Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
DNA hasar yanıtının (DDR) incelenmesi, kanser tedavisi için DDR hedefli ilaçların kullanımı nedeniyle daha önemli hale gelen karmaşık ve temel bir alandır. Bu hedefler, çeşitli DNA onarım biçimlerini başlatan poli (ADP-riboz) polimerazlarıdır (PARP'lar). Parp inhibitörleri (PARPi) kullanarak bu enzimlerin inhibe edilmesi, meme kanseri tip 1 (BRCA1), BRCA2 veya BRCA2 (PALB2) ortağı ve lokalizatöründeki mutasyonlar nedeniyle homolog rekombinasyon (HR) eksikliği olan hücrelerde terapötik bir güvenlik açığı sağlayarak sentetik öldürücülüğe ulaşır.
PARPi ile tedavi edilen hücreler DNA çift iplikçik kopuları (DSB' ler) biriktirir. Bu kırılmalar DNA uç rezeksiyon makineleri tarafından işlenerek tek iplikli (ss) DNA oluşumuna ve daha sonra DNA onarımına yol açmaktadır. BRCA1 eksikliği olan bir bağlamda, 53BP1 ve DYNLL1 gibi DNA rezeksiyon inhibitörlerindeki mutasyonlar yoluyla DNA rezeksiyonunu canlandırmak PARPi direncine neden olur. Bu nedenle, selülodaki DNA rezeksiyonunun izlenebilmesi, DNA onarım yollarının daha net anlaşılması ve PARPi direncinin üstesinden gelmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. İmmünoresans (IF) tabanlı teknikler, DNA hasarından sonra küresel DNA rezeksiyonunun izlenmesini sağlar. Bu strateji 5-bromo-2′-deoksiyuridin (BrdU) ile uzun nabız genomik DNA etiketleme gerektirir. DNA hasarı ve DNA sonu rezeksiyonu sonrasında, ortaya çıkan tek iplikli DNA, özellikle yerel koşullar altında bir anti-BrdU antikoru tarafından tespit edilir. Ayrıca, DNA rezeksiyonu, hücre döngüsünün çeşitli aşamalarını ayırt etmek için hücre döngüsü belirteçleri kullanılarak da incelenebilir. S/G2 fazındaki hücreler İk içinde uç rezeksiyonunun incelenmesine izin verirken, G1 hücreleri homolog olmayan uç birleştirmeyi (NHEJ) incelemek için kullanılabilir. Bu IF yöntemi için hücre döngüsü ayrımcılığı ile birleştirilmiş ayrıntılı bir protokol bu makalede açıklanmıştır.
Giriş
DNA onarım faktörlerinin modülasyonu, özellikle DNA DSB onarım eksikliği olan tümör ortamlarında kanser tedavisi için sürekli gelişen bir yöntemdir. Spesifik onarım faktörlerinin inhibisyonu, kanser hücrelerini DNA'ya zarar veren ajanlara duyarlı hale getirmek için kullanılan ustaca stratejilerden biridir. Onlarca yıllık araştırma, DNA onarım genlerinin çeşitli mutasyonlarının terapötik strateji seçimleri için biyobelirteç olarak tanımlanmasına yol açtı1. Sonuç olarak, DNA onarım alanı, kişiselleştirilmiş tıp kavramını güçlendirerek çok çeşitli tedaviler sağlamak için ilaç geliştirme merkezi haline gelmiştir.
DSB'le....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre kültürü, tedavileri ve kapak hazırlığı
NOT: Işıtratlamanın yanı sıra tüm hücre kaplamaları, transeksiyonlar ve tedaviler steril bir hücre kültürü başlığı altında gerçekleşmelidir.
- 1. Gün
- 6 kuyulu bir plakaya, gerektiği kadar çok koşul için her kuyuya tek bir kapak kılıfı yerleştirin. Plaka ~150,000 HeLa hücreleri transfection veya ilaç tedavisi için, istenildiği gibi.
NOT: Transfecting ise, kaplama anında ters transfeksiyon yapılması önerilir veya yapışmaya izin vermek için kaplamadan birkaç saat sonra ileri transfeksiyon yapılması mümkündür. Hücreler eklenmeden önce transfeksiyon karışımının kapak kılıflarına ....
- 6 kuyulu bir plakaya, gerektiği kadar çok koşul için her kuyuya tek bir kapak kılıfı yerleştirin. Plaka ~150,000 HeLa hücreleri transfection veya ilaç tedavisi için, istenildiği gibi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolde Bromodeoxyuridine (BrdU) bazlı test, HeLa hücrelerinin ışınlama kaynaklı hasara rezeksiyon yanıtını nicel olarak ölçmek için kullanılmıştır. Oluşturulan ssDNA izleri immünofluoresans lekelemeden sonra farklı odaklar olarak görselleştirilir (Şekil 1A). Tanımlanan odaklar daha sonra ölçüldü ve çekirdekteki BrdU lekelemenin toplam entegre yoğunluğu olarak ifade edildi (Şekil 1B, Ek Şekil S1, Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede, selülodaki DNA rezeksiyonundaki varyasyonları ölçmek için IF boyamadan yararlanan bir yöntem açıklanmaktadır. DNA rezeksiyonu üzerindeki etkiyi gözlemlemek için mevcut standart RPA boyamasıdır; ancak bu, DNA replikasyondan etkilenebilecek dolaylı bir yöntemdir. Daha önce, BrdU pozitif ve BrdU negatif hücrelerde ortaya çıkan yoğunlukları sınıflandırmak için başka bir BrdU kuruluş tabanlı DNA rezeksiyonU tekniği tanımlanmıştır. Bu yöntem, hr geçirmeyen hücrelerin arka plan veya mitokondriyal lekelenme.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Marie-Christine Caron'a olağanüstü teknik tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri J.Y.M (CIHR FDN-388879) tarafından finanse edilen fonlarla desteklenmektedir. J.-Y.M. DNA Onarımı ve Kanser Terapötikleri'nde Tier 1 Kanada Araştırma Başkanı'nın sahibidir. J.O'S bir FRQS doktora öğrencisi ve S.Y.M frqs doktora sonrası öğrencisidir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alexa 568 keçi anti-tavşan | Moleküler problar | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 keçi anti-fare | Moleküler problar | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Ev yapımı | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alfa tübülin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Sağlık | RPN202 | 1:1000 |
| Tezgah Üstü X-ışını Işınlayıcı | Hücre Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoksiüridin (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Hücre profilleyici | Geniş Enstitü | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratuvar Sarma Filmi 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür) | Invitrogen Yaşam Teknolojisi | D1306 | |
| DMEM yüksek glikoz | Fisher bilimsel | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Sığır serumu | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Kapak Gözlükleri: Kareler 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Floresan mikroskop | Leica | DMI6000B | 63x daldırma objektifi |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INKÜBATÖR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | %37 CO2 |
| MgCl2 | BioShop Kanada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Kanada | SOD002.10 | |
| İğne | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Ürünleri | 311-010-CS | |
| PFA %16 | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| BORULAR | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Altın Antifade Mountant Canlandırıcı | Yaşam Teknolojisi | P-36930 | |
| RNAiMAX | Canlandırıcı | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA kontrolü | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodyum Deoksikolat, | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher bilimsel | BP337500 | |
| Cımbız |
Kaynaklar
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-path....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
