Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

İntegral membran proteinlerinin doğal lipit ortamlarından çıkarılması, yapılarını ve işlevlerini önemli ölçüde etkileyebilir^1,2,3,4. Biyolojik membranların karmaşık lipit bileşimi^5, kritik öneme sahip protein-lipit etkileşimlerinin gerçekleşebilmesini sağlar⁶. Lipitler membran proteinlerinin yapısal bütünlüğünü korur, böylece membran bölmesi hedeflerinde^{(ler) 7,8}'de doğru çalışmasını sağlar. Bu nedenle, membran proteini saflaştırmasında kritik bir ilk adım, proteinin yapısını ve/veya işlevini etkilemeden doğal ortamından çıkarılmasıdır.

Çoğu hidrofobik doğası ile ilgili olan membran proteinlerinin yapısını ve X-ışını kristalografisi veya kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) 9 , 10^,11,12içingerekli miktarlarda düzgün katlanmış ve fonksiyonel membran proteinlerini ifade etmenin zorluklarının karakterizesinde birçok engel vardır. Üç tür membran protein ekspresyon sistemi vardır: homolog⁹, heterolog^13,14,15ve in vitro ekspresyon sistemleri^16,17. Birçok ifade sisteminin genellikle düşük ifade seviyeleri veya yasaklayıcı maliyetleri, membran proteinleri üretmek için tercih edilen seçenek olarak sadece birkaç ana bilgisayar bırakır. Bakteri konakçısı, Escherichia coli, S. cerevisiae ve Pichia pastoris mayalarıve Sf9 böcek hücreleri veya memeli hücre hatları¹⁸gibi daha yüksek ökaryotlar içerir. Tüm membran protein ekspresyon teknolojilerinin avantajları ve dezavantajları vardır; bununla birlikte, S. cerevisiae belki de membran protein üretimi için uygun en iyi çalışılan ökaryotik model organizmadır. Genetik mühendisliği, ilaç keşfi, sentetik biyoloji ve ökaryotik membran proteinlerinin ekspresyasyonu^{14 , 19,}20^,21'dekiuygulamalarla çok yönlüdür.

Bu çalışmada, büyük C. albicans multidrug efflux pompa^Cdr1'i aşırı ifade etmek ve incelemek için S. cerevisiae ADΔ¹⁴ ve ADΔΔ 22 tercih edilen konaklar ( Şekil1A)ile patentli bir S. cerevisiae membran protein ekspresyon teknolojisi²¹ kullanılmıştır. Her iki S. cerevisiae suşu da AD1-8u^{türevleridir -23,} URA3 veya HIS1 genomik loci'deki istenmeyen entegrasyon yoluyla ortaya çıkan yanlış pozitif urasil veya histidin prototroph dönüştürücülerini ortadan kaldırmak için silinen ura3 (ADΔ) veya hem ura3 hem de onun1 (ADΔΔ) genlerine sahiptir. Şekil 1A'dabelirtilen 7 büyük multidrug efflux pompa^23'ünsilinmesi, ADΔΔ'yi çoğu ksenobiyotiklere karşı mükemmel derecede hassas hale getirir. Fonksiyon kazancı mutant transkripsiyon faktörü Pdr1-3, Cdr1 (Şekil 1A'dakikırmızı sekizgenler) gibi heterolog membran proteinlerinin konsitülatif aşırı ekspresyonuna neden olur. heterolog-ORF içeren dönüşüm kasetinin (Şekil 1A) genomik PDR5 lokusunda (Şekil 1A'damavi dikdörtgen) iki homolog rekombinasyon olayı ile entegrasyonu. C-terminal mGFPHis etiketli proteinlerin uygun plazma membran lokalizasyonu konfokal mikroskopi (Şekil 1A) ile doğrulanabilir ve O etiketi etiketli proteinin nikel benzeşim saflaştırılması için kullanılabilir. Bazı mantar ABC taşıyıcılarının (örneğin, Candida krusei ABC1)pABC3 türevi plazmidlere klonlamaları, ancak hücre toksisitesi nedeniyle Escherichia coli'de yayılamadıkları için mümkün değildi. Bu,^14,24 membran proteinlerinin N veya C-terminuslarında çeşitli benzeşim, epitop veya muhabir etiketleriyle etiketlenmiş tek adımlı klonlamanın doğrudan S. cerevisiae ADΔΔ'ye(Şekil 1C)geliştirilmesine neden oldu. S. cerevisiae Çeşitli CDR1 mutantlarını aşırı ifade eden ADΔΔ suşları, 25 bp(Şekil 1C)ile çakışan beş adede kadar ayrı PCR parçası kullanılarak da verimli bir şekilde oluşturulabilir. Bu protokolü kullanarak, birçok ilgi çekici ORF çok kısa bir süre içinde düşük maliyetle ve yüksek verimlilikle klonlanabilir, ifade edilebilir ve karakterize edilebilir. Dönüşüm verimliliği, her ek PCR parçasıyla yalnızca ~2 kat azaltır. 

İstenirse, ifade düzeyleri, genellikle yüksek, kesin ifade düzeylerinin% 0,1-% 50'si arasında herhangi bir yere kadar ifade düzeylerini tahmin edilebilir şekilde ayarlamak için astar tasarımı tarafından kolayca manipüle edilebilir²⁵. Optimize edilmiş, çok fonksiyonlu, pABC3¹⁴ türev klonlama vektörü, pABC3-XLmGFPHis²⁶ (Şekil 1B) bir HRV-3C proteaz bölünme bölgesi (X; LEVLFQ| GP), sık kullanılan tütün etch virüsünden (TEV) daha iyi performans gösteren bir proteaz²⁷. L beş amino asit (GSGGS) bağlayıcıdır, mGFP bir monomerik mutanttır (A206K)^28,maya geliştirilmiş yeşil floresan protein varyantı yEGFP3^30'un29 versiyonudur ve His üç amino asit bağlayıcıdır (GGS) ve ardından altı-histidin (HHHHHH) nikel benzeşim proteini saflaştırma etiketidir.

Bu ifade teknolojisi ilaç keşfinde ve membran proteinlerinin incelenmesinde başarıyla kullanılmıştır. Mantar azol ilaç hedefi olan S. cerevisiae Erg11³¹için ilk yapı bu teknoloji kullanılarak çözüldü. Ayrıca C. albicans Cdr1^{32 , 33,34'ün} ayrıntılı karakterizasyonunu ve gelecekteki yüksek çözünürlüklü yapıları doğrulamak için sistein çapraz bağlama çalışmalarına uygun sistein eksikliği olan bir Cdr1 molekülü^35'in oluşturulmasını sağladı. Büyük insan mantar patojenlerinden diğer birçok ABC taşıyıcısı (yani, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei ve Fusarium solani tür kompleksi) de bu ifade platformu²⁴, 36^,37,38,39kullanılarak ayrıntılı olarak incelenmiştir. Bu, yeni floresan efflux pompa substratı Nil kırmızısı 40 ve spesifik 41 ve geniş spektrumlu 14 ,^{33,42 , 43 ,44} efflux pompa inhibitörlerini keşfetmek için yüksek verimli ekranlarda kullanılan^efflux pompalarını aşırı ifade eden bir S. cerevisiae suşları panelinin üretilmesini sağlamıştır. Bu sistemin kullanımı ayrıca clorgyline'ın türünün ilk geniş spektrumlu mantar çokdrug efflux pompa inhibitörü⁴²olarak keşfedilmesini sağladı.

Membran proteinlerinin tam çözünmesi ve endojen lipitlerden yoksun homojen bir membran protein-misel preparatının oluşturulması, yüksek deterjan konsantrasyonları gerektirir⁴⁵. Ancak ne yazık ki, bu genellikle membran proteini 5 ,^8,45,46'yıda devre dışı bırakmaktadır. Deterjan monomerlerinin özellikleri ve çözeltideki toplamaları, hidrofobik kuyruğun fiziksel özelliklerinden, alkil zincirinin uzunluğundan ve dallanmasından, aromatik bir çekirdeğin veya floroalkil yan zincirin varlığından veya polioksiyetil ünitelerin sayısından etkilenir. Bu nedenle deterjan taraması, membran proteini çözünmesi ve saflaştırılması için en uygun deterjanı belirlemek için önemli bir ilk adımdır.

C. albicans ciddi, hayatı tehdit eden invaziv enfeksiyonlara neden olabilen immün sistemi baskılanmış bireylerin önemli bir insan mantar patojenidir⁴⁷ve azol antifungal ilaçlara dirençli hale gelebilir^48,49. C. albicans multidrug direncinin ana mekanizmalarından biri Cdr1⁵⁰plazma membranında bulunan ABCG alt familyasının tip II ATP bağlayıcı kaseti (ABC) taşıyıcı^51'dir. Tam boyutlu mantar ABCG taşıyıcıları (iki nükleotid bağlama etki alanı [NBD] ve iki transmembran etki alanından [TMD]) daha yaygın olarak pleiotropik ilaç direnci (PDR) taşıyıcıları olarak bilinir ve benzersiz ters etki alanı topolojisi [NBD-TMD]₂ile karakterize edilir. PDR taşıyıcıları sadece^{52, 53}ve mantar⁵⁴ bitkilerinde bulunur. Önemlerine rağmen, PDR taşıyıcıları için hiçbir yapı yoktur, ancak insan yarı boyutlu ABCG taşıyıcıları için yapılar son zamanlarda cdr1³³için ilk belirsiz modelin oluşturulmasına yardımcı olan çözülmüştür. Bununla birlikte, son deneysel kanıtlarımız, bu modelin muhtemelen kusurlu olduğunu göstermektedir, çünkü mantar PDR taşıyıcıları karakteristik asimetrik NBD'lere sahiptir ve bu da muhtemelen benzersiz bir taşıma mekanizmasıyla sonuçlanır. Bu nedenle, Cdr1'in yüksek çözünürlüklü bir yapısı, hem efflux aracılı ilaç direncinin üstesinden gelmeye yardımcı olabilecek yeni efflux pompa inhibitörlerinin rasyonel tasarımı hem de bu önemli ABC taşıyıcı ailesinin etki mekanizması hakkında içgörüler sağlamak için gereklidir.

Bu çalışmanın amacı, Cdr1 için yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek amacıyla, genetiği değiştirilmiş S. cerevisiae ekspresyon konağında Cdr1'in ekspresyasyonu, çözünürlüğü ve saflaştırılması için güvenilir protokoller geliştirmekti. Bu sürecin bir parçası olarak, proteaz-bölünebilir mGFPHis çift etiket (Şekil 1B) etiketi Cdr1'in C-terminusundan ayıran 16 kalıntılı bir bağlayıcı ile tasarlanmıştır, bu da ekli 6x Benzeşim etiketinin nikel benzeşim reçinesine bağlanmasını iyileştirdi ve cdr1 ifade seviyelerinin canlı hücrelerde ve tüm saflaştırma işlemi sırasında izlenmesini sağladı. Cdr1'in biyokimyasal karakterizasyonu için kullanılabilecek, yaklaşık% 10 C. albicans Cdr1 (SDS-PAGE'den sonra Coomassie boyama ile tahmin edildiği gibi) içeren küçük ölçekli maya plazma membran protein preparatları için tekrarlanabilir bir protokol de geliştirilmiştir.

1. Taze veya dondurulmuş dönüşüm stoklarının hazırlanması yetkin ADΔ ve ADΔΔ hücreleri

1. 2x YPCD'nin 25 mL'sini aşılayın [yani, 2x YPD; %2 (w/v) maya özü, %2 (w/v) pepton, %4 (w/v) dekstroz), %0,079 CSM (tam takviye karışımı)] Tek maya kolonili³⁵ ortam ve dakikada 200 devirde (rpm) sallanarak 30 °C'de 16 saat boyunca gece boyunca kuluçkaya yatırın.
2. 25 mL o/n kültürü ile 225 mL 2x YPCD ortamını aşıla ve hücre optik yoğunluğunu 600 nm'de (OD₆₀₀₎kontrol edin; OD₆₀₀ genellikle ~0.5-1.0'dır.
   NOT: Bu aşamada, aşağıdaki dönüştürme denemesi için gereken tüm malzemelerin hazır olduğundan emin olun.
3. Hücre yoğunluğu ~6-8'in OD 600'üne ulaşana kadar 200 rpm'de sallanarak₃₀ °C'de kültürü daha fazla ~6-8 saat büyütün.
   NOT: Aksi belirtilmedikçe aşağıdaki adımlar oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir.
4. Bu logaritmik faz hücrelerini 3 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.
5. Hücreleri yeniden biriktirin ve steril çift damıtılmış suyla iki kez yıkayın (ddH₂O; yani 200 mL ve ardından 20 mL).
6. Hücreleri 3 dakika boyunca 3.000 x g'da hasat edin.
7. Yavaşça (yani, 30 dakika boyunca her dakika 30 eşit dondurulmuş yetkin hücre (FCC) çözeltisi ekleyin) hücre peletini FCC'nin X mL'sinde [%5 (w/v) gliserol, Buz üzerinde %10 (v/v) dimetil sülfit (DMSO)] (burada X = OD₆₀₀; örneğin, OD₆₀₀ = 6 resuspend 6 mL'de veya OD₆₀₀ = 3 resuspend 3 mL'de yenidense).
   NOT: Doğru FCC bileşimi dönüşüm başarısı için kritik öneme sahiptir.
8. Dönüştürmeden önce hücreleri 2 saat boyunca buzda tutun veya aliquotları gerekli olana kadar -80 °C'de saklayın.
   NOT: ADΔ ve ADΔΔ hücreleri donmaya karşı çok hassastır. Bu nedenle, hücreler yavaşça -80 °C'ye kadar soğutulmalıdır: 50-600 μL hücre aliquot içeren buz gibi mikrosantrifüj tüplerini plastik bir saklama kutusuna (RT) yerleştirin. Kutuyu daha büyük bir polistiren kabına (RT) yerleştirin ve kabı uygun bir polistiren kapakla kapatın. Ardından, kabı -80 ° C dondurucuya koyun.
   DİkKAT: Yavaş donma hücre sağkalım için kritik öneme sahiptir.

2. CaCDR1-XLmGFPHis ile ADΔ ve ADΔΔ'nin dönüşümü ve koloni PCR ve DNA dizilimi ile doğru dönüştürücülerin onaylanması

NOT: Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis, Lamping ve ark., 2010^55'te ayrıntılı olarak açıklanan geleneksel klonlama stratejileri kullanılarak oluşturulmuştur ve Şekil 1B'degösterilmiştir. Vahşi tip C. albicans CDR1, plazmid pABC3-CaCDR1A-GFP^14'ten PacI /NotI parçası olarak izole edildi ve pABC3-XLmGFPHis^26'yaklonlandı.

1. PCR, tüm CDR1 dönüşüm kasetini yüksek kaliteli bir DNA polimeraz ve astar çifti PDR5-pro/PDR5-ter³⁵ ile 1-10 ng pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis kullanarak bir DNA şablonu olarak güçlendirir veya, alternatif olarak, 2 μg pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis'i 37 °C'de 10 U kısıtlama enzimi AscI ile tamamlamaya kadar sindirin(Şekil 1A,B).
   NOT: CDR1 dönüşüm kaseti (Şekil 1A) PDR5 promotörü - CaCDR1-mGFPHis - PGK1 sonlandırıcı - URA3 seçim işaretçisi - PDR5 aşağı akış bölgesini içerir.
2. Agarose jel elektroforezi gerçekleştirin ve ~8 kb dönüştürme kasetini jel ayıklayın.
   NOT: ~8 kb CaCDR1 dönüşüm kasetinin jel saflaştırılması, genomik PDR5 lokusuna entegre edilen doğrusal dönüşüm kaseti yerine tüm plazmid olan yanlış dönüştürücülere yol açabilecek olası sindirilmemiş plazmid DNA'ları ortadan kaldırır.
3. Kaynar su banyosunda 10 dakika boyunca gerekli miktarda somon sperm taşıyıcı DNA'sı (2 mg/mL; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7.5) denature ve buzda tutun. Kapağın açılmasını önlemek için somon sperm DNA'sını kaynatmak için vidalı tüpler kullanın.
4. 50 μL denatüre somon sperm DNA'sını dönüşüm kasetinin 14 μL'si (500-2.000 ng) ile karıştırın ve 64 μL DNA karışımını bir sonraki kullanıma kadar buzda tutun.
   NOT: Pozitif dönüşüm kontrolü olarak 10 ng E. coli-maya mekik plazmid (örneğin, pYES2) kullanın (Şekil 2B).
5. Taze veya donmuş yetkin hücreleri 30 °C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca hızla yeniden depolayın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerde 50 μL aliquot'a bölün.
6. Maksimum hızda (18.000 x g) bir mikrofugede 1 dakika santrifüjleme ile hücreleri hasat edin.
7. Üstnatant çıkarın ve hücre peletINI RT'de tutun.
8. Her dönüşüm için, %50 (w/v) polietilen glikol (PEG 3350) ve 36 μL 1 M lityum asetat (LiAc) 260 μL kombinasyonlarının (RT) 296 μL kombinasyonunu (RT) uygun 64 μL buz gibi DNA karışımları ile tekrar pipetleme ile karıştırın.
9. Uygun karışımı hemen 50 μL yetkin hücre pelet aliquot ekleyin.
10. Hücre peletini 360 μL PEG-LiAc-DNA karışımında yaklaşık 30 sn boyunca iyice girdaplayarak yeniden depolayın.
11. Hücre karışımını 30 °C su banyosunda 1 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: ADΔ ve ADΔΔ hücreleri 30 °C'de 42 °C^35'tendaha iyi dönüşür.
12. Hücreleri 10 s için 18.000 x g'da hasat edin. Süpernatant atın ve hücre peletini 80 μL ddH₂O'da yeniden atın.
13. Hücreleri bir CSM-URA agar^{plakasına yayın 35} [yani, amino asit içermeyen% 0.67 (w/ v) maya azot tabanı, % 0.077 (w / v) CSM eksi urasil, % 2 (w / v) glikoz ve% 2 (w / v) agar]
14. Urasil prototrop transformatörleri açıkça görünene kadar plakaları 30 °C'de 2-3 gün kuluçkaya yatırın.
    NOT: Doğrusal ~8 kb CaCDR1 dönüştürme kasetinin μg başına ~100 dönüştürücü ve μg pYES2 başına^~4 x 10 4 dönüştürücü bekleyin.
15. Beş bağımsız dönüştürücü seçin ve urasil prototroph transformantlarını dönüştürülmemiş konak hücre kalıntılarından ayırmak için bunları taze bir CSM-URA plakasına yayın.
16. YPG-agar plakalarındaki dönüştürücüleri [%1 (w/v) maya özü, %2 (w/v) pepton, %2 (v/v) gliseol ve %2 (w/v) agar](Şekil 2D)üzerinde büyüterek olası minyon mutantları çıkarın.
    NOT: Minyon mutantlar kusurlu mitokondrilere sahiptir ve bu nedenle fermente edilemeyen karbon kaynaklarında büyüyemezler. S. cerevisiae^56'daoldukça yaygındırlar. S. cerevisiae ADΔ ve ADΔΔ özellikle minyon fenotipi almaya eğilimlidir.
17. Maya kolonisi PCR'yi gerçekleştirin ve~8kb CaCDR1 dönüşüm kasetinin tamamını, PCR ürünlerini saf olmayan DNA şablon kaynaklarından yükseltmek için optimize edilmiş belirli bir DNA polimerazıyla güçlendirerek genomik PDR5 lokusuna ( Şekil 1C) doğru bir şekilde entegre edilecek en az üç bağımsız dönüştürücünün onayını alın. Entegrasyon alanının hemen dışına bağlanan bir astar seti ve DNA şablonu olarak tek kolonilerden türetilen 1 μL hücre süspansiyonu (ddH₂O'da) kullanın.
    NOT: Bu özel DNA polimeraz, bozulmamış maya hücrelerinden ~8 kb PCR parçalarını güvenilir bir şekilde yükseltir. Bununla birlikte, güvenilir amplifikasyon için 45 PCR döngüsü gereklidir ve maya hücreleri ddH₂O'da OD₆₀₀ 1-10'da yeniden kullanılmalıdır.
18. PCR reaksiyonunun 1 μL'lik bir kısmının DNA agarose jel elektroforez ile doğru ~8 kb PCR amplifikasyon ürününü onaylayın.
19. Tedavi edilen DNA örneğinin uygun astarlara sahip bölümlerini kullanarak tüm ORF'yi sıralamadan önce, tek iplikli DNA eksonucleaz enzim karışımı ve üreticinin talimatlarını takip eden bir fosfataz ile PCR reaksiyonunun 10 μL'lik bir kısmından fazla amplifikasyon astarlarını çıkarın.

3. Küçük ölçekli maya plazma membran izolasyon protokolü

1. Büyüyen maya hücreleri
   1. Kültür öncesi, 30 °C'de 10 mL YPD'de ~7-8 saat boyunca tek bir maya kolonisi ve 200 rpm'de sallanıyor.
   2. 10 mL ön kültür ile 40 mL YPD ortamını aşıla ve hücre yoğunluğu 1-3'ün OD 600'üne ulaşana kadar 200 rpm'de sallanarak hücreleri 30 °C o/n'de_(~16 h) kuluçkaya yatırın.
2. Maya hücrelerinin toplanması
   1. 40 OD ünitesini (ODU; örneğin, 1 = 1 ODU'nun₆₀₀ OD'sinde 1 mL) logaritmik fazlı hücreleri 4.200 x g'da 4 °C'de 5 dakika hasat edin.
   2. Hücreleri buz gibi steril ddH 2 O_{(yani, 40}mL ve ardından 1 mL ile iki kez yeniden depolayıp yıkayın; hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 4.200 x g'da santrifüjleme ile basamaklar arasında hasat edin).
   3. Peletin 1 mL buz gibi steril ddH₂O'ya yeniden depolanın ve hücre süspansiyonu önceden soğutulmuş (buz üzerinde) 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   4. 4 °C'de 3 dakika boyunca 3.300 x g'da hücreler toplar.
   5. Üst sıraları aspire edin.
   6. Hücre peletini 0,5 mL homojenizasyon tamponunda [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, %20 (v/v) gliserol; pH 7,5] taze olarak 1 mM fenilingetilsülfonil florür (PMSF) ile desteklenmiş olarak yeniden kullanın.
      NOT: PMSF suya maruz kalınca hızlı bir şekilde devre dışı kaldığı için PMSF'yi her zaman taze ekleyin.
      DİkKAT: PMSF, dokular için son derece aşındırıcı ve yıkıcı olan serine proteaz inhibitörüdür. Geri dönüşü olmayan göz hasarına neden olabilir.
   7. Hücre süspansiyonu -80 °C'de saklayın veya hemen kullanın.
3. Plazma zarlarının izolasyonu
   1. Donmuşsa, buzdaki hücreleri ~1 saat buzda çözün.
   2. Toplam 1 mL hacme ulaşmak için 0,5 mL hücre süspansiyonu için buz gibi 0,5 mm çapında silika boncuklar ekleyin.
   3. Buz üzerinde 3 dakikalık soğutma süreleri ile serpiştirilmiş 1 dakika boyunca maksimum sallama yoğunluğunda 6 vorteks döngüsü ile hücreleri kırın.
   4. Isıtılmış neşter bıçağı ile tüpün dibinde ince bir delik açın.
   5. Kırık hücre homojenazını, 10 s düşük hızlı (~200 rpm) dönüşlü başka bir buz gibi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne takılan tüpün dibinden toplayın.
      NOT: Bu, silika boncuklarının orijinal tüpte kalmasını sağlar.
   6. Hücre kalıntılarını, kırılmamış hücreleri ve çekirdekleri gidermek için hücre homojenliğini 4 °C'de 5 dakika boyunca 5.156 x g'da santrifüj edin.
   7. 450 μL'lik süpernatantı buz gibi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve taze PMSF (1 mM) ile desteklenmiş ek 1 mL buz gibi HB ekleyin.
      NOT: Bu seyreltme adımı, yüksek kaliteli plazma membran proteini geri kazanımı için kritik öneme sahiptir.
   8. Plazma membranlarını 4 °C'de 1 saat boyunca 17.968 x g'da hasat edin ve plazma membran peletini tekrar pipetleme ile 1 mM PMSF ile taze olarak desteklenmiş 100 μL HB'de yeniden kullanın. 100 μL HB'yi ve yukarı ve aşağı pipetleme serbest bırakmadan önce hücre peletini 100 μL pipet ucuyla karıştırarak uygun plazma membran homojenizasyonu için hücre peletini gevşetin.
   9. Plazma membran preparatının protein konsantrasyonunu, azaltıcı madde ve deterjan içeren tamponlarla uyumlu bir protein test kiti ile ölçün.
   10. Plazma zarlarını -80 °C'de saklayın veya hemen kullanım için buzda tutun.

4. Sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE)

1. Poliakrilamid jelleri hazırlamak için cihazı monte edin.
2. İki ayırma jeli (%7 poliakrilamid) için% 40 akrilamid / bis-akrilamid 2.1 mL karıştırın, 3 mL 4x ayırma tamponu (1,5 M Tris, %0,4 sodyum dodecyl sülfat [SDS] (w/v); pH 8,8) ve 6,9 mL ddH₂O. Akrilamidin polimerizasyonunu başlatmak için 8 μL tetrametrinediamin (TEMED) ve 60 μL% 10 amonyum persülfat (APS) ekleyin.
   DİkKAT: Akrilamid/bis-akrilamid çok toksiktir. Cilt tahrişi, periferik nöropatiye neden olur ve kanserojendir. TEMED yutulursa veya solunursa zararlıdır. APS yutulduğunda zararlıdır. Ciddi göz ve cilt tahrişleri neden olur.
3. Bu karışımın ~4-5 mL'lik kısmını, üstten ~2 cm'ye kadar monte edilmiş jel aparatına dökün.
4. Düzlemci bir menisküs oluşturmak için üzerine %0,1 SDS~1-2 mL'yi dikkatlice katlayın.
5. Poliakrilamidin RT'de ~60 dakikaya ayarlamasına izin verin.
6. % 40 akrilamid / bis-akrilamid 0,5 mL karıştırarak iki jel için bir istifleme jeli karışımı hazırlayın, 1 mL 4x istifleme tamponu (0,5 M Tris, %0,4 SDS (w/v); pH 6,8) ve 6,9 mL ddH₂O. Akrilamidin polimerizasyonunu başlatmak için 2 μL TEMED ve %10 APS'nin 30 μL'sini ekleyin.
7. %0,1 SDS tabakasını polimerize ayırma jelinden çıkarın ve SDS izlerini gidermek için ddH₂O ile durulayın.
8. İstifleme jeli karışımını ayırma jelinin üzerine dökün.
9. İstifleme jeline bir tarak yerleştirin ve tarağın etrafındaki hava kabarcıklarını çıkarın.
10. istifleme jelinin RT'de ~60 dakika olarak ayarlenmesine izin verin.
11. Tarağı çıkarın ve jel yuvalarını suyla durulayın. Jeli jel tankına koyun ve jel tankını 1x çalışan tamponla (24,8 mM Tris, 190 mM glisin, % 0,1 SDS) doldurun.
    NOT: RT'de depolanan 10x tampon stoğundan (248 mM Tris, 1,9 M glisin, ddH₂O'da %1 SDS (w/v) 1x çalışan tampon hazırlayın.
12. 5-10 μL plazma membran örneklerini karıştırın (örn. 10-20 μg protein) eşit hacimlerde 2x protein yükleme boyası [120 mM Tris-HCl (pH 6.8), % 20 gliserol, % 0.02 bromofenol mavisi, % 4 SDS, 200 mM dithiothreitol (DTT)] ve hemen çalışan tampona batırılmış bireysel jel yuvalarına yüklenir.
    DİkKAT: DTT yutulduğunda zararlıdır. Ciddi göz ve cilt tahrişleri neden olur.
    NOT: 10 mL'lik 2x protein yükleme boyası, aliquot stoku yapın ve -20 °C'de saklayın. Karışık numuneleri ısıtmayın, ancak GFP etiketinin denatüre olmaması ve jel içi floresan sinyallerinin algılanabilmesi için hemen tek tek jel yuvalarına yükleyin.
13. Protein parçalarının boyut tahminini sağlamak için protein moleküler ağırlık işaretleyicilerini (10-245 kDa aralığı) ayrı bir yuvaya yükleyin.
14. Mavi yükleme boyası jelin dibine ulaşana kadar 200 V'ta jel elektroforezi gerçekleştirin (genellikle 45-55 dk).
15. Jel görüntüleme sistemi ile jel içi GFP-floresan için jeli inceleyin (ekscitasyon ve emisyon dalga boyları sırasıyla 475-485 nm ve 520 nm'dir).
16. Jel içi floresan görüntülemeyi takiben, RT'de 15 dakika boyunca jelin ~10-20 mL Protein Jel Sabitleme Çözeltisi 'nde (%40 etanol, %10 asetik asit) nazik ajitasyonu ile proteinleri sabitleyesiniz.
17. Jeli 10 mL ddH₂O ile 10 dakika boyunca iki kez durulayın ve jeli RT'de ~1 saat boyunca hafif sallama ile 10 mL kolloidal Coomassie leke çözeltisine yerleştirerek protein bantlarını görselleştirin.
18. Protein bantlarının daha iyi görselleştirilmesi için, jel görüntüleme sistemiyle görüntü kaydetmeden önce jeli ~20 mL'de bir veya iki kez ddH₂O'da ~1 saat boyunca lekeden arındırın.

5. Cdr1 ATPase Faaliyetlerinin Belirlenmesi ⁵⁷

1. HB'de plazma membran örneklerini >2,2 mg/mL ila 1-2 mg/mL arasında seyreltin.
2. ATPase test kokteylini dengeleyin (75 mM MES-Tris, 75 mM potasyum nitrat, 0.3 mM amonyum molibdat, 7.5 mM sodyum azit; pH 7.5) ve Mg-ATP (28.8 mM ATP disodiyum tuz, 28.8 mM MgCl₂; pH 7.0) ila 30 °C 30 °C inkübatörde.
   DİkKAT: Sodyum azit oldukça toksiktir.
   NOT: Tüm tampon stoklarının ve şişelerinin fosfat içermemesini sağlayın; yani, züccaciyeyi% 1 (vol / vol) HCl ile yıkayın ve ddH₂O ile birkaç kez durulayın. Ayrıca, camları yıkamak için kullanılan deterjanlarda yaygın olarak bulunan fosfat izlerini içeren diğer cam eşyalardan ayrı tutun.
3. 96 kuyulu bir mikrotiter tabağın bireysel kuyularına Cdr1-ATPase inhibitörü (20 μM oligomicin) ile veya Cdr1-ATPase inhibitörü olmadan 90 μL test kokteyli ekleyin.
   NOT: Test üç taraflı olarak gerçekleştirilir.
4. Mikrotiter plakanın uygun kuyularına izole plazma membranlarının (~5-10 μg protein) veya fosfat standartlarının (0-100 nmoles Pi) 5 μL'sini ekleyin.
   NOT: İki ayrı fosfat standardı kümesi için ilk ve son sütunları saklayın.
5. Tek tek kuyulara çok kanallı pipetli 25 μL önceden ısıtılmış 28,8 mM Mg-ATP (6 mM son konsantrasyon) ekleyerek teste başlayın ve 30 dakika boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
6. 6 M sülfürik asitte 130 μL gelişim reaktifi (%1,6 sodyum L-askorbat, %1 SDS, %12 amonyum molibdat) ekleyerek reaksiyonu durdurun.
   DİkKAT: Konsantre sülfürik asit su ile şiddetli tepki verir. Aşındırıcıdır ve cilt ve akciğer hasarına neden olabilir.
7. RT'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
8. Mikrotiter plaka okuyucu ile 750 nm'deki mikrotiter plaka kuyularının emiciliğini okuyun.
   NOT: Mavi boya gelişimi için 10 dakikalık kuluçka süresine (yani azaltılmış fosfor-molibden kompleksi) bağlı kalmak, test doğruluğu için kritik öneme sahiptir, çünkü mavi boya gelişimi zamanla devam eder.
9. Oligomisin yokluğunda toplam ATPase aktivitesinden oligomisin varlığında ATPase aktivitesini çıkararak Cdr1'e özgü ATPase aktivitesini (yani oligomisin duyarlı ATPase aktivitesini) elde edin.

6. Küçük ölçekli deterjan ekranı

1. Cdr1-mGFPHis'i aşırı ifade eden hücrelerin plazma zarı preparatlarını (yani 2,5 mg plazma membran proteini) GTED-20 tamponu [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, %20 (w/v) gliserol; pH 7,5; test deterjanının 5 mgını içeren 1 mM PMSF] ile taze takviyeli, %1 (w/v) deterjanla desteklenen toplam 0,5 mL hacme ulaşmak için.
2. Karışımı 4-8 °C'de bir döndürme cihazıyla 2 saat döndürün.
3. Karışımı 1 saat boyunca 4 °C'de 141.000 x g'da santrifüjleyin.
4. Çözünür malzeme içeren süpernatantı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
5. Çözünmeyen pelet fraksiyonu için %2 (w/v) SDS ile desteklenmiş 0,5 mL GTED-20 tampon ekleyin ve tüm deterjan çözünmeyen membran proteinini çıkarmak için sallanan bir inkübatörde 30 °C o/n'de kuluçkaya yatırın.
6. SDS-PAGE ile süpernatant ve çözünülmüş pelet fraksiyonlarını analiz edin ve karşılaştırın.
7. Coomassie boyamadan önce jel içi GFP floresan için GFP etiketli proteinler içeren fotoğraf jelleri ve görüntüleme sistemi ile ekspresyon seviyelerini ölçün.
8. Uygun deterjanları tanımlamak için floresan boyutu dışlama kromatografisi (FSEC)⁵⁸ gibi aşağı akış uygulamaları için çözünür membran protein fraksiyonunu kullanın.

pYES2(Şekil 2B)ile S. cerevisiae ADΔΔ'nin (~4 x10 4 transformant/μg) yüksek dönüşüm sıklığı elde edildi. Beklendiği gibi, DNA (yani, yalnızca ddH2O) kontrolü dönüştürücü vermedi ve doğrusal CDR1-mGFPHis dönüşüm kasetinin 1 μg'si (Şekil 1A) optimize edilmiş ADΔΔ dönüşüm protokolü ile ~50 dönüştürücü (Şekil 2C) verdi. CDR1-mGFPHis dönüştürücüleri, kusurlu mitokondri ile olası minyon mutantları ortadan kaldırmak için fermente edilemeyen bir karbon kaynağı üzerinde büyüme yetenekleri için de test edildi. Üç (sarı daireler; Şekil 2D) test edilen 25 urasil-prototrop transformant ypg agar plakalarında büyüyemedi ve daha fazla araştırmadan atıldı. Yeni oluşturulan ADΔΔ-CDR1-mGFPHis suşu tarafından ifade edilen Cdr1-mGFPHis plazma zarında düzgün bir şekilde lokalize edilir (Şekil 1A) ve Cdr1'in yapısal ve fonksiyonel karakterizasyonu için yeterli seviyelerde ifade edilir (Şekil 3). Optimize edilmiş çift etiketin tasarımı (Şekil 1B) ayrıca aşağı akış uygulamalarında etiketten olası paraziti önlemek için Cdr1-mGFPHis'in Nikel benzeşimli saflaştırılmasından sonra mGFPHis çift etiketinin kaldırılmasını sağlar. Bununla birlikte, ilk sonuçlar, Cdr1 ile HRV-3C proteaz dekolte bölgesi arasındaki 3 amino asit bağlayıcının daha hızlı, daha etkili, bölünme elde etmek için uzatılması gerekebileceğini göstermiştir. Benzer gözlemler son zamanlarda N-terminal etiketli nükleozid taşıyıcı Escherichia coli NupC için rapor edildi, hangi 59 Nikel-benzeşim reçine bağlı deterjan (DDM) çözünür NupC verimli bölünme için başlangıçta tasarlanmış 3 amino asit bağlayıcı yerinebir 15gerektiren . HRV-3C bölünme bölgesinin 5 amino asit bağlayıcı C terminali, daha önce C. utilis ABC taşıyıcı Cdr139için gözlemlediğimiz ekli ilgi proteini ile mGFPHis çift etiketinin sterik parazitini önler. yEGFP3-A206K mutasyonu, yüksek protein konsantrasyonlarında yapay GFP-dimerizasyonunu önlemek için oluşturulmuştur28ve mGFP ile Nikel benzeşimi etiketi arasındaki ek 3 amino asit bağlayıcı, etiketli proteinin nikel benzeşim reçinesine (veri gösterilmez) bağlanma verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için O etiketinin uygun yüzeye maruz kalmasını sağlar.

Şekil 1: Mantar plazma membran taşıyıcılarının verimli klonlama ve ekspresyöneti için maya zarı protein ifade platformu. (A) PDR5 promotörü (mavi), XLmGFPHis (yeşil), PGK1 sonlandırıcı (turuncu), URA3 seçim işaretçisi (açık mavi) ve PDR5 aşağı akış bölgesinin (mavi) bir parçası ile etiketlenmiş CDR1 (kırmızı) C-terminalini içeren bir dönüşüm kaseti, S ifade ana bilgisayarını dönüştürmek için kullanılır.cer genomik PDR5 lokusunda entegrasyonla ADΔΔΔ'yi tahliye edin. Fonksiyon kazanımı mutant transkripsiyon faktörü Pdr1-3, plazma zarında Cdr1'in (kırmızı sekizgenler) konsitutive aşırı ifadeye neden olur (altındaki konfokal mikroskopi görüntüsüne bakın). (B) Plasmid pABC3-XLmGFPHis, geleneksel bir klonlama stratejisinde veya bir dönüşüm kaseti oluşturmak için PCR şablonu olarak kullanılabilir. plazmid pABC3-XLmGFPHis'in pABC3-GFP14 üzerindeki iyileştirmeleri plazmid haritasının altında listelenmiştir. (C) ADΔΔ'nin genomik PDR5 lokusundaki dönüşüm kasetini entegre etmek için alternatif daha verimli bir tek adımlı klonlama stratejisi. Bir ORF (kırmızı), sol kolla örtükler oluşturan astarlar (oklar) kullanılarak PCR yükseltilebilir (mavi; PDR5 promotörü) ve sağ kol (yeşil; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 aşağı akış) parçaları. Mutasyonlar (siyah çizgiler) gerekirse astar tasarımı ile ORF'ye sokulabilir. PDR5 lokusta doğru entegrasyonu yönlendiren homolog rekombinasyon olayları, çapraz kesik çizgilerle gösterilir. (D) Mantar çokdrug efflux pompalarının fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılabilecek tüm hücre tahlilleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CDR1ile ADΔΔ'nin dönüşümü -mGFPHis dönüşüm kaseti ve minyon ADΔΔ-CDR1-mGFPHis dönüştürücülerinin ortadan kaldırılması. Urasil prototrofik transformatörler, dönüştürülmüş ADΔΔ hücrelerini 3 gün boyunca 30 °C'de CSM-URA plakalarında inkübe ederek seçildi. (A) Negatif kontrol (DNA yok). (B) Pozitif kontrol (10 ng pYES2). (C) CDR1-mGFPHis transformantları (1 μg DNA). (D) ADΔΔ-CDR1-mGFPHis dönüştürücülerinin YPG agar plakalarında minyon fenotip için test edildi. Kusurlu mitokondriler nedeniyle YPG agar plakalarında yetişemeyen minyon transformantlar sarı ile çevrelenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

GFP floresan, Cdr1-mGFPHis miktarı (adım 3.3.9) ve jel floresan sinyalleri arasında doğrusal bir ilişki olduğu için Cdr1 ekspresyon seviyeleri için güvenilir bir ölçüdür (Şekil 3A). Bu projede, plazma membran proteinlerinin biyokimyasal karakterizasyonu için yüksek kaliteli küçük ölçekli plazma membran preparatlarının hızlı üretimi için tekrarlanabilir optimize edilmiş bir iş akışı geliştirilmiştir. En yüksek Cdr1 ATPase aktivitesini (φ 400 nmol/dk/mg) gösteren yaklaşık 0,5 mg plazma membran proteini(Şekil 3C; sol grafik) üretmek mümkündü; Şekil 3C; sağ grafik) logaritmik fazın 40 ODU'sını(1-3'ün 600nm OD'si) kırdığında (0,5 mL HB'de yeniden depolanmış) aynı hacimde (yani, 0,5 mL) silika boncukları ve maksimum sallama yoğunluğunda 1 dakika boyunca 6 vorteks döngüsü ve ardından buz üzerinde 3 dakikalık soğutma süreleri. Kırılma döngülerinin sayısında daha fazla artış (adım 3.3.3) izole plazma membran preparatının kalitesini düşürdü (Cdr1 ATPase aktivitesi 170 nmol / dk / mg'dan ~ 60 nmol / dk / mg'a düştü; veriler gösterilmedi). Plazma membran örneklerinin SDS-PAGE protein desenlerinde daha yüksek sayıda kırılma döngüsü ile kırılan hücrelerde sadece küçük farklılıklar olsa da (veriler gösterilmemiştir), 10 veya daha fazla kırılma döngüsünden sonra neredeyse 3 kat azaltılmış Cdr1 ATPase aktivitelerinin aşağıdakilerden biri tarafından neden olması muhtemeldir: i) Cdr1'in yüksek sıcaklığa maruz kalması nedeniyle kısmi denatürasyonu; ii) fosforilasyon veya defosforilasyon gibi çeviri sonrası değişiklikler; veya iii) izole plazma membran veziklinlerinin diğer organellerin membran fraksiyonları ile çapraz kontaminasyonunu arttırmıştır. 0,5 mL HB'de 40 ODU hücre kırılması en yüksek plazma zarı kalitesini (yani, 10 μg plazma membran proteini başına en fazla Cdr1; Şekil 3B) en yüksek Cdr1 ATPase aktivitesi ile (Şekil 3C; sağ grafik). Daha yüksek (> 40 ODU/0,5 mL HB) veya daha düşük (20 ODU/0,5 mL HB) hücre yoğunlukları izole plazma zarlarının ATPaz aktivitesini azalttı (Şekil 3C; sağ grafik), ancak verimleri artan hücre yoğunluklarıyla orantılı olarak arttı(Şekil 3C; sol grafik). Böylece 40 ODU/0,5 mL HB, en yüksek kalitede plazma zarlarının izolasyonu için optimum hücre yoğunluğu oldu. Bu nedenle, plazma membran preparatlarının küçük ölçekli izolasyonu için optimize edilmiş protokolün kullanılması, 2-3 kat daha yüksek Cdr1 spesifik ATPase aktivitelerine (~300 nmol / dk / mg; Şekil 3C; sağ grafik) başlangıçta elde edilen Cdr1 spesifik ATPase etkinlikleri ile karşılaştırıldığında (~100 nmol/dk/mg; veri gösterilmez). Bu ATPase faaliyetleri ayrıca daha önce bildirilen cdr1 ATPase faaliyetlerinden (100-200 nmol/dk/mg) daha emek yoğun ve zaman alıcı büyük ölçekli plazma membran hazırlama protokolü14 , 41,60 ile eldeedilenden önemli ölçüde dahayüksekti.

Membran proteinlerini biyolojik zarlardan çıkarmak için en yaygın yöntem deterjanla çözünür hale getirmektir. Bununla birlikte, zorluk, protein stabilitesi ve / veya katlama özellikleri üzerinde en az zararlı etkiye sahip uygun bir deterjan bulmaktır. Proteinin mGFPHis ile etiketlenerek protein ekstraksiyonu için en iyi deterjanların seçilmesi taramayı kolaylaştırır. Toplamda, 31 deterjan, Listelenen Malzemeler Tablosundaçeşitli özelliklere sahip S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis hücrelerinin ham plazma membranlarından Cdr1'i yatıştırma yetenekleri test edildi. 16 test deterjanı (A-Q) temsili bir setinin sonuçları Şekil 3D'de gösterilmiştir. T, P ve S şeritleri, deterjan çözünürlüğü (adım 6.2) ve deterjan çözünmeyen peletten (P; 0,5 mL GTED-20, %2 SDS; adım 6,5) ve deterjan çözünür süpernatant (S; adım 6,4) fraksiyonlarında çözünür hale getirilir, 141,000 x g'daultra merkezirifugation ile ayrıldıktan sonra kesirler. İstenen deterjan, yapısını ve/veya işlevini değiştirmeden mümkün olduğunca çok Cdr1-mGFPHis'i çözünmelidir. Ham plazma membran proteinleri (5 mg/mL) %1 (w/v) deterjan (T) ile 2 saat boyunca çözünür hale getirilmiş ve çözünür (S) ve çözünmeyen (P) fraksiyonları SDS-PAGE (Şekil 3D)ve daha sonra floresan algılama boyut-dışlama kromatografisi (FSEC)58 (Şekil 4)ile analiz edilmiştir. Cdr1'in verimli bir şekilde çözünmesi için minimum deterjanın 2:1 (w/w) protein oranına kadar gerekli olduğunu belirledik. Aslında, Cdr1-mGFPHis'in çözünmesi için gereken optimum deterjan (DDM) konsantrasyonunu belirlemek için, deterjanın kritik misel konsantrasyonu (x CMC) ve deterjan/membran protein oranı (w/w) araştırılmıştır. DDM'nin 10x veya 80x CMC sabit konsantrasyonları kullanılırken Cdr1-mGFPHis'in çözünme verimliliklerinde büyük farklılıklar gözlendi. Çözünürleştirme verimlilikleri, çeşitli çözünürlükasyon deneylerinde kullanılan ham plazma membranlarının miktarlarına bağlı olarak% 40 ila% 80 veya% 60 ila% 90 arasında değişmektedir. Bununla birlikte, deterjanın ≥2 (w/w) protein oranlarına seçilmesi, kullanılan plazma membran proteini miktarı ne olursa olsun, Cdr1-mGFPHis'in% > 85'inin çözünmesiyle tekrarlanabilir derecede iyi sonuçlar verdi. Bu nedenle, Cdr1-mGFPHis gibi membran proteinlerinin çözünmesi için sadece% 1 veya% 2 (w / v) deterjan seçmenin daha yaygın yaklaşımını kullanıyorsanız, deterjanı protein oranına 2(w/w) üzerinde tutmak önemlidir [yani% 1 (yani 10 mg/mL) deterjan kullanırken plazma membran protein konsantrasyonunu 5 mg/mL'nin altında tutun].

Şekil 3: Cdr1-mGFPHis ekspresyon seviyelerinin nicelleştirilmesi, Cdr1-mGFPHis için küçük ölçekli plazma membran izolasyon protokolünün ve deterjan ekranının optimizasyonu. (A) Cdr1-mGFPHis'in jel floresan ile nicelemesi; Coomassie lekeli ve jel floresan SDS-PAGE görüntüleri aynı 0.7% poliakrilamid jel solda gösterilir. 1 ile 6 arası şeritler 0,75, 1,5, 3, 6, 12 ve 24 μg ADΔΔ-CDR1-mGFPHis plazma membran proteini ile yüklendi. Cdr1-mGFPHis kırmızı bir okla gösterilir. M = Precision Artı Protein İşaretleyici. mGFP floresan yoğunlukları (sağda gösterilmiştir) test edilen tüm konsantrasyon aralığında doğrusaldı ve minimum arka plan floresan vardı. (B) Kırılmadaki hücre yoğunluğunun izole plazma zarlarının kalitesine etkisi. Coomassie lekeli poliakrilamid jel (%7) plazma membran protein örnekleri (10 μg) ve aynı jel cdr1-mGFPHis yeşil floresan sinyalleri Coomassie boyamadan önce. M = Precision Artı Protein İşaretleyici. Şerit 1, 3, 5 ve 7 ADΔΔ'nin plazma membran proteinleridir ve 2, 4, 6 ve 8 şeritleri sırasıyla 20, 40, 60 ve 80 ODU hücrelerinden izole edilen ADΔΔ-CDR1-mGFPHis'in plazma membran proteinleridir. Cdr1-mGFPHis kırmızı bir okla gösterilir. Yeşil floresan sinyallerin göreli yüzdeleri altında listelenir. (C) Kırılmadaki hücre yoğunluğunun izole plazma zarlarının verimine ve Cdr1-mGFPHis'in ATPase aktivitesi üzerine etkisi. Solda, hücre yoğunluğunun (ODU/0,5 mL HB) ADΔΔ ve ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1) hücrelerinden izole edilen plazma membran proteini miktarı üzerindeki etkisi. Sağda, hücre yoğunluğunun ADΔΔ-CDR1-mGFPHis hücrelerinden izole edilen plazma zarlarının Cdr1 ATPase aktivitesi üzerindeki etkisi. (D) Solubilizasyon karışımının 10 μL aliquots örnek SDS-PAGE (T; 0.5 mL), çözünürleştirme sonrası pelet (P; 0,5 mL) ve aynı jelin (altta) Coomassie lekelenmesinden önce ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (üstte) ve Cdr1-mGFPHis'in jel floresanının çözünmüş (süpernatant) fraksiyonları (S; 0,5 mL) deterjan çözünür ham plazma membran proteinleri. M = geniş MW önceden lekeli protein merdiveni (245, 180, 135, 100, 75, 63 ve 48 kDa bantları; 180 kDa ve 75 kDa bantları sırasıyla kırmızı ve yeşil oklarla gösterilir). A'dan L'ye ve N'den Q'ya kadar olan şeritler T, S, DM (A), β-DDM (B), α-DDM (C), TDM (D), LMNG (E), OGNG (F), OG (G), LDAO (H), Hega için P fraksiyonları (I), Mega (J), Triton-X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), Fos-choline-13 (P) ve SDS (Q). Kısaltmalar Malzeme Tablosundatanımlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Deterjan tarama sonuçlarına dayanarak (Şekil 3D), DDM (B ve C) ve Fos-kolin-13 (P), Cdr1-mGFPHis'in çözünmesi için en iyi deterjanlar olarak görünmüş. Bununla birlikte, Fos-kolin-13 kullanımı Cdr1-mGFPHis'in kısmi proteolizine neden olduğu görünmektedir (Şekil 3D'deP). LMNG (E), PCC-α-M (gösterilmez) ve muhtemelen DM (A) bir sonraki en iyi deterjanlardı. Deterjan ekranı ayrıca çözünmeyen pelet fraksiyonlarında proteinin önemli miktarda bulunduğundan, OGNG (F) ve OG (G), CHAPS (L), NM (N) ve Anzergents (gösterilmeyen) glukozin cdr1-mGFPHis'in çözünmesi için kötü seçimler olduğunu göstermiştir. SDS denatures Cdr1-XLmGFPHis, bu yüzden Q şeritlerinde yeşil floresan sinyalleri görünmüyor (Şekil 3D).

Bir deterjanın düzgün katlanmış yerli Cdr1-mGFPHis parçacıklarının çözünmesi için uygunluğu, deterjan çözünmüş plazma membran proteininin (adım 6.4 supernatant) FSEC tarafından da değerlendirildi. %1 deterjanla çözünen ADΔΔ-CDR1-mGFPHis'ten (2 mg/mL) 100 μL ham plazma membran proteini için elde edilen kromatogram örnekleri Şekil 4'tegösterilmiştir. 9 mL elüsyon hacmindeki zirve çoğunlukla boşluk hacminde geçen toplu Cdr1-mGFPHis'i temsil ederken, düzgün bir şekilde çözünmüş ve doğru katlanmış Cdr1-mGFPHis parçacıkları Gauss şeklindeki tepe ile 15,5 mL'lik elüasyon hacminde temsil edilir. 12 ila 14 mL arasındaki geniş omuz muhtemelen daha az iyi tanımlanmış Cdr1-mGFPHis misel parçacıkları içerir ve/ veya kısmi yanlış katlanma veya protein agregalarını gösterir. Maltosides ve LMNG çıkarılan proteinlerin kromatogramları, Cdr1-mGFPHis'in çoğunun 15,5 mL'de güzel şekilli bir Gauss zirvesi olarak, küçük bir omuzla 14 mL'de biraz daha erken eluting olduğunu gösterdi (Şekil 4A). Bu örneklerde boşluk hacminde cdr1-mGFPHis yoktu. Boş örnek, mGFP sinyali veren tampon artı DDM kontrolüdür. Şekil 4B'deki kromatogramlar, deterjanın çözünmüş Cdr1-mGFPHis parçacıklarının kalitesi için şeker kafa grubu tipinin önemini vurgulamaktadır. Deterjan içeren glikoz (OG, NG, OGNG), deterjan içeren sakkarozdan (DDS) daha kötü performans gösterdi ve bu da deterjan içeren maltozdan (NM, DMNG, DDM) daha kötü performans gösterdi. Cdr1-mGFPHis, Şekil 3D'degözlenen OGNG (F) ve OG (G) için pelet fraksiyonlarında Cdr1-mGFPHis çökeltisinin büyük bir oranından beklenen, agrega (OG) veya geniş bir agrega tepe (NG, OGNG) olarak elde edilen deterjan içeren glikoz içeren glikoz ile çözünür. DMNG kromatogramı olmasına rağmen (yeşil; Şekil 4B) niteliksel olarak DDM kromatograma (mavi; Şekil 4B), DDM için daha yüksek tepeler, DMNG çözünmüş Cdr1-mGFPHis'in büyük bir kısmının aslında denatüre olabileceğini gösterir. Şekil 4C, zwitterionic Fos-cholines için FSEC kromatogramlarını gösterir (Fos-kolin-8, Fos-choline-10, Fos-choline-13) ve iki iyonik olmayan deterjan (digitonin, Triton-X100) ve Şekil 4D, fos-kolin-8, -10 ve -13 ve DDM için kromatogramın kalitesi üzerinde iki kat daha fazla (200 μL) deterjan çözünürlüğü yüklemenin nasıl gözle görülür bir etkisi olmadığını göstermektedir. Sadece digitonin (turuncu; Şekil 4C) DDM'ye benzer bir kromatogram verdi (mavi; Şekil 4C) Fos-choline-13 simetrik keskin şekilli bir tepe vermesine rağmen, yine DDM'den (15,5 mL) önemli ölçüde daha düşük bir elüsyon hacmi (14 mL) ile eluted. Genel olarak, 12 veya 13 karbon kalıntısı daha uzun alifatik yan zincirlere sahip deterjanlar tarafından daha iyi çözünme eğilimi vardı; Örneğin, DDM > DM > NM (12, 10 veya 9 karbon), Fos-kolin-13 > 10 > 8 (13, 10 veya 8 karbon) ve LMNG > DMNG > OGNG (12, 10 veya 8 karbon). Bu nedenle, 12 karbondan daha az hidrofobik kuyruklu deterjanlar, Cdr1-mGFPHis'in çözünmesi için 12 veya 13 karbonluk daha uzun hidrofobik kuyruklara sahip deterjanlara göre çok daha az uygun deterjanlardı, ve iyonik olmayan deterjanlar (DDM, LMNG) genellikle Cdr1-mGFPHis'in çözünürlüğü için zwitteriyonik deterjanlardan daha uygun görünüyordu (Şekil 3D, Şekil 4).

Şekil 4: Cdr1-mGFPhis için deterjan taraması FSEC kullanılarak çözünür. 100 μL çözünmüş ADΔΔ-CDR1-mGFPHis ham plazma membranının (2 mg/mL) kromatogramları, deterjanların % 1'i belirtilmiş ve Superose 6-artmış 10/300 GL boyutu dışlama sütunu kullanılarak ayrılmıştır. Kromatogramlar, toplanan elüsyon tamponunun bir sütun hacminin (CV; 25 mL) göreli mGFP floresan birimlerini (FU) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.