Yöntem makalesi

Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi

DOI:

10.3791/62591

⸱

7 Temmuz 2021

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Irvine, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroenjeksiyon teknikleri, sivrisineklerin genomlarına eksojen genleri sokmak için gereklidir. Bu protokol, James laboratuvarı tarafından DNA yapılarını dönüştürülmüş sivrisinekler üretmek için Anopheles gambiae embriyolarına mikroenjeze etmek için kullanılan bir yöntemi açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyo mikroenjeksiyon teknikleri böcek türlerinin birçok moleküler ve genetik çalışması için gereklidir. İlgi genlerini kodlayan eksojen DNA parçalarının yanı sıra böcek germline olumlu özellikleri istikrarlı ve kalıtsal bir şekilde tanıtmak için bir araç sağlarlar. Ortaya çıkan transgenik suşlar, temel soruları yanıtlamak için entegre DNA'nın ifadesinden kaynaklanan veya pratik uygulamalarda kullanılan fenotipik değişiklikler için incelenebilir. Teknoloji basit olmasına rağmen, verimliliği en üst düzeye çıkaran bir beceri seviyesine ulaşmak için araştırmacı sabrı ve uygulaması gerekir. Burada gösterilen Afrika sıtma sivrisinek embriyolarının mikroenjeksiyonu için bir yöntemdir, Anopheles gambiae. Amaç, gelişmekte olan mikromline (kutup) hücrelerinde alınabilmesi için embriyoya mikroenjeksiyon eksojen DNA ile teslim etmektir. Transposazların, integrazların, rekombinazların veya diğer nükleazların enjekte edilen DNA'sından (örneğin CRISPR ilişkili proteinler, Cas) gelen ifade, kromozomlara kovalent yerleştirilmesine yol açan olayları tetikleyebilir. Bu teknolojilerden üretilen Transgenik An. gambiae, bağışıklık sistemi bileşenlerinin, kan beslemede rol oynayan genlerin ve koku sisteminin elemanlarının temel çalışmaları için kullanılmıştır. Ek olarak, bu teknikler sıtma parazitlerinin bulaşmasını kontrol etmeye yardımcı olabilecek özelliklere sahip An. gambiae suşları üretmek için kullanılmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroenjeksiyon teknikleri 1900'lerin başından beri organizmaları deneysel olarak manipüle etmek için kullanılmaktadır1. Mikroenjeksiyon, hem temel biyolojik fonksiyonları incelemek hem de istenen bir organizmanın biyolojisinde önemli değişiklikler sağlamak için kullanılmıştır. Mikroenjeksiyon tekniği vektör biyologlarının özellikle ilgisini çekmiştir ve vektör genomlarını manipüle etmek için yaygın olarak kullanılmıştır2-11. Eklembacaklı vektörlerdeki transgenez deneyleri genellikle vektörün kondisyonını azaltan veya ilettikleri patojenlere refrakterliği artıran değişiklikleri yürürlüğe koyarak vektörleri patojenlerin iletiminde daha az verimli hale getirmeyi amaçlamaktadır. Sivrisinekler çeşitli insan patojenlerini iletir ve dünya çapında morbidite ve mortalite üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Sivrisineklerin Anopheles cinsi, insan sıtma parazit patojenleri plasmodium spp'yi iletir. Anopheles ile yapılan genetik mühendislik deneyleri, yeni sıtma eliminasyon stratejileri geliştirme çabalarında biyolojiyi daha iyi anlamayı ve bu sivrisineklerin vektörel kapasitesini azaltmayı amaçladılar.

Dünya çapında en fazla sıtma enfeksiyonuna katkıda bulunan sivrisinek vektörleri Anopheles gambiae türleri kompleksindedir. Bununla birlikte, başarılı transgenez deneylerinin çoğu Hint alt kıtasının sıtma vektörü anopheles stephensiüzerinde gerçeklenmiştir. Laboratuvara uyarlanmış birçok Anopheles gambiae suşu mevcut olsa da, literatürde bildirilen transgenik Anopheles gambiae spp. çizgilerinin sayısı Anopheles stephensiile karşılaştırılamaz. Anopheles gambiae embriyosuna enjekte etmenin ve başarılı transgenez elde etmenin Anopheles stephensi'den daha zor olduğu düşünülmektedir Bu farklılıkların nedenleri bilinmemekle birlikte. Bu protokol, Mikroenjeksiyon yoluyla Anopheles gambiae embriyolarının transgenezini elde etmede sürekli olarak başarılı olduğu kanıtlanmış bir yöntemi açıklar. Protokol, daha önce Hervé Bossin ve Mark Benedict12 tarafından geliştirilen ve transgenezin verimliliğini artırdığı tespit edilen bazı ek ayrıntılar ve değişikliklerle birlikte geliştirilen bir yönteme dayanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sivrisineklerin mikroenjeksiyona hazırlanması

  1. ~100 erkek ve200-300dişi 1-2 günlük yetişkin eklosion sonrası sivrisinekler ile 13 (~5000 cm 3) bir kafes tohumlayın ve 2 gün çiftleşmelerine izin verin.
  2. Çiftleşme döneminden sonra, sivrisineklere yapay bir besleme cihazı ile 2 mL kan kullanarak bir kan unu sağlayın veya böcek uygulamalarına bağlı olarak uyuşturuldu hayvanlaryaşayın 14. Ertesi gün, tüm çiftleşmiş dişilerin beslenme fırsatına sahip olmasını ve kısmen beslenen sivrisineklerin tamamen kuşatılmış olmasını sağlamak için sivrisineklere ikinci bir kan unu sağlayın.
  3. İkinci kan yemeğinden 2-4 gün sonra embriyo koleksiyonları için sivrisinekleri kullanın.
    NOT: Larva beslenmesi yetişkin sağlamlığı ve üreme zindeliği için önemlidir. Sağlıklı böceklerin nasıl yetiştirilmeleri hakkında bilgi için Benedict ve ark. (2020)14. Sivrisinekler yapay bir besleyiciyle beslendiğinde veya uyuşturulmuş hayvanlar yaşadığında yumurtlamada önemli bir fark gözlenmemiştir. Böcekçide Anopheles gambiae için rutin olarak hangi yöntem kullanılıyorsa onu kullanın.

2. Embriyo hazırlığı

  1. Her iki ucunda açık olacak şekilde kesilmiş (bant testeresi ile) şeffaf 50 mL konik tüpe 20-30 dişi yerleştirmek için bir aspiratör kullanın ve bir ucunda lateks diş filmi, diğer ucunda naylon ağ ve filtre kağıdı ile kaplanmıştır (Şekil 1).
    NOT: Sivrisinekler yumurtalarını filtre kağıdına yatıracak ve naylon ağ filtre kağıdını güvenli bir şekilde yerinde tutacaktır. Sivrisinek yumurtaları silindirik şekilli, ~500 μm uzunluğunda, en geniş noktasında ~200 μm çapında ve ön ve arka uçlarda sivriltmedir (Şekil 2).
  2. Sivrisinek dolu tüpü çift damıtılmış su (ddH2O) ile doldurulmuş küçük (60 mm x 15 mm) bir Petri kabına yerleştirin. Tüpü ve tabağı 45 dakika boyunca 28 °C'de bir inkübatöreyerleştirin (Şekil 3).
  3. Tüpü inkübatörden çıkarın ve tüpü boş bir kafese yerleştirin. Sivrisineklerin uçmasına izin vermek için tüpe hafifçe dokunun ve tüm sivrisinekler uçtuktan sonra tüpü kafesten çıkarın.
  4. Tüp sivrisineklerden arındırıldığında, alt halkayı sökün, naylonu çıkarın ve filtre kağıdını yumurtalarla birlikte tüpten dikkatlice çıkarmak için tokmaklar kullanın. Filtre kağıdını, ddH2O ile nemlendirilmiş bir filtre kağıdı tabakası içeren plastik bir Petri kabına (100 mm x 15 mm) yerleştirin.
  5. Yumurtalara dikkat edin. Açık gri renkte oldukları noktaya kadar yaşlanan yumurtalar (Şekil 4) hizalamaya hazırdır.
    1. Yumurtalar hala beyazsa, inkübatöre geri verin ve her 5 dakikada bir rengi kontrol edin. Beyaz yumurtalar kırılgandır, kolayca yırtılır ve enjeksiyon işleminden sonra düşük kuluçka ile sonuçlanan iyi hayatta kalamaz.
    2. Koyu gri veya siyah olan yumurtalar çok fazla yaşlandı. Onları kullanma.

3. Embriyo hizalaması

  1. Bir parça naylon lekeli membran (2 cm x 1 cm) jiletle kesin, kenarın düzgün bir şekilde kesildiğinden emin olun.
    NOT: Kenar düz değilse, enjeksiyon işlemi sırasında yumurtalar zara düzgün bir şekilde yapıştırılmış olarak kalmaz.
  2. Cam bir kaydırağın üzerine bir membran koyun ve membranı bir filtre kağıdı parçasıyla (2 cm x 2 cm) örtün ve membran filtresinin ~1 mm'si açık bırakarak (Şekil 5).
    NOT: Mikroskop slaytlarının kullanmadan önce temiz olduğundan emin olun ve membran filtresini işlemek için temiz tokmaklar kullanın.
  3. Filtre kağıdını deiyonize H2O ile ıslatın, çünkü uzun süre kurursa yumurtalar ölür.
    NOT: Enjeksiyon işlemi sırasında embriyolar hareket edeceğinden kağıda çok fazla su koymayın, ancak embriyonun kurumasını önlemek için yeterli olduğundan emin olun (Şekil 6A, B). Fazla su bir parça filtre kağıdı ile emilerekçıkarılabilir.
  4. 30-50 embriyoyu bir boya fırçası ile zarın kenarına hafifçe aktarın (boyut #0). Yumurtaları, ventral tarafın (dışbükey) yukarı bakacak şekilde kaydırağın üzerine hafifçe yuvarlayarak zar boyunca dikey olarak hizalamak için fırçayı kullanın.
  5. Tüm yumurtaları aynı yöne yönlendirin, böylece yumurtalar mikroenjeksiyon mikroskobu altında gözlendiğinde, arka uç (daha sivri, Şekil 6A, B)aşağı konumdadır ve iğne ile ~15 ° 'lik bir açı oluşturur (Şekil 6C). Zarın tüm kenarını yumurtalarla hizala (30-50) ve slaytı enjeksiyon için mikroskobun altına yerleştirin.
    NOT: Yumurtaları dikkatlice seçin. Beyaz (çok genç veya gelişmemiş) veya koyu gri (çok yaşlı ve iğneyi kıracak) ve anormal olanları atın (Şekil 7). Filtre kağıdının her zaman nemli kaldığından eminolun.

4. DNA hazırlığı

  1. Enjeksiyon için plazmid DNA'ları, üreticinin protokollerini takip eden endotoksin içermeyen bir DNA plazmid maxiprep kiti ile en azından saflaştırın.
  2. DNA'yı PCR sınıfı su ve santrifüjde 17.100 x g'da, 4 °C'de 30 dakika boyunca soğutmalı bir santrifüjde yeniden kullanın. Ardından, süpernatant yeni, temiz 1,5 mL konik bir tüpe aktarın. istenmeyen partikül maddelerin sütundan aktarılmasını önlemek için dikkatlice mikro pipet.
  3. 3M sodyum asetatın onda biri ve iki kat %100 etanol hacmi kullanarak ikinci bir DNA çökeltme gerçekleştirin.
  4. DNA'yı 1000 ng/μL'lik son plazmid konsantrasyonu için 300-500 μL PCR sınıfı suda yeniden kullanın.
    NOT: DNA -20 °C'de saklanabilir DNA mikroenjeksiyon aliquotları -20 °C'de veya RNA bileşenleri kullanılarak -80 °C'de saklanabilir. Enjeksiyon karışımında 800 ng/μL DNA'yı aşmayın, çünkü viskozite iğnelerin tıkanmasına neden olur.

5. İğne hazırlama

  1. Programlanabilir bir mikropipette çekme kullanarak 10 cm kuvars kılcal damarları çekerek iğneleri yapın.
  2. Ucun iyi oluştuğundan emin olmak için iğneyi mikroskop altında inceleyin. Programlanabilir çekmedeki iğne ayarının terminal ucundan ~0,5 mm sivrilmeye başlayan ve ince bir noktada biten bir uç verdiğinden emin olun (bkz. Şekil 6). Kolayca kopan iğneler genellikle çok uzun bir konik vardır.
    NOT: Koşullar iğne çekeceğine bağlı olarak farklılık gösterebilir (Yazarlar, kullandıkları programlanabilir çektirme ayarlarını istek üzerine kullanıma sunacaktır. Dergi kısıtlamaları belirli bir markayı alıntılamamızı engeller). İğneler elle çekilebilir, ancak bu çoğu laboratuvarda bulunmayan bir beceri seti gerektirir.

6. Embriyo mikroenjeksiyon

  1. İğneleri 2 μL DNA karışımı ile doldurmak için bir mikro yükleyici ucu kullanın. İğneyi iğne tutucuya yerleştirin ve otomatik basınç pompası borularını bağlayın (Şekil 8).
  2. Önemli: İğneyi slayt düzlemi ile 15° açı olacak şekilde hizalayın (Şekil 8).
  3. İlk yumurtaya dikkatlice dokunarak iğne ucunu açın ve iğnenin ucunu arka direğe 10 μm ≤ sokarak enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyon, yumurta içindeki sitoplazmın küçük bir hareketine yol açacaktır.
  4. Enjeksiyona devam etmek için bir sonraki yumurtaya geçmek için mikroskop koaksiyel sahne kontrollerini kullanın.
    1. İğne ucunun açık kalmasını ve tıkanmamasını sağlamak için, başka bir embriyoya girmeden önce Enjekte et düğmesine basın ve iğnenin açılışında küçük damlacığı görselleştirin.
    2. İğne tıkanırsa, iğneyi temizlemek ve damlacık görselleştirme testini tekrarlamak için Temizle düğmesine basın. Damlacığın boyutunun küçük kalmasını sağlamak için iğne ucu açıklığı biraz daha büyürse basıncı gerektiği gibi ayarlayın.
    3. Bir iğne ile ~40-50 yumurta enjekte edin.
      NOT: Filtre kağıdının her zaman nemli kaldığından emin olun. Temiz tutmak için iğneye yeterli sırt basıncını koruyun. Tıkanamayan bir iğne yeni bir iğne ile değiştirilmelidir. Aşamanın yatay hareketi için koaksiyel kontrolleri olan mikroskoplar ile embriyo yerleştirilmesi, iğne yerleştirilmesi ve enjeksiyonu kolaylaşır (Şekil 9).
  5. Enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, yumurtaları filtre kağıdı ile kaplı ve 50 mL deiyonize H2O (Şekil 10)ile doldurulmuş bir cam kaba durulayın.
    NOT: Embriyolar enjeksiyondan 2 gün sonra yumurtadan çıkmaya başlar ve 3-5 gün kadar sürebilir. Yumurtadan çıkan ilk başlangıç larvaları derhal su ve yiyecek içeren temiz bir kaba hemen (günde 2 kez kontrol edin) aktarılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan mikroenjeksiyon protokolünün uygulanmasının temsili bir örneği Carballar-Lejarazú ve ark5 .'debulunabilir. Buradaki amaç, An. gambiae'ninG3 laboratuvar suşunun mikrop hattına otonom bir gen tahrik sistemi yerleştirmekti. Sistem, ommochrome biyosentezinin son adımı olan 3 hidroksikynureninin ksanthommatin'e dönüşümünü katalizleyen bir heme peroksidaz kodlayan bu türdeki üçüncü kromozom üzerindeki kardinal ortolog lokusu(Agcd)hedeflemek için tasarlanmıştır (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR/Cas9 gibi hassas ve esnek genetik mühendislik teknolojilerinin kullanılabilirliğinin artmasıyla transgenik organizmalar daha önce mümkün olandan daha basit ve istikrarlı bir şekilde geliştirilebilir. Bu araçlar, araştırmacıların patojenlere (popülasyon modifikasyonu) veya kalıtsal steriliteye (popülasyon bastırma) refrakterliğin istenen özelliklerini elde etmeye çok yakın olan sivrisinek vektörlerinin transgenik suşlarını oluşturmalarına izin verdi. Bununla birlikte, mümkün olan en güvenli ve istikrarlı genetiği d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sivrisinek hayvancılığı için Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell ve Madeline Nottoli'ye minnettarız. Fon, Kaliforniya Üniversitesi, Irvine Sıtma Girişimi tarafından sağlandı. AAJ, Irvine Kaliforniya Üniversitesi'nde Donald Bren Profesörüdür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x Mikroenjeksiyon Tamponu-1 mM NaHPO< alt > 4 < / alt> tampon, pH 6.8, 50 mM KCl
Lekeleme membranı (Zeta-Probe GT Genomik Test Edilmiş Lekeleme Membranı)Bio-RadDüzgün ve düz bir şekilde 2x1 cm'lik parçalar halinde kesilmiş
Konik tüpler 50 ml (tek kullanımlık santrifüj tüpü, polipropilen)Fisher MarkaUçlar kesim
Deiyonize veya çift damıtılmış su (ddH20) Mili-QYıkama şişesinde 
Diseksiyon mikroskobu Leica Leica MZ12Embriyo hizalama
forseps 5 numara beden 
Cam kap PyrexNo. 3140125 x 65
Cam kaydırak Fisher MarkaNo. 12-549-375x26 mm
Kuluçka MakinesiBarnsted Lab-lineModel No. 15028 & C
KCl50 mM
Lateks diş filmi Crosstex InternationalNo. 19302
MikroenjektörSutter AletiXenoWorks Dijital Mikroenjektör
Mikro Yükleyici Pipet uçları Eppendorf 20 ve mikro; L mikro yükleyici epT.I.P.S.
MikromanipülatörSutter AletiXenoWorks Mikromanipülatör
Mikropipet Yağmur 20 ve mikro; L
Mikropipet çektirmesi Sutter InstrumentSutter P-2000 mikropipet çektirme
Mikroskobu Mikroenjeksiyon içinLeicaDM 1000 LED veya M165 FC
Minimum fiber filtre kağıdı Fisher MarkaNo. 05-714-4Kromatografi Kağıdı, Kalın 
Sivrisinekler MR4, BEI KaynaklarıAnopheles gambiae, çiftleşmiş yetişkin dişiler, eklosiyondan 4-5 gün sonra kanla beslenen
NaHPO4< / sub> tampon 1 mM, ph 6.8
Naylon örgü
Boya fırçasıBlickNo. 05831-7040İnce, boyut 4/0
Petri kabıPlastik, (60x15 mm, 90x15 mm)
Sodyum asetatve nbsp; 3M
Kuvars cam kılcal damarlar Sutter EnstrümanNo. QF100-70-10Filamentli, 1 mm OD,  ID 0.7 10 cm uzunluk
Su PCR sınıfı RocheNo. 03315843001

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
  2. Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
  3. Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587(2011).
  4. Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
  5. Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
  6. Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
  7. Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
  8. Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010(2016).
  9. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  10. Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
  11. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
  12. Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).
  13. Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440(2019).
  14. Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838(2020).
  15. Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Anopheles Gambiae EmbryosEmbryo MicroinjectionMosquito Genetic EngineeringTransgenic MosquitoesGene Drive SystemCRISPR Cas9Germline TransformationDNA MicroinjectionMosquito Population ControlFluorescent Marker

İlgili makaleler