Method Article

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

DOI:

10.3791/62576

⸱

April 25th, 2021

 ,  , 
1Laboratory for Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak hücre lisat ve canlı hücrelerde protein oligomerlerini ve toplamayı ölçmek için bir prosedür sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein toplama, amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) vb. Çözünür veya yaygın protein oligomerlerini veya agregalarını tespit etmek ve analiz etmek için, tek bir molekül hassasiyetine sahip tek bir parçacığın difüzyon hızını ve parlaklığını tespit debilen floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılmıştır. Bununla birlikte, protein toplama tespiti için uygun prosedür ve know-how yaygın olarak paylaşılamamıştır. Burada, hücre lysate ve canlı hücrelerde toplama eğilimli proteinlerin difüzyon özellikleri için fcs ölçümünün standart bir prosedürünü gösteriyoruz: TAR DNA/ RNA bağlayıcı protein 43 kDa (TDP25) ve süperoksit dismutaz 1'in (SOD1) ALS ilişkili 25 kDa karboksil terminal parçası. Temsili sonuçlar, yeşil floresan protein (GFP) etiketli TDP25 agregalarının bir kısmının murine nöroblastom Neuro2a hücre lisatının çözünür kısmına biraz dahil edildiğini göstermektedir. Ayrıca, ALS ile ilişkili mutasyon taşıyan GFP etiketli SOD1 canlı hücrelerde daha yavaş bir difüzyon göstermektedir. Buna göre, burada FCS kullanarak difüzyon özelliği aracılığıyla protein toplamayı tespit etmek için prosedürü tanıtıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı gibi nörodejeneratif bozuklukları içeren proteintoplamalarının toksik olduğu ve hücre ve organlarda protein homeostazını (proteostaz) rahatsız edeceği bilinmektedir, bu da yaşlanmaya yol açabilir2. Protein toplamanın temizlenmesi terapötik bir strateji olarak beklenmiştir; bununla birlikte, protein toplama oluşumunu engelleyen ve protein agregalarını bozan kimyasallar (örneğin, küçük moleküller veya ilaçlar) henüz tespit edilmiştir. Ayrıca, protein toplamanın toksisiteyi nasıl uyguladığı zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Malzemeler ve reaktifler

  1. Hücre kültürü için pirojenik içermeyen çözümler ve ortam kullanın (Tablo 1).
  2. Ultra saf su kullanarak biyokimyasal deney için çözümler hazırlayın ve DNase/RNase free olarak kullanın.
  3. Çok denetim işlemine sahip hücre kültürü için uygun bir FBS seçin. Seçilen FBS lotları düzenli olarak değiştiğinden, FBS için katalog ve lot numarası burada temsil edilemez.
  4. Plazmid DNA
    1. eGFP monomer ifadesi için pmeGFP-N15'i hazırlayın; GFP-TDP25 ifadesi için pmeGFP-C1-TDP256; SOD1-G85R-GFP ekspresyörü için pmeGFP-N1-SOD1-G85R7;

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı hücrelerde hücre lisat ve SOD1-G85R-GFP'de GFP-TDP25 FCS ölçümü yaptık. Her iki durumda da pozitif genlik ve pürüzsüz ACL'ler elde edilebildi. Neuro2a hücrelerinde ifade edilen GFP-TDP25'in bir kısmının çözünür fraksiyonda belirtilen durum altında kurtarıldığini gösterdik6. Hücre lisatının çözünür fraksiyonunda, FCS(Şekil 2A, üst, ok) kullanılarak foton sayım oranı kaydında son derece parlak floresan molekülleri tespit edildi. Bu tür "sivri uçlar (patlama olarak.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ölçümlerden önce sistem kalibrasyonu ile ilgili olarak, numuneyi ölçmek için kullanılanla aynı cam eşyalar kullanılmalıdır (örneğin, hücre lisat için 8 kuyulu kapak cam odası ve canlı hücreler için 35 mm cam taban kabı). Camdaki Rh6G adsorpsiyonu nedeniyle, etkili konsantrasyonu bazen azalabilir. Öyleyse, sadece iğne deliği ayarı için 1 μM gibi yüksek konsantre bir Rh6G çözeltisi kullanılmalıdır. Dedektörü korumak için son derece yüksek foton sayısı oranlarından kaçınılmalıdır (örneğin, 1000 kHz'den fazla). Ayrıca, konsa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.K., Japonya Bilim Geliştirme Derneği (JSPS) Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibesi (C) (#18K06201), Nakatani Yeni Koronavirüs Enfeksiyonlarına Karşı Önlemler Vakfı'ndan hibe, Hokkaido Üniversitesi Gelecekteki Araştırma Liderlerini Geliştirme Ofisi 'nden (L-Station) hibe ve Hoansha Vakfı'ndan bir hibe yardımı ile desteklendi. M. K., "Multimoleküler Kalabalık Biyosistemleri için Kimya" (#20H04686) yenilikçi alanlar üzerine bilimsel araştırmalar için JSPS Grant-in-Aid ve "Yaşamsal konuların bilgi fiziği" (#20H05522) üzerinde Bilimsel Araştırmalar için JSPS Grant-in-Aid tarafından kısmen desteklendi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 0.25 (a / h) Tripsin-1 mmol / L EDTA ve orta nokta; Fenol Kırmızısı İçeren 4Na Çözeltisi (Tripsin-EDTA)Fujifilm Wako Saf Kimya A.Ş.201-16945
100 mm plastik tabaklarCORNING430167
35 mm cam taban kabıIWAKI3910-035Canlı hücre ölçümü için
35 mm plastik tabaklarThermo Fisher Scientific150460
Alüminyum levhaBio-BikAB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27Carl ZeissObjektif
Hücre sıyırıcıSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-93100
Selüloz asetat filtre membranı (0,22 mm)Advantech Toyo25CS020AS
Kapak cam haznesi 8 kuyuluIWAKI5232-008Çözelti ölçümü için
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796bazal besiyeri
Fetal sığır serumu (FBS)bioseraLot kontrolü gerekli
Lipofektamin 2000Thermo Fisher Scientific11668019
LSM510 META + ConfoCor3Carl ZeissFCS sistemi
Murin nöroblastom Neuro2a hücreleriATCCCCL-131Hücre hattı
Opti-MEM IThermo Fisher Scientific31985070
pCAGGSRIKENRDB08938Transfeksiyon taşıyıcısı için Plazmid DNA
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi (× 100Fujifilm Wako Saf Kimya A.Ş.168-23191
pmeGFP-C1-TDP25Monomerik eGFP ile etiketlenmiş TDP25 için Plazmid
DNA'sı pmeGFP-N1eGFP monomer ekspresyonu için Plazmid DNA
pmeGFP-N1-SOD1-G85RALS'ye bağlı G85R mutantı için Plazmid DNA'sı SOD1'in monomerik eGFP
Proteaz inhibitörü kokteyliSigma-AldrichP8304
) ile etiketlenmiştir

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein AggregationFluorescence Correlation SpectroscopyNeurodegenerative DisordersDiffusion PropertiesCell LysateLive Cell MeasurementGFP Tagged ProteinsCurve Fitting AnalysisConfocal MicroscopySoluble Oligomers

Related Articles