Method Article

Vakum Yardımlı Sorbent Ekstraksiyonu ile İnsanla İlişkili Numunelerden Aktif Olarak Üretilen Mikrobiyal Uçucu Organik Bileşiklerin Yakalanması

DOI:

10.3791/62547

⸱

June 1st, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California Irvine, 3Entech Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, biyolojik bir numuneden uçucu organik bileşiklerin vakum destekli sorbent ekstraksiyon yöntemi, Entech Numune Hazırlama Rayı kullanılarak kütle spektrometresi ile birleştirilmiş gaz kromatografisi ve veri analizi ile ekstraksiyonunu açıklar. Ayrıca biyolojik örneklerin kültürünü ve kararlı izotop sondalamasını da açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik örneklerden elde edilen uçucu organik bileşiklerin (VOC'ler) bilinmeyen kökenleri vardır. VOC'ler, konakçıdan veya konağın mikrobiyal topluluğundan farklı organizmalardan kaynaklanabilir. Mikrobiyal VOC'lerin kökenini çözmek için, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter baumannii'nin bakteriyel mono- ve ko-kültürlerinin uçucu kafa boşluğu analizi ve dışkı, tükürük, kanalizasyon ve balgamın biyolojik örneklerinde kararlı izotop sondalaması yapıldı. Mono- ve ko-kültürler, bireysel bakteri türlerinden uçucu üretimi tanımlamak için veya biyolojik örneklerden mikropların aktif metabolizmasını tanımlamak için kararlı izotop sondalaması ile kombinasyon halinde kullanılmıştır.

VOC'leri çıkarmak için vakum yardımlı sorbent ekstraksiyonu (VASE) kullanıldı. VASE, yarı uçucu ve uçucu bileşikler için kullanımı kolay, ticarileştirilmiş, solventsiz bir kafa boşluğu ekstraksiyon yöntemidir. Solventlerin eksikliği ve ekstraksiyon sırasında kullanılan vakuma yakın koşullar, tert-bütilasyon ve katı faz mikroekstraksiyonu gibi diğer ekstraksiyon seçenekleriyle karşılaştırıldığında nispeten kolay ve hızlı bir yöntem geliştirmeyi sağlar. Burada açıklanan iş akışı, mono ve ortak kültürlerden belirli geçici imzaları tanımlamak için kullanılmıştır. Ayrıca, insanla ilişkili biyolojik örneklerin kararlı izotop sondalamasının analizi, yaygın veya benzersiz bir şekilde üretilen VOC'leri tanımladı. Bu yazıda VASE'nin genel iş akışı ve deneysel hususları, canlı mikrobiyal kültürlerin stabil izotop problanması ile birlikte sunulmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uçucu organik bileşikler (VOC'ler) bakteriyel tespit ve tanımlama için büyük umut vaat etmektedir, çünkü tüm organizmalardan yayılırlar ve farklı mikroplar benzersiz VOC imzalarına sahiptir. Uçucu moleküller, kronik obstrüktif akciğer hastalığı1, idrarda tüberküloz2 3 ve ventilatör ilişkili pnömoni4 dahil olmak üzere çeşitli solunum yolu enfeksiyonlarını tespit etmek için invaziv olmayan bir ölçüm olarak kullanılmış, ayrıca kistik fibrozlu (KF) denekleri sağlıklı kontrol deneklerinden ayırt etmek 5,6. Uçucu imzalar, KF'deki spesifik patojen enfeksiyonları ayırt etmek için bile kullanılmıştır (Staphylococcus aureus 7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 ve S. aureus vs. P. aeruginosa10). Bununla birlikte, bu tür biyolojik örneklerin karmaşıklığı ile, belirli VOC'lerin kaynağını belirlemek genellikle zordur.

Uçucu profilleri çoklu enfekte edici mikroplardan ayırmak için bir strateji, hem mono- hem de ko-kültürdeki mikroorganizmaların kafa boşluğu analizini yapmaktır11. Kafa boşluğu analizi, numunenin kendisine gömülü olanlardan ziyade bir numunenin üzerindeki "kafa boşluğuna" yayılan analitleri inceler. Mikrobiyal metabolitler, karmaşık klinik örneklerde mikrobiyal metabolitlerin kökenini belirlemedeki zorluk nedeniyle mono-kültürlerde sıklıkla karakterize edilmiştir. Bakteriyel mono-kültürlerden uçucuların profilini çıkararak, bir mikrobun in vitro olarak ürettiği uçucu tipler, uçucu repertuarının bir taban çizgisini temsil edebilir. Bakteri kültürlerini birleştirmek, örneğin ortak kültürler oluşturmak ve üretilen uçucu moleküllerin profilini çıkarmak, bakteriler arasındaki etkileşimleri veya çapraz beslenmeyi ortaya çıkarabilir12.

Uçucu moleküllerin mikrobiyal kökenini tanımlamak için bir başka strateji, kararlı bir izotop ile etiketlenmiş bir besin kaynağı sağlamaktır. Kararlı izotoplar doğal olarak oluşur, farklı sayıda nötrona sahip radyoaktif olmayan atom formlarıdır. 1930'ların başından beri hayvanlarda aktif metabolizmayı izlemek için kullanılan bir stratejide13, mikroorganizma etiketli besin kaynağından beslenir ve kararlı izotopu metabolik yolaklarına dahil eder. Daha yakın zamanlarda, klinik bir CF balgam örneği14'te metabolik olarak aktif S. aureus'u tanımlamak için ağır su (D2O) şeklinde kararlı bir izotop kullanılmıştır. Başka bir örnekte, P. aeruginosa ve Rothia mucilaginosa12'nin CF klinik izolatları arasındaki metabolitlerin çapraz beslenmesini göstermek için 13C etiketli glikoz kullanılmıştır.

Kütle spektrometresi tekniklerinin ilerlemesiyle, uçucu ipuçlarını tespit etme yöntemleri nitel gözlemlerden daha nicel ölçümlere geçmiştir. Gaz kromatografisi kütle spektrometresi (GC-MS) kullanılarak, biyolojik numunelerin işlenmesi çoğu laboratuvar veya klinik ortam için ulaşılabilir hale gelmiştir. Uçucu molekülleri araştırmak için birçok yöntem, gıda, bakteri kültürleri ve diğer biyolojik numuneler ve kontaminasyonu tespit etmek için hava ve su gibi numunelerin profilini çıkarmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, yüksek verimli uçucu numune alımının birkaç yaygın yöntemi çözücü gerektirir ve vakumlu ekstraksiyonun sağladığı avantajlarla gerçekleştirilmez. Ek olarak, 15,16,17,18,19 analizi için genellikle daha büyük hacimler veya miktarlar (0,5 mL'den büyük) numune alınan malzemeler gereklidir, ancak bu substrata özgüdür ve her numune tipi ve yöntemi için optimizasyon gerektirir.

Burada, vakum yardımlı sorbent ekstraksiyonu (VASE), ardından bir GC-MS üzerinde termal desorpsiyon, bakteriyel mono- ve ko-kültürlerin uçucu profillerini araştırmak ve insan dışkısı, tükürük, kanalizasyon ve balgam örneklerinden stabil izotop sondalaması ile aktif olarak üretilen uçucuları tanımlamak için kullanılmıştır (Şekil 1). Sınırlı numune miktarlarıyla, VOC'ler 15 μL balgamdan ekstrakte edildi. İnsan örnekleriyle yapılan izotop sondalama deneyleri, mikrobiyal topluluğun büyümesini geliştirmek için 13C glikoz ve ortam gibi kararlı bir izotop kaynağı eklemeyi gerektiriyordu. Uçucuların aktif üretimi, GC-MS tarafından daha ağır bir molekül olarak tanımlanmıştır. Uçucu moleküllerin statik vakum altında ekstraksiyonu, artan hassasiyete sahip uçucu moleküllerin tespit edilmesini sağladı20,21,22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Headspace Sorbent Pen (HSP) ve numune analizi ile ilgili hususlar

NOT: Sorbent Tenax TA'yı içeren HSP, çok çeşitli uçucuları yakalamak için seçilmiştir. Tenax, diğer sorbentlere kıyasla su için daha düşük bir afiniteye sahiptir, bu da daha yüksek nemli numunelerden daha fazla VOC yakalamasını sağlar. Tenax ayrıca düşük safsızlık seviyesine sahiptir ve yeniden kullanım için şartlandırılabilir. Sorbent seçimi, GC-MS'ye takılan sütun da dikkate alınarak yapılmıştır ( bkz.

  1. Numune ekstraksiyonu için kullanılan aynı koşullara sahip ortam ve/veya numune boşluklarını ayıklayarak negatif kontroller oluşturun.
  2. Ayıklanan numuneleri analiz etmeden önce GC-MS üzerinde boş bir HSP'yi (daha önce temiz ve önemli bir arka plandan arındırılmış olduğu onaylanmıştır) analiz edin. Numune türleri arasında boşluklar çalıştırın (örneğin; üç bakteri mono-kültür replikası, boş, üç bakteri eş-kültür replikası, boş vb.).
  3. Numune ekstraksiyonu ve analizinden önce kokulu kişisel bakım ürünlerinin kullanımını veya kokulu gıdaların tüketimini sınırlayın. İdeal olarak, numuneleri en az 30 dakika boyunca alkol veya diğer uçucu temizleyiciler tarafından temizlenmemiş bir biyogüvenlik başlığında hazırlayın. Numune hazırlamadan önce biyogüvenlik başlığındaki hava akışını 30-60 dakika boyunca açın.
  4. Numune hazırlama sırasında uçucu salınımı sınırlamak için numuneleri buz üzerinde tutun.

2. Mono- ve ko-kültür hazırlığı

  1. Biyogüvenlik başlığında, Todd Hewitt büyüme medyasında A. baumannii, S. aureus ve P. aeruginosa kültürlerini aşılayın. 200 rpm ajitasyon ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  2. Gece boyunca inkübasyondan sonra, biyogüvenlik başlığında kültür elleçlemesi yapın. Her kültürü 500 nm'de 0,05 optik yoğunluğa kadar seyreltin.
  3. Ko-kültürleri eşit parçalarda karıştırın ve 200 μL kontrol ortamı, mono veya ko-kültür pipetini 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna karıştırın ve 24 saat boyunca 37 °C inkübatöre yerleştirin. 48 saatlik bir inkübasyon için ikinci bir plaka hazırlayın.
  4. Kuluçka süresinin sonunda, bölüm 4'te ekstraksiyon için numuneler hazırlayın. Pipet sıvı kültürleri mikrosantrifüj tüplerine dönüştürür ve -80 °C'de saklar.
    NOT: Bu noktada, numuneler daha sonra gerekirse ekstrakte edilmek üzere -80 ° C'de saklanabilir.

3. Biyolojik numune hazırlamada kararlı izotop problaması

NOT: Dışkı ve tükürük örnekleri, California Üniversitesi Irvine Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (HS # 2017-3867) onayı ile isimsiz bağışçılardan bağışlanmıştır. Kanalizasyon San Diego, CA'dan geldi. Balgam örnekleri, Michigan Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu (HUM00037056) tarafından onaylanan daha büyük bir çalışmanın parçası olarak kistik fibrozlu deneklerden toplanmıştır.

  1. Tüm biyolojik numune preparatlarını biyogüvenlik başlığında gerçekleştirin.
    1. Dışkı örnekleri hazırlamak için, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde ve vorteksinde 100 mg dışkıya 3 dakika boyunca 1 mL deiyonize su ekleyin. Kullanılmadığında buzun üzerine yerleştirin.
      1. 15 μL dışkı ve su karışımına, 20 mM 13 C glikoz ile 485 μL Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) ortamı veya% 30döteryum (D2O) ile BHI ekleyin. Numunenin son hacminin 500 μL olduğundan emin olun.
    2. Kanalizasyon numuneleri hazırlamak için, toplam 1 mL hacim için 20 mM 13 C glikoz ile 500 μL BHI'ya veya % 30D2O ile BHI'ya 500 μL kanalizasyon ekleyin. Örnekleri üçlü olarak hazırlayın. Kullanılmadığında buzun üzerine yerleştirin.
    3. Tükürük örnekleri hazırlamak için, toplam 550 μL hacim için 20 mM 13C glikoz ile 500 μL BHI'ya veya %30 D2O ile BHI'ya 50 μL tükürük ekleyin. Kullanılmadığında buzun üzerine yerleştirin.
    4. Kültürlemeden önce ve sonra numunede bulunan uçucuları karşılaştırmak üzere balgam numuneleri hazırlamak için, 15 μL balgam ile ilk ekstraksiyonu gerçekleştirin. Örnekleri üçlü olarak hazırlayın. Kullanılmadığında buzun üzerine yerleştirin. Numune ekstraksiyonu için bölüm 4'e ilerleyin ve 200 rpm ajitasyon ile 37 °C'de 18 saat boyunca ekstraksiyon yapın.
    5. Kültürlenmemiş balgam örneklerinin ilk ekstraksiyonunun tamamlanmasından sonra, şişeleri balgamla kaydedin. 3.5.1'den balgamlı şişelere 20 mM 13C glikoz ile 500 μL BHI ekleyin. Kullanılmadığında buzun üzerine yerleştirin.
  2. Numune ekstraksiyonu için bölüm 4'e geçin.

4. Numune çıkarma

  1. Soğuk plakaya boş uçucu organik analiz (VOA) şişeleri (20 mL) yerleştirin ve soğuk plakayı biyogüvenlik başlığındaki buzun üzerine yerleştirin.
  2. 5600 sorbentli kalem ekstraksiyon ünitesini (SPEU) açın ve her yöntem için gerektiği gibi istenen sıcaklığa ayarlayın.
    NOT: 37 °C'de kararlı izotop problama deneyleri için, ayar noktasına ulaşmak 15 dakikaya kadar sürebilir. 70 °C'de mono ve ko-kültür deneyleri için, ayar noktasına ulaşmak 60 dakikaya kadar sürebilir.
  3. Medya veya numune denetimleri için HSP'ler de dahil olmak üzere hazırlanan numune sayısına eşit temiz HSP'ler toplayın.
  4. 20 mL VOA şişelerini numunelere, çoğaltmalara ve HSP kimliklerine göre gerektiği gibi etiketleyin. Buz üzerindeyken şişenin dışında yoğuşma oluşması durumunda suya dayanıklı bir işaretleyici kullanın.
  5. Biyogüvenlik başlığının içinde, şişe üzerindeki beyaz kapağı sökün, numuneyi şişeye hızlı bir şekilde pipetin ve siyah kapağı, kapak astarı ve HSP'yi monte edin.
    NOT: Numuneler HSP ile temas etmemelidir ve numune hacmi numune türüne bağlı olacaktır.
  6. Numuneyi ve HSP'yi içeren şişeyi tekrar soğuk plakaya yerleştirin.
  7. Her örnek için 4,5 ve 4,6 numaralı adımları yineleyin. Numunenin ısınmasını ve dolayısıyla erken uçucu salınımı önlemek için bu adımları bir kerede yerine numune başına uygulayın.
  8. Tüm numuneler cam şişelerde hazırlandıktan sonra, tezgahtaki biyogüvenlik başlığının dışında aşağıdaki adımları uygulayın. Vakum pompasını açın, şişeleri vakum altına 30 mmHg'ye yerleştirin ve vakum kaynağını çıkarın.
    NOT: Vakum uygulaması tamamlandıktan sonra şişelerin soğuk tepside olması gerekmez.
  9. Basınç göstergesini kullanarak tüm numuneleri vakum altına yerleştirdikten sonra basıncı iki kez kontrol edin. Bir şişede sızıntı varsa, kapağın sıkıca vidalandığından ve HSP ve kapak gömleklerinin beyaz O-ringlerinin düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
    NOT: Tehlikeye atılmış bir conta, vakum altındaki bir şişeye kıyasla uçucu algılamanın azalmasına neden olabilir.
  10. Şişeleri, 200 rpm'de ajitasyon ile optimize edilmiş zaman ve sıcaklık için SPEU'ya yerleştirin. 70 °C'de 1 saat boyunca kültürleri ayıklayın. 37 ° C'de 18 saat boyunca dışkı, kanalizasyon, tükürük ve balgam örnekleri ile kararlı izotop problama deneylerini çıkarın.
  11. Soğuk plakayı, ekstraksiyon süresi tamamlandıktan sonra kullanılmak üzere -80 ° C'ye yerleştirin.
  12. Ekstraksiyon tamamlandığında, HSP ve şişe kafa boşluğundan su buharı çekmek için numuneleri soğuk plakaya 15 dakika boyunca yerleştirin.
  13. HSP'leri kılıflarına aktarın.
    NOT: Deney, HSP'lerden daha uçucu bileşikleri kaybetmeden önce oda sıcaklığında ~ 1 haftaya kadar burada duraklatılabilir.

5. Gaz kromatografisindeki numuneleri analiz edin - kütle spektrometresi (GC-MS)

  1. Aşağıdaki GC-MS ( Malzeme Tablosuna bakın) ayarlarını kullanın: 5 dakikalık bekletme ile 35 °C, 10 °C/dak rampa - 170 °C ve 20:1 bölme oranı ve toplam 38 dakika çalışma süresi ile 230 °C'ye 15 °C/dak rampa.
  2. Desorpsiyon yöntemini aşağıdaki gibi ayarlayın: 2 dakika, 70 °C ön ısıtma; 2 dk 260 °C desorpsiyon; 34 dk, 260 °C fırınlama; ve 2 dk, 70 °C sonrası pişirin.
  3. Numune sırasını ayarlayın ve çalıştırmayı ölçümlü izlemeye göre başlatın.
    1. Entech Yazılımı üzerinde bir dizi ayarlamak için programı açın. Cihaz açılır menüsünün sağındaki seçeneklerde 5800'ü seçin | Sıra.
    2. Entech yazılımındaki sıralama tablosunu GC-MS yazılımındakine benzer şekilde gözlemleyin. Örnek Kimliği sütununu Geçerli date_vial numarasına göre adlandırın. Ad'ın GC-MS sıra tablosundaki Ad'a benzer olduğunu ve 5800 Yöntemi'nin sıcaklık rampasının hızını, bekletme sürelerini vb. belirlediğini unutmayın (adım 5.2'de oluşturulan yöntemi seçmek için bir menü açar).
    3. Tepsi ve Konum sütunlarının, Numune Hazırlama Rayı (SPR) HSP'leri almak için nereye gideceğini belirlediğini unutmayın.
      1. Her biri hemen solda 30 noktalı, her biri beş noktalı altı sütun olarak yerleştirilmiş iki tepsiyi gözlemleyin. Kullanıcıya en solda ve en yakın tepsi konumu (ön) konum 1, en sağdaki en uzak konum ise 30'dur.
      2. Bu tepsilerin HSP A veya B olduğunu, burada HSP B'nin SPR'ye (en içteki tepsi) daha yakın tepsi olduğunu ve HSP B'nin hemen arkasında HSP Boş olduğunu unutmayın. Ayıklanan numuneleri tepsilere yerleştirin ve sırayla noktayı buna göre seçin.
    4. Sıra tablosunu kaydedin, sol tarafta Çalıştır'ı seçin, ardından boş HSP desorber'daysa (sarı etiketle işaretlenmiş bir HSP ile gösterilir) desorber'da boş ile başlayın .
  4. HSP'lerin dizideki her örnek için SPR tarafından işleneceğini unutmayın. SPR'nin ısınmasına izin verin, ardından boşluğun desorberde olup olmadığını onaylamak için ekranın üst kısmında bir mesaj görünecektir. Kalemin orada olduğunu onaylamak için Atla üzerine tıklayın. SPR'nin tüm örnekleri otomatik olarak çalıştırmasına izin verdiğinizde, GC-MS tarafındaki sıra verileri otomatik olarak ayrı dosyalara kaydeder.

6. Veri analizi

  1. GC-MS yazılımındaki kalite filtresi verileri (Malzeme Tablosu).
    1. Kromatogramdaki her tepe noktasını gözden geçirin ve Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü (NIST) kütüphanesiyle (veya mevcut başka bir kütüphaneyle) eşleşen tepe noktalarına açıklama ekleyin.
    2. İşleme yöntemine açıklamalı kromatogram pikleri ekleyin. Tepe noktalarının seçilmesi için kriterleri,% 75'ten daha büyük bir olasılığa sahip bileşikleri içerecek şekilde ayarlayın ve bileşiğin her bir tanımlayıcı iyonunun hizalanmasının zirvenin merkezinde yer almasını sağlayın.
      1. İşleme yöntemine tepe noktası eklemek için Kalibre et'i seçin | Bileşik | Düzenle İsim | Harici Standart Bileşik altında bileşik ekleyin. Bileşiğin adını, tutma süresini, Quant Signal Target Ion'u ekleyin. En büyük üç zirveyi ekleyin. Kaydetmek için Tamam'ı | Yöntem | Kaydet'i tıklayın.
    3. İşlem yöntemi ayarlandıktan sonra, Quantitate | | hesaplayın ve görüntüleyin QEdit Quant Sonucu.
    4. Tepe noktalarının beklenen tutma süreleriyle hizalandığından ve arka plan gürültüsünün üzerinde olduğundan emin olmak için her bileşiği inceleyin.
    5. QEdit tamamlandıktan sonra Çıkış'ı seçin | QEdits'i kaydetmek ve ana kromatograma dönmek için evet. Sol taraftaki dosyayı açarak alan entegrasyonlarını dışa aktarın. Quantitate |'ı seçin Rapor Oluştur.
    6. DExSI'da kullanmak üzere dosyaları dışa aktarmak için Dosya |'ı seçin Verileri AIA biçimine | Dışa Aktarma Yeni Dizin oluşturun ve dosya için bir konum seçin veya Varolan Dizini Kullan'ı seçin.
    7. Dışa aktarılacak dosyaları seçmek için açılan yeni bir pencereye dikkat edin. Dosyaları pencerenin sağ tarafına taşıyın ve İşlem'e tıklayın. Dönüştürülen dosya sayısına bağlı olarak birkaç saniye ila birkaç dakika bekleyin.
  2. DExSI yazılımının talimatlarına göre DExSI'deki izotop bolluğunu düzeltin (https://github.com/DExSI/DExSI) ve favori bir yazılım veya programla (örneğin, R) analiz yapın. Rakamları oluşturmak için kullanılan komut dosyaları https://github.com/joannlp/ VOC_SIP adresinde bulunur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus, P. aeruginosa ve A. baumannii'nin mono ve ortak kültürleri
Mono ve ortak kültürler, S. aureus, P. aeruginosa ve A. baumannii bakteri türlerinden oluşuyordu. Bunlar, insan yaralarında ve kronik enfeksiyonlarda bulunan yaygın fırsatçı patojenlerdir. Mono- ve ko-kültürlerde bulunan uçucu molekülleri tanımlamak için, 200 rpm ajitasyon ile 70 ° C'de 1 saatlik kısa bi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro kültürlerde ve insanla ilişkili örneklerde uçucu üretimi tanımlamak için, P. aeruginosa, S. aureus ve A. baumanii'nin mono ve ko-kültürlerinin uçucu analizi ve farklı biyolojik örneklerin kararlı izotop sondalaması yapılmıştır. Mono- ve ko-kültürlerin analizinde, 70 °C'de 1 saat kısa bir ekstraksiyon yapılarak uçucular tespit edildi. Mono ve ortak kültürlerin uçucu analizi, hem bireysel türler tarafından hem de diğer türlerle etkileşimleri sırasında üretilen bileşiklerin araştırılması...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V. L. V ve S. J.B. D., Entech Instruments Inc.'in eski çalışanlarıydı ve K. W., Entech'in Üniversite Programı'nın bir üyesidir. J. P., J. K. ve C. I. R.'nin beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıyı dikkatli bir şekilde düzenledikleri için Heather Maughan ve Linda M. Kalikin'e teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NHLBI (hibe 5R01HL136647-04) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
13C glikozSigma-Aldrich389374-1G
2-Stg Diyafram PompasıEntech Instruments01-10-20030
20 mL VOA şişeleriFisher Scientific5719110
24 mm Delikli Siyah Kapaklar, septum yokEntech Instruments01-39-76044Bkapak astarını flakon üzerinde yerinde tutar
Sorbent kalemler için 24 mm flakon astarıEntech InstrumentsSP-L024S,kalemlerin flakonun üstünde vakum sızdırmazlığı yapmasına izin verir
5600 Sorbent kalem ekstraksiyon ünitesi (SPEU)Entech Instruments5600-SPES5600 Sorbent Kalem Ekstraksiyon Ünitesi -120 VAC
96 kuyulu tahlil plakalarıGenesee25-224
Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) ortamıSigma-Aldrich53286-500G
ChemStation SunucuYazılımıAgilent
DB-624 sütunuAgilent122-1364E60 m, 0,25 mm iç çap, 1,40 mikron film kalınlığı, GC-MS'de
Döteryum oksitSigma-Aldrich151882-1L
Dexsi yazılımıDexsi (açık kaynak)
GC-MS (Üç Eksenli Dedektörlü 7890A GC ve 5975C inert XL MSD)Üç eksenli Agilent7890A GC ve 5975C inert XL MSD dedektör
Headspace Bundle HS-B01, 120VAEntech InstrumentsSP-HS-B01Pakete dahil olan üst boşluk ekstraksiyonunu çalıştırmak için öğeler
Headspace sorbent kalem (HSP) - boşEntech InstrumentsSP-HS-0
Headspace sorbent kalem (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)Entech InstrumentsSP-HS-T3560
Mikrosantrifüj tüpleri (2 mL)VWR53550-792
O-ringlerEntech InstrumentsSP-OR-L024
Numune Hazırlama RayıEntech Instruments
Sorbent kalem termal düzenleyiciEntech Instruments3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) ortamıSigmaT1438-500G
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
  2. Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
  3. Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
  4. Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179(2015).
  5. Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
  6. Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
  7. Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
  8. Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87(2012).
  9. Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584(2014).
  10. Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826(2018).
  11. Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412(2015).
  12. Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151(2018).
  13. Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
  14. Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365(2018).
  15. Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
  16. Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184(2014).
  17. Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
  18. Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
  19. Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
  20. Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390(2020).
  21. Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
  22. Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
  23. Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12(2015).
  24. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060(2018).
  25. Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Volatile CompoundsVacuum Assisted Sorbent ExtractionStable Isotope ProbingHuman Biological SamplesVolatile Headspace AnalysisBacterial Mono CulturesCo Culture AnalysisGC MS AnalysisMetabolic Biomarker DiscoveryVolatile Metabolite Profiling

Related Articles