu molekülleri araştırmak için birçok yöntem, gıda, bakteri kültürleri ve diğer biyolojik numuneler ve kontaminasyonu tespit etmek için hava ve su gibi numunelerin profilini çıkarmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, yüksek verimli uçucu numune alımının birkaç yaygın yöntemi çözücü gerektirir ve vakumlu ekstraksiyonun sağladığı avantajlarla gerçekleştirilmez. Ek olarak, 15,16,17,18,19 analizi için genellikle daha büyük hacimler veya miktarlar (^{0,5 mL'den} büyük) numune alınan malzemeler gereklidir^, ancak bu substrata özgüdür ve her numune tipi ve yöntemi için optimizasyon gerektirir.

Burada, vakum yardımlı sorbent ekstraksiyonu (VASE), ardından bir GC-MS üzerinde termal desorpsiyon, bakteriyel mono- ve ko-kültürlerin uçucu profillerini araştırmak ve insan dışkısı, tükürük, kanalizasyon ve balgam örneklerinden stabil izotop sondalaması ile aktif olarak üretilen uçucuları tanımlamak için kullanılmıştır (Şekil 1). Sınırlı numune miktarlarıyla, VOC'ler 15 μL balgamdan ekstrakte edildi. İnsan örnekleriyle yapılan izotop sondalama deneyleri, mikrobiyal topluluğun büyümesini geliştirmek için ¹³C glikoz ve ortam gibi kararlı bir izotop kaynağı eklemeyi gerektiriyordu. Uçucuların aktif üretimi, GC-MS tarafından daha ağır bir molekül olarak tanımlanmıştır. Uçucu moleküllerin statik vakum altında ekstraksiyonu, artan hassasiyete sahip uçucu moleküllerin tespit edilmesini sağladı^20,21,22.

1. Headspace Sorbent Pen (HSP) ve numune analizi ile ilgili hususlar

NOT: Sorbent Tenax TA'yı içeren HSP, çok çeşitli uçucuları yakalamak için seçilmiştir. Tenax, diğer sorbentlere kıyasla su için daha düşük bir afiniteye sahiptir, bu da daha yüksek nemli numunelerden daha fazla VOC yakalamasını sağlar. Tenax ayrıca düşük safsızlık seviyesine sahiptir ve yeniden kullanım için şartlandırılabilir. Sorbent seçimi, GC-MS'ye takılan sütun da dikkate alınarak yapılmıştır ( bkz.

1. Numune ekstraksiyonu için kullanılan aynı koşullara sahip ortam ve/veya numune boşluklarını ayıklayarak negatif kontroller oluşturun.
2. Ayıklanan numuneleri analiz etmeden önce GC-MS üzerinde boş bir HSP'yi (daha önce temiz ve önemli bir arka plandan arındırılmış olduğu onaylanmıştır) analiz edin. Numune türleri arasında boşluklar çalıştırın (örneğin; üç bakteri mono-kültür replikası, boş, üç bakteri eş-kültür replikası, boş vb.).
3. Numune ekstraksiyonu ve analizinden önce kokulu kişisel bakım ürünlerinin kullanımını veya kokulu gıdaların tüketimini sınırlayın. İdeal olarak, numuneleri en az 30 dakika boyunca alkol veya diğer uçucu temizleyiciler tarafından temizlenmemiş bir biyogüvenlik başlığında hazırlayın. Numune hazırlamadan önce biyogüvenlik başlığındaki hava akışını 30-60 dakika boyunca açın.
4. Numune hazırlama sırasında uçucu salınımı sınırlamak için numuneleri buz üzerinde tutun.

2. Mono- ve ko-kültür hazırlığı

1. Biyogüvenlik başlığında, Todd Hewitt büyüme medyasında A. baumannii, S. aureus ve P. aeruginosa kültürlerini aşılayın. 200 rpm ajitasyon ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
2. Gece boyunca inkübasyondan sonra, biyogüvenlik başlığında kültür elleçlemesi yapın. Her kültürü 500 nm'de 0,05 optik yoğunluğa kadar seyreltin.
3. Ko-kültürleri eşit parçalarda karıştırın ve 200 μL kontrol ortamı, mono veya ko-kültür pipetini 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna karıştırın ve 24 saat boyunca 37 °C inkübatöre yerleştirin. 48 saatlik bir inkübasyon için ikinci bir plaka hazırlayın.
4. Kuluçka süresinin sonunda, bölüm 4'te ekstraksiyon için numuneler hazırlayın. Pipet sıvı kültürleri mikrosantrifüj tüplerine dönüştürür ve -80 °C'de saklar.
   NOT: Bu noktada, numuneler daha sonra gerekirse ekstrakte edilmek üzere -80 ° C'de saklanabilir.

3. Biyolojik numune hazırlamada kararlı izotop problaması

NOT: Dışkı ve tükürük örnekleri, California Üniversitesi Irvine Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (HS # 2017-3867) onayı ile isimsiz bağışçılardan bağışlanmıştır. Kanalizasyon San Diego, CA'dan geldi. Balgam örnekleri, Michigan Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu (HUM00037056) tarafından onaylanan daha büyük bir çalışmanın parçası olarak kistik fibrozlu deneklerden toplanmıştır.

1. Tüm biyolojik numune preparatlarını biyogüvenlik başlığında gerçekleştirin.
   1. Dışkı örnekleri hazırlamak için, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde ve vorteksinde 100 mg dışkıya 3 dakika boyunca 1 mL deiyonize su ekleyin. Kullanılmadığında buzun üzerine yerleştirin.
      1. 15 μL dışkı ve su karışımına, 20 mM 13 C glikoz ile 485 μL Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) ortamı veya% ³⁰döteryum (D₂O) ile BHI ekleyin. Numunenin son hacminin 500 μL olduğundan emin olun.
   2. Kanalizasyon numuneleri hazırlamak için, toplam 1 mL hacim için 20 mM 13 C glikoz ile 500 μL BHI'ya veya % ³⁰D₂O ile BHI'ya 500 μL kanalizasyon ekleyin. Örnekleri üçlü olarak hazırlayın. Kullanılmadığında buzun üzerine yerleştirin.
   3. Tükürük örnekleri hazırlamak için, toplam 550 μL hacim için 20 mM ¹³C glikoz ile 500 μL BHI'ya veya %30 D₂O ile BHI'ya 50 μL tükürük ekleyin. Kullanılmadığında buzun üzerine yerleştirin.
   4. Kültürlemeden önce ve sonra numunede bulunan uçucuları karşılaştırmak üzere balgam numuneleri hazırlamak için, 15 μL balgam ile ilk ekstraksiyonu gerçekleştirin. Örnekleri üçlü olarak hazırlayın. Kullanılmadığında buzun üzerine yerleştirin. Numune ekstraksiyonu için bölüm 4'e ilerleyin ve 200 rpm ajitasyon ile 37 °C'de 18 saat boyunca ekstraksiyon yapın.
   5. Kültürlenmemiş balgam örneklerinin ilk ekstraksiyonunun tamamlanmasından sonra, şişeleri balgamla kaydedin. 3.5.1'den balgamlı şişelere 20 mM ¹³C glikoz ile 500 μL BHI ekleyin. Kullanılmadığında buzun üzerine yerleştirin.
2. Numune ekstraksiyonu için bölüm 4'e geçin.

4. Numune çıkarma

1. Soğuk plakaya boş uçucu organik analiz (VOA) şişeleri (20 mL) yerleştirin ve soğuk plakayı biyogüvenlik başlığındaki buzun üzerine yerleştirin.
2. 5600 sorbentli kalem ekstraksiyon ünitesini (SPEU) açın ve her yöntem için gerektiği gibi istenen sıcaklığa ayarlayın.
   NOT: 37 °C'de kararlı izotop problama deneyleri için, ayar noktasına ulaşmak 15 dakikaya kadar sürebilir. 70 °C'de mono ve ko-kültür deneyleri için, ayar noktasına ulaşmak 60 dakikaya kadar sürebilir.
3. Medya veya numune denetimleri için HSP'ler de dahil olmak üzere hazırlanan numune sayısına eşit temiz HSP'ler toplayın.
4. 20 mL VOA şişelerini numunelere, çoğaltmalara ve HSP kimliklerine göre gerektiği gibi etiketleyin. Buz üzerindeyken şişenin dışında yoğuşma oluşması durumunda suya dayanıklı bir işaretleyici kullanın.
5. Biyogüvenlik başlığının içinde, şişe üzerindeki beyaz kapağı sökün, numuneyi şişeye hızlı bir şekilde pipetin ve siyah kapağı, kapak astarı ve HSP'yi monte edin.
   NOT: Numuneler HSP ile temas etmemelidir ve numune hacmi numune türüne bağlı olacaktır.
6. Numuneyi ve HSP'yi içeren şişeyi tekrar soğuk plakaya yerleştirin.
7. Her örnek için 4,5 ve 4,6 numaralı adımları yineleyin. Numunenin ısınmasını ve dolayısıyla erken uçucu salınımı önlemek için bu adımları bir kerede yerine numune başına uygulayın.
8. Tüm numuneler cam şişelerde hazırlandıktan sonra, tezgahtaki biyogüvenlik başlığının dışında aşağıdaki adımları uygulayın. Vakum pompasını açın, şişeleri vakum altına 30 mmHg'ye yerleştirin ve vakum kaynağını çıkarın.
   NOT: Vakum uygulaması tamamlandıktan sonra şişelerin soğuk tepside olması gerekmez.
9. Basınç göstergesini kullanarak tüm numuneleri vakum altına yerleştirdikten sonra basıncı iki kez kontrol edin. Bir şişede sızıntı varsa, kapağın sıkıca vidalandığından ve HSP ve kapak gömleklerinin beyaz O-ringlerinin düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
   NOT: Tehlikeye atılmış bir conta, vakum altındaki bir şişeye kıyasla uçucu algılamanın azalmasına neden olabilir.
10. Şişeleri, 200 rpm'de ajitasyon ile optimize edilmiş zaman ve sıcaklık için SPEU'ya yerleştirin. 70 °C'de 1 saat boyunca kültürleri ayıklayın. 37 ° C'de 18 saat boyunca dışkı, kanalizasyon, tükürük ve balgam örnekleri ile kararlı izotop problama deneylerini çıkarın.
11. Soğuk plakayı, ekstraksiyon süresi tamamlandıktan sonra kullanılmak üzere -80 ° C'ye yerleştirin.
12. Ekstraksiyon tamamlandığında, HSP ve şişe kafa boşluğundan su buharı çekmek için numuneleri soğuk plakaya 15 dakika boyunca yerleştirin.
13. HSP'leri kılıflarına aktarın.
    NOT: Deney, HSP'lerden daha uçucu bileşikleri kaybetmeden önce oda sıcaklığında ~ 1 haftaya kadar burada duraklatılabilir.

5. Gaz kromatografisindeki numuneleri analiz edin - kütle spektrometresi (GC-MS)

1. Aşağıdaki GC-MS ( Malzeme Tablosuna bakın) ayarlarını kullanın: 5 dakikalık bekletme ile 35 °C, 10 °C/dak rampa - 170 °C ve 20:1 bölme oranı ve toplam 38 dakika çalışma süresi ile 230 °C'ye 15 °C/dak rampa.
2. Desorpsiyon yöntemini aşağıdaki gibi ayarlayın: 2 dakika, 70 °C ön ısıtma; 2 dk 260 °C desorpsiyon; 34 dk, 260 °C fırınlama; ve 2 dk, 70 °C sonrası pişirin.
3. Numune sırasını ayarlayın ve çalıştırmayı ölçümlü izlemeye göre başlatın.
   1. Entech Yazılımı üzerinde bir dizi ayarlamak için programı açın. Cihaz açılır menüsünün sağındaki seçeneklerde 5800'ü seçin | Sıra.
   2. Entech yazılımındaki sıralama tablosunu GC-MS yazılımındakine benzer şekilde gözlemleyin. Örnek Kimliği sütununu Geçerli date_vial numarasına göre adlandırın. Ad'ın GC-MS sıra tablosundaki Ad'a benzer olduğunu ve 5800 Yöntemi'nin sıcaklık rampasının hızını, bekletme sürelerini vb. belirlediğini unutmayın (adım 5.2'de oluşturulan yöntemi seçmek için bir menü açar).
   3. Tepsi ve Konum sütunlarının, Numune Hazırlama Rayı (SPR) HSP'leri almak için nereye gideceğini belirlediğini unutmayın.
      1. Her biri hemen solda 30 noktalı, her biri beş noktalı altı sütun olarak yerleştirilmiş iki tepsiyi gözlemleyin. Kullanıcıya en solda ve en yakın tepsi konumu (ön) konum 1, en sağdaki en uzak konum ise 30'dur.
      2. Bu tepsilerin HSP A veya B olduğunu, burada HSP B'nin SPR'ye (en içteki tepsi) daha yakın tepsi olduğunu ve HSP B'nin hemen arkasında HSP Boş olduğunu unutmayın. Ayıklanan numuneleri tepsilere yerleştirin ve sırayla noktayı buna göre seçin.
   4. Sıra tablosunu kaydedin, sol tarafta Çalıştır'ı seçin, ardından boş HSP desorber'daysa (sarı etiketle işaretlenmiş bir HSP ile gösterilir) desorber'da boş ile başlayın .
4. HSP'lerin dizideki her örnek için SPR tarafından işleneceğini unutmayın. SPR'nin ısınmasına izin verin, ardından boşluğun desorberde olup olmadığını onaylamak için ekranın üst kısmında bir mesaj görünecektir. Kalemin orada olduğunu onaylamak için Atla üzerine tıklayın. SPR'nin tüm örnekleri otomatik olarak çalıştırmasına izin verdiğinizde, GC-MS tarafındaki sıra verileri otomatik olarak ayrı dosyalara kaydeder.

6. Veri analizi

1. GC-MS yazılımındaki kalite filtresi verileri (Malzeme Tablosu).
   1. Kromatogramdaki her tepe noktasını gözden geçirin ve Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü (NIST) kütüphanesiyle (veya mevcut başka bir kütüphaneyle) eşleşen tepe noktalarına açıklama ekleyin.
   2. İşleme yöntemine açıklamalı kromatogram pikleri ekleyin. Tepe noktalarının seçilmesi için kriterleri,% 75'ten daha büyük bir olasılığa sahip bileşikleri içerecek şekilde ayarlayın ve bileşiğin her bir tanımlayıcı iyonunun hizalanmasının zirvenin merkezinde yer almasını sağlayın.
      1. İşleme yöntemine tepe noktası eklemek için Kalibre et'i seçin | Bileşik | Düzenle İsim | Harici Standart Bileşik altında bileşik ekleyin. Bileşiğin adını, tutma süresini, Quant Signal Target Ion'u ekleyin. En büyük üç zirveyi ekleyin. Kaydetmek için Tamam'ı | Yöntem | Kaydet'i tıklayın.
   3. İşlem yöntemi ayarlandıktan sonra, Quantitate | | hesaplayın ve görüntüleyin QEdit Quant Sonucu.
   4. Tepe noktalarının beklenen tutma süreleriyle hizalandığından ve arka plan gürültüsünün üzerinde olduğundan emin olmak için her bileşiği inceleyin.
   5. QEdit tamamlandıktan sonra Çıkış'ı seçin | QEdits'i kaydetmek ve ana kromatograma dönmek için evet. Sol taraftaki dosyayı açarak alan entegrasyonlarını dışa aktarın. Quantitate |'ı seçin Rapor Oluştur.
   6. DExSI'da kullanmak üzere dosyaları dışa aktarmak için Dosya |'ı seçin Verileri AIA biçimine | Dışa Aktarma Yeni Dizin oluşturun ve dosya için bir konum seçin veya Varolan Dizini Kullan'ı seçin.
   7. Dışa aktarılacak dosyaları seçmek için açılan yeni bir pencereye dikkat edin. Dosyaları pencerenin sağ tarafına taşıyın ve İşlem'e tıklayın. Dönüştürülen dosya sayısına bağlı olarak birkaç saniye ila birkaç dakika bekleyin.
2. DExSI yazılımının talimatlarına göre DExSI'deki izotop bolluğunu düzeltin (https://github.com/DExSI/DExSI) ve favori bir yazılım veya programla (örneğin, R) analiz yapın. Rakamları oluşturmak için kullanılan komut dosyaları https://github.com/joannlp/ VOC_SIP adresinde bulunur.

S. aureus, P. aeruginosa ve A. baumannii'nin mono ve ortak kültürleri
Mono ve ortak kültürler, S. aureus, P. aeruginosa ve A. baumannii bakteri türlerinden oluşuyordu. Bunlar, insan yaralarında ve kronik enfeksiyonlarda bulunan yaygın fırsatçı patojenlerdir. Mono- ve ko-kültürlerde bulunan uçucu molekülleri tanımlamak için, 200 rpm ajitasyon ile 70 ° C'de 1 saatlik kısa bir ekstraksiyon gerçekleştirildi. 24 ve 48 saatlik zaman noktalarındaki mono ve ko-kültürlerden, aralarında aldehitler, ketonlar, alkoller, sülfürik bileşikler, hidrokarbonlar, karboksilik asitler veya esterler ve aromatikler bulunan 43 açıklamalı uçucu molekül tespit edildi (Şekil 2). Sadece belirli mono veya ortak kültürlerde belirli zaman noktalarında tespit edilen az sayıda uçucu molekül vardı. Örneğin, asetoin ve 3-hidroksi-2-butanon asetat sadece S. aureus kültürlerinde 48-saatlik zaman noktasında tespit edilmiştir (Şekil 2).

Uçucu 1-propanol 2-metil sadece P. aeruginosa ve A. baumannii ko-kültüründe 48 saatte tespit edildi (Şekil 2). Etil asetat, A. baumannii ortak kültürlerinde S. aureus veya P. aeruginosa ile 48 saatte mevcuttu (Şekil 2). Heptan, 2,3-dimetil ve pentan, 2-metil metabolitleri sadece A. baumannii kültüründe 24 saatte tespit edildi (Şekil 2). Asetaldehit ve etanol, A. baumannii ve S. aureus ortak kültüründe, 24 saatlik zaman noktasında, 48 saate ve yalnızca kültürdeki suşlardan herhangi birine kıyasla daha yüksek göreceli bolluğa sahipti (Şekil 2). Uçucuların bazıları kültürlerde 24 veya 48 saatlik zaman noktasında daha fazlaydı. Asetik asit, butanoik asit ve propanoik asit dahil olmak üzere kısa zincirli yağ asitleri, 48 saatte kültürlerde yüksek nispi bolluktaydı, ancak 24 saatlik kültürlerde tespit edilmedi (Şekil 2). Hekzan, TH kontrolünde 24 saatte 48 saate kıyasla daha fazlaydı (Şekil 2).

Fekal, kanalizasyon ve tükürük numunelerinin kararlı izotop etiketlemesi
Biyolojik bir numuneden uçucu moleküllerin aktif üretimini tanımlamak için, mikrobiyal topluluğun büyümesini desteklemek için etiketli bir besin kaynağı, 13C glikoz veya D2O ve ortam eklenmiştir. Üçlü olarak dışkı, kanalizasyon ve tükürük örneklerinin farklı numune türlerinin her birinden benzersiz bir örnek analiz edildi. 13C'nin tamamen etiketlenmiş uçucu moleküllere (Şekil 3A-D) döteryum ile birleşmeye kıyasla daha fazla dahil edilmesi vardı (Şekil 3E). 13 C, 2-bütanon, 3-hidroksi içine dahil edildi; 2,3-bütandion; asetik asit; ve tüm dışkı, kanalizasyon ve tükürük örnekleri için fenol (Şekil 3A).

Diğer etiketli uçucular iki veya bir numune tipinde tespit edildi. Örneğin, aseton, butanoik asit ve propanoik asit, tükürük ve kanalizasyonda etiketlenmiş olarak tespit edildi (Şekil 3B). Etiketli uçucular, dimetil trisülfür ve disülfit dimetil, hem dışkı hem de tükürük örneklerinde zenginleştirildi (Şekil 3C). Uçucular, 1-propanol, 2-bütanon, benzofenon, etanol ve metil tiyolasetat, sadece kanalizasyonda zenginleştirilmiştir (Şekil 3D). Etiketli uçucu, 2,3-pentanedoin, tükürük bakımından zenginleştirilmiştir (Şekil 3D). Döteryum uçuculara, asetik aside dahil edildi; benzaldehit, 4-metil; dimetil trisülfür; ve fenol, tükürük veya kanalizasyon örneklerinden (Şekil 3E). İzotop bakımından zenginleştirilmiş uçuculara ek olarak, birleştirilmiş kararlı izotoplar içermeyen uçucular tespit edildi. Örneğin, pirazin, 2,5-dimetil hariç pirazin bileşikleri, fekal, kanalizasyon ve tükürük örneklerinde tespit edildi, ancak 13C ile tam olarak zenginleştirilmedi (Ek Şekil S1).

Balgam numunelerinin kararlı izotop etiketlemesi
Kararlı izotop etiketleme stratejisi, kistik fibrozlu yedi insan denekten balgam örnekleri ile aktif olarak üretilen uçucuları tanımlamak için uygulanmıştır. Numunedeki uçucular, kararlı bir izotop etiketi ile kültürlenmiş örneklerden ortaya çıkanlarla karşılaştırıldı. Her numunenin her uçucu bileşeni iki kez analiz edildi: 13C glikoz ve ortam ile kararlı izotop problamadan önce ve sonra. Deneklerden toplanan örnekler üç farklı zaman noktasını veya klinik durumu kapsıyordu: başlangıç, alevlenme ve tedavi23. Kültürlü balgam örneklerinde etiketlenmiş olarak tespit edilen uçucular, kültürlenmemiş balgam örneklerinden gelen etiketlenmemiş uçuculara kıyasla farklı göreceli bolluklara sahipti. Balgam ile kararlı izotop sondalama deneylerindeki kültürleme koşulları, bazı mikropların büyümesini destekleyebilir ve kültürlenmemiş balgam örneklerine kıyasla uçucuların göreceli bolluklarında farklılıklara yol açabilir.

Örneğin, asetik asit, dimetil trisülfit, aseton ve propanal, 2-metil, kültürlenmiş balgam örneklerinde kültürlenmemiş balgam örneklerine kıyasla daha fazlaydı (Şekil 4). Arka plan odası havasında değişken miktarlarda bulunabilen 13 C etiketli etanolün tespit edilmesi, etanolün aktif olarak 13C glikozdan mikrobiyal metabolizma tarafından üretildiğine dair kanıt sağlar. Varyasyon miktarı, Permütasyonel Çok Değişkenli Varyans Analizi (PERMANOVA) ile değerlendirildiği gibi denek tarafından açıklandı ve iki farklı uçucu veri kümesi için de farklıydı (Tablo 1 ve Ek Şekil S2). 13C etiketli kültürlü balgam için, varyasyonun% 51'i denek tarafından açıklanırken, varyasyonun% 33'ü kültürsüz balgam örneklerinde uçucu maddelerden denek tarafından açıklanmıştır (Tablo 1). Yedi denekten 16S rRNA amplikon dizilimi ile belirlenen mikrobiyom topluluğu bileşimi her bir deneğe özgüdür (Ek Şekil S3) ve bireysel imzalar hem kültürlenmiş hem de kültürlenmemiş balgam uçucu moleküllerine de yansımıştır.

Kültürlü balgamda, 13 karbon ile tamamen etiketlenmiş 23uçucu tespit edildi. Balgam örneklerinden tespit edilen izotop bakımından zenginleştirilmiş (aktif) uçucular her denek için farklıydı. Yedi deneğin hepsinden balgam örneklerinde tespit edilen izotop zenginleştirmeli uçucular 2,3-bütandion idi; asetik asit; aseton; dimetil trisülfür; disülfür, dimetil; ve pirazin, 2,5-dimetil (Şekil 5). Bu uçucular tüm deneklerde tespit edilmesine rağmen, her denek için izotop zenginleştirmesi değişmiştir. Denek 7'den alınan örnekler, diğer altı deneğe kıyasla disülfit dimetilin daha yüksek izotop zenginleştirmesine sahipti (Şekil 5B). Aseton denek 4 ve 6'da daha yüksekti (Şekil 5). Bazı uçucular sadece belirli deneklerde 13C ile zenginleştirilmiştir. Örneğin, 1-bütanol, 3-metil ve propanoik asit, 2-metil sadece denek 2'den alınan örneklerin bir alt kümesinde zenginleştirilmiştir (Şekil 5). İzotop bakımından zenginleştirilmiş uçuculara ek olarak, aynı kültürlü balgamdan etiketlenmemiş olarak tespit edilen uçucular da vardı (Ek Şekil S4). Uçucu maddeler 2-piperidinon; benzaldehit, 4-metil; benzotiazol; butanoik asit, 3-metil; altıgenal; hekzan; izopropil alkol; fenol; propanoik asit, 2-metil; ve balgam örneklerinde pirolo-1,2-apirazin-1,4-dion, hekzahidro tespit edildi, ancak izotop bakımından zenginleştirilmedi (Ek Şekil S4).

Şekil 1: Protokol şeması. Biyolojik bir numune bir cam şişeye yerleştirilir ve kapak astarı ve Headspace Sorbent Pen ile birleştirilir. Yaklaşık 30 mmHg'lik bir basınca ulaşılana kadar şişeye bir vakum uygulanır. Vakum kaynağı çıkarılır ve şişeler, ısı, ajitasyon ve zaman yardımıyla statik bir ekstraksiyonun gerçekleştirildiği sorbent kalem ekstraksiyon ünitesine yerleştirilir. Ekstraksiyondan sonra, suyu kafa boşluğundan ve HSP'den çıkarmak için şişeler soğuk bir metal blok üzerine yerleştirilir. HSP'ler toplanır ve GC-MS üzerindeki termal desorpsiyon yoluyla çalıştırılır. Veriler ChemStation, DExSI ve R. Kısaltmaları ile analiz edilir: HSP = Headspace Sorbent Pen; GC-MS = gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: Mono ve ortak kültürlerin ısı haritası. VOC'ler mono ve ko-kültürlerden 24 ve 48 saatlik zaman noktalarında tespit edildi. Ortak kültürler, her bir suşu temsil eden harflerin kombinasyonlarıdır. Tüm numuneler 200 rpm ajitasyon ile 70 °C'de 1 saat boyunca ekstrakte edildi. Isı haritası yoğunluk değerleri, metabolit tarafından normalleştirilen sütun Z-skorlarıdır. Z-skoru, değerlerin ortalamadan değer farkı, değerlerin standart sapmasına bölünerek hesaplandı. Dendrogram, R'nin pheatmap fonksiyonundaki cluster_cols seçeneğiyle oluşturuldu. Dendrogram, birlikte kümelenen metabolitlerin örnekler arasında daha benzer Z-puanlarına sahip olduğu hiyerarşik kümelemeyi temsil eder. Kısaltmalar: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = Todd Hewitt medya (kontrol). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 18 saatlik eşzamanlı inkübasyon ve ekstraksiyon sırasında fekal, tükürük ve kanalizasyon örneklerinde 13C'nin uçucu molekül kütlesine yüzde dönüşümü. % dönüşümü, tam etiketli bileşiğin (M + N) kütlesi alınarak ve (M + N) + etiketlenmemiş uçucu kütlenin (M) kütlesine bölünerek tam etiketli bileşikler için hesaplanmıştır; burada N, her bir uçucu molekülde etiketlenebilecek maksimum olası karbon ( A-D) veya hidrojen ( E cinsinden) sayısıdır. Bileşiklerin, uçucunun tüm karbonları 13C ile değiştirildiğinde tamamen etiketlenmiş olarak kabul edilir. Verilerin eksik olduğu yerlerde, uçucu tespit edilmedi. Örneğin, (D)'de, dışkı veya tükürük örneklerinde 1-propanol tespit edilmedi. Örnek başına çoğaltma sayısı = 3. (A) Tüm numune türlerinde (dışkı, tükürük ve kanalizasyon) tespit edilen 13C etiketli uçucu. (B) Sadece tükürük ve kanalizasyon numunelerinde tespit edilen 13C etiketli uçucu. (C) Dışkı ve tükürük örneklerinde tespit edilen 13C etiketli uçucu. (D) Üç farklı numune tipinden birinde tespit edilen 13C etiketli uçucu. (E) Döteryum etiketli uçucu moleküller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kültürlü balgamdan 13C etiketli uçucu maddenin ve kültürsüz balgamdan tespit edilen uçucu moleküllerin ısı haritası. Etiketli uçucular, mikrobiyal büyümeyi geliştirmek ve aktif uçucu üretimi yakalamak için ekstraksiyon adımı sırasında balgama 13C glikoz ve Beyin Kalp İnfüzyon ortamının eklendiği kararlı izotop sondalama deneylerinden gelir. Etiketlenmemiş uçucu moleküller doğrudan balgam örneklerinden tespit edildi. Isı haritası yoğunlukları, Şekil 2'nin başlığında açıklandığı gibi Z-skorlarıdır. Bununla birlikte, kültürlü ve kültürsüz balgam deneyleri için her deneyde Z-skorları hesaplanmıştır. Dendrogram, Şekil 2'de açıklandığı gibi oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: 18 saatlik eşzamanlı inkübasyon ve ekstraksiyon sırasında kistik fibrozisli yedi denekten alınan balgam örneklerinde 13C'nin uçucu molekül kütlesine yüzde dönüşümü. Dönüşüm yüzdesi, Şekil 3'ün başlığında açıklandığı gibi hesaplanmıştır. Numunelerde tespit edilmeyen uçucular, veri yokluğu ile gösterilir. N = 1-3. (A) Balgam örneklerinin çoğunda daha yüksek bir yüzde dönüşümünde tespit edilen 13C etiketli uçucu. (B) Balgam örneklerinin çoğunda daha düşük bir yüzde dönüşümünde tespit edilen 13C etiketli uçucu. (C) Balgam örneklerinin azınlığında daha düşük bir yüzde dönüşümünde tespit edilen 13C etiketli uçucu. Kısaltmalar: B = taban çizgisi; E = alevlenme; T = tedavi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Balgam örneklerinin varyansının (PERMANOVA) permüte çok değişkenli analizi. PERMANOVA, R'deki vegan paketinden adonis fonksiyonu kullanılarak üretildi.

Ek Şekil S1: Fekal, tükürük ve kanalizasyon numuneleri boyunca etiketli (M + N (maksimum)) ve etiketsiz (M + 0) uçucuların göreceli bolluğu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S2: Kararlı izotop sondalama ve kültürsüz balgam ile kültürlü balgamın metrik olmayan çok boyutlu ölçeklendirilmesi. (A) 13C glikoz ve ortam içeren kültürlü balgamın NMDS'si k = 3 boyutlu olarak üretildi. Stres değeri 0.07 idi. (B) Kültürsüz balgamın NMDS'si k = 3 boyutlarında üretildi. Stres değeri 0.13 idi. Kısaltmalar: NMDS = metrik olmayan çok boyutlu ölçeklendirme; B = taban çizgisi; E = alevlenme; T = tedavi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S3: Kistik fibrozlu deneklerden balgam örneklerinin mikrobiyal topluluk bileşimi. Daha büyük bir çalışmanın parçası olarak 16S rRNA amplikon dizilimi ile değerlendirilen, Carmody et al. 202019'da bulunan yaklaşım hakkında daha fazla bilgi. kistik fibrozlu deneklerden. Yığılmış her çubuk farklı bir zaman noktasıdır. Kısaltmalar: B = taban çizgisi, E = alevlenme, T = tedavi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S4: Kistik fibrozlu yedi denekten alınan balgam örnekleri boyunca etiketli (M + N (maksimum)) ve etiketsiz (M + 0) uçucuların göreceli bolluğu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

V. L. V ve S. J.B. D., Entech Instruments Inc.'in eski çalışanlarıydı ve K. W., Entech'in Üniversite Programı'nın bir üyesidir. J. P., J. K. ve C. I. R.'nin beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.