DNA Metilasyonunun Biyoinformatik Analizine Örnek Hazırlama: Obezite ve İlgili Özellik Çalışmaları için Dernek Stratejisi

Özet

Bu çalışma, mikroarray teknolojileri tarafından elde edilen DNA metilasyon verilerini yönetmek için iş akışını açıklamaktadır. Protokol, numune hazırlamadan veri analizine kadar olan adımları gösterir. Tüm prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve video önemli adımları göstermektedir.

Özet

Obezite doğrudan yaşam tarzıyla bağlantılıdır ve hastalığın gelişimine katkıda bulunan adipogenez ve lipit depolama süreçlerinde değişikliklere neden olabilecek DNA metilasyon değişiklikleri ile ilişkilendirilmiştir. Obezitesi olan ve olmayan hastaların seçiminden epigenetik veri analizine kadar eksiksiz bir protokol sunuyoruz. Protokoldeki tüm adımlar bir pilot çalışmada test edildi ve doğrulandı. 15 bireyin Vücut Kitle İndeksine (VKİ) göre obezite ile sınıflandırıldığı çalışmaya 32 kadın katıldı (45.1 ± 5.4 kg / ^m2); 17 birey ise VKİ'ye göre obezitesiz olarak sınıflandırıldı (22.6 ± 1.8 kg/^m2). Obezitesi olan grupta lineer regresyon analizi ile yağ kütlesi ile ilişkili 564 CpG bölgesi tespit edildi. CpG siteleri organizatör bölgelerindeydi. Diferansiyel analiz, obezitesi olan bireylerde 470 CpGs hipometillenmiş ve 94 hipermetillenmiş bölge buldu. En hipometillenmiş zenginleştirilmiş yollar RUNX, WNT sinyalizasyonu ve hipoksiye yanıttaydı. Hipermetillenmiş yollar insülin sekresyonu, glukagon sinyalizasyonu ve Ca2+ ile ^ilişkiliydi. Protokolün DNA metilasyon modellerini ve özellik ile ilişkili DNA metilasyonunu etkili bir şekilde tanımladığı sonucuna vardık. Bu paternler, adipogenezi ve lipit depolamasını etkileyen değiştirilmiş gen ekspresyonu ile ilişkili olabilir. Sonuçlarımız, obezojenik bir yaşam tarzının insan DNA'sındaki epigenetik değişiklikleri destekleyebileceğini doğruladı.

Giriş

Büyük ölçekli omik teknolojiler, kronik hastalıkların çalışmalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin ilginç bir özelliği, bilimsel topluluğa büyük miktarda üretilen verinin mevcudiyetidir. Bu nedenle, çalışmalar arasında teknik karşılaştırmaya izin vermek için protokollerin standartlaştırılması talebi ortaya çıkmıştır. Bu çalışma, DNA metilasyon verilerini elde etmek ve analiz etmek için bir protokolün standardizasyonunu önermektedir ve pilot bir çalışmayı uygulanmış bir örnek olarak kullanmaktadır.

Modern insan yaşam tarzlarında negatif enerji harcaması baskındır, bu da aşırı yağ dokusu birikimine ve dolayısıyla obezitenin gelişmesine yol açmaktadır¹. Birçok faktör, sedentarizm, yüksek kalorili diyetler ve stresli rutinler gibi obezite oranlarını artırmıştır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), 2016 yılında 1,9 milyar yetişkinin obez olduğunu tahmin etmektedir, bu da dünya nüfusunun% 20'sinden fazlasının 30 kg / ^{m2'den fazla BMI2'ye} sahip olduğu anlamına gelir. 2018'in en son güncellemesi, Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD) obezite prevalansının B'den yüksek olduğunu ortaya ^koymuştur3.

Epigenetik, kromozomal bölgelerin değişmiş aktivite durumlarını kaydetmek, işaret etmek veya sürdürmek için yapısal ^{adaptasyonudur4}. DNA metilasyonu, sitozin-guanozin dinükleotid bölgelerinde (CpG bölgeleri) 5-metilsitozin-pG (5mCpG) oluşturan geri dönüşümlü bir kimyasal değişikliktir. Transkripsiyon makinesinin DNA5,6,7,8'e erişimini düzenleyerek gen ekspresyonunu modüle edebilir. Bu bağlamda, hangi CpG bölgelerinin obezite ile ilişkili özelliklerle ilişkili olduğunu anlamak ^önemlidir9. Birçok faktör, bölgeye özgü DNA metilasyonunu destekleyebilir veya önleyebilir. DNA metiltransferazlar10 (DNTM'ler) ve on-on bir translokasyon (TET'ler) gibi bu işlem için gerekli enzimler, çevresel maruziyetler altında DNA metilasyonunu veya demetilasyonunu ^{destekleyebilir11}.

Son yıllarda DNA metilasyon çalışmalarına artan ilgi göz önüne alındığında, her soruyu tam olarak cevaplamak için en uygun analiz stratejisini seçmek, araştırmacıların temel bir endişesi olmuştur12,13,14. 450K DNA metilasyon dizisi, DNA metilasyon profilini belirlemek için 360'tan fazla ^yayında14

Protokol

São Paulo Üniversitesi Ribeirão Preto Tıp Fakültesi Üniversite Hastanesi (HCRP-USP) etik komitesi çalışmayı onayladı (CAAE: 14275319.7.0000.5440). Katılımcılar onay formunu imzaladılar ve tüm prosedürler Helsinki Deklarasyonu'nu takiben gerçekleştirildi.

1. Nüfus ve örnekleme

1. Çalışma için BMI >30 kg / ^m2 olan katılımcıları işe alın. Bu çalışma için, ¹⁸ ila 60 yaşları arasındaki bir katkı ^{popülasyondan19} 32 kadın işe alındı.
   NOT: HCRP-USP'de, esas olarak kadınlarda daha yüksek obezite oranları ^{gözlenmiştir20}. BMI ≥30 kg / ^m2 (n = 15) olan obeziteli katılımcılar, HCRP-USP'deki Metabolik Hastalıklar polikliniğinden işe alındı. VKİ'si 18.5 kg/m2 ile 24.9 kg/^m2 (n=17) arasında olan obezitesi olmayan katılımcılar diğer kliniklerden işe alındı ve ciddi hastalıkları yoktu; klinik veriler Tablo 1'de gösterilmiştir.
2. Hamile, emziren anneler, sigara içen ve alkol tüketen kadınları hariç tutun.

2. Antropometri ve vücut kompozisyonu

1. 200 kg'lık dijital antropometrik ölçek kullanarak katılımcıların ağırlığını ölçün. Ayakkabıları ve fazla kıyafetleri çıkardığınızdan emin olun.
2. 0,5 cm mezuniyete sahip bir stadiometre kullanarak yüksekliği değerlendirin. Katılımcılara çıplak ayak, ayakları birlikte ve kollarını yanlarında tutmaları talimatı ^verildi21.
3. Bir elektrik biyoempedansı kullanarak yağ kütlesi (FM) bilgilerini toplayın. 12 saatlik açlıktan sonra, boş bir idrar kesesi ile değerlendirin. Katılımcıları, vücuda dokunmadan bacakları birbirinden ayrı ve kolları paralel olacak şekilde sırtüstü pozisyona yerleştirin. Katılımcılara tüm metal aksesuarları çıkarmalarını ^söyleyin22.
4. 0,1 mm dereceli uzatılamaz bir ölçüm bandı kullanarak bel çevresini (WC) elde edin. Bant, kalça kemiklerinin hemen üstünde, orta belin etrafına yatay olarak yerleştirildi. Ölçüm bir nefes verildikten hemen sonra gerçekleşti. Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerine (CDC) göre, kadınlar için WC kesimi 88 ^cm23'tür.

Tablo 1: Popülasyon özellikleri. Tüm değişkenler parametrikti (p > 0.05, Shapiro Wilk) ve farklılıklar, p < 0.05'in anlamlı kabul edildiği Bağımsız bir t-Testi kullanılarak değerlendirildi. *p 0,0001 <. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

3. Biyolojik materyalin toplanması

1. Daha önce açıklandığı gibi, 12 saatlik açlıktan sonra periferik kan ^toplayın24.
2. Tam kan örneklerinin 4 mL'sini antikoagülan (örneğin, EDTA) içeren toplama tüplerinde toplayın ve nakliye için buz üzerinde saklayın.

4. DNA ekstraksiyonu

1. Kanı içeren her tüpü 10 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj yapın. Buffy ceketin yaklaşık 300 μL'sini toplayın (beyaz interfaz).
2. Daha önce açıklandığı gibi, ticari olarak temin edilebilen bir alet kullanarak periferik kandan DNA çıkarın (bakınız Malzeme Tablosu25). DNA'yı 480 μL ultra saf _H2O içinde süzün.
3. Bir florometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ve kalitesini değerlendirin. Bütünlük %1 agaroz jeli analizi kullanılarak ^{değerlendirildi25}. -80 °C'de bir dondurucuda saklayın.

5. Metilasyon analizinden önce hazırlık

1. Numunelerin minimum DNA konsantrasyonuna sahip olduğundan emin olun (500 ng başlamak için ideal ilk girdidir), ancak seyreltme bu adımda numuneler arasında değişebilir.
2. Bazı reaktifler mikroarray ^kit26'ya dahil değildir, bu nedenle bunları ayrı olarak satın ^alın27.
3. Kitin prosedür sırasında kullanılan tüm reaktifleri içerip içermediğini kontrol edin; yeri doldurulamaz. Tüm reaktiflerin son kullanma tarihini kontrol edin. Kitte sağlanmayan diğer reaktiflerin ve çözeltilerin de mevcut olduğundan emin olun (%95 formamid/1 mM EDTA, 0,1 N NaOH, mutlak etanol, 2-propanol).
   DİKKAT: Formamid uçucu bir reaktiftir; Ürün tazeyse sonuçların kalitesi artırılabilir. Formamid ve mutlak etanolün bütünlüğü ve kalitesi kritik olarak kabul edilir, çünkü üretici tarafından önerilen boyama işlemini etkileyebilirler. Seçilen alkoller, moleküler biyoloji analizi için spesifik ultra saf ürünler olmalıdır.
4. Mikrodizi kiti edinildikten sonra, Chips Decode Maps (DMAP) 'ı indirin. Bu dosyalar, kit gönderildikten 24-48 saat sonra üreticinin web sitesinde mevcuttur ve son kullanma ^tarihinde28 hariç tutulur. Belirtilen dosyaları indirmek için aşağıdaki adımları uygulayın.
   1. İnternet erişimi olan bir bilgisayarın mevcut olduğundan emin olun. Yazılım Kod Çözme Dosya İstemcisi'ni kullanarak indirme işlemini gerçekleştirin.
   2. Programı yüklemeden önce, bilgisayarın kurum tarafından verilen giden ve gelen erişime sahip olduğundan emin olun; Kod Çözme Dosya İstemcisi'nin güvenlik kısıtlamaları yoktur.
   3. Access by BeadChip seçeneğini kullanarak Dosya İstemcisinin Kodunu Çözme yazılımında oturum açın. Bu oturum açma MyIllumina kullanıcı kimliği ve şifre kullanılarak gerçekleştirilir. Bu sayfaya kayıt olmanız ^{gerekmektedir28}.
   4. Kod Çözme Dosya İstemcisi'nde oturum açtıktan sonra, yazılım ana sayfasındaki ilgili alanlarına aşağıda listelenen bilgileri ^girin28: Barkodların listesi; Kutu Kimliklerinin Listesi; Satınalma siparişi numarası (PO); ve Satış siparişi numarası (sayıları takip eden harfleri eklememeyi unutmayın).
   5. Satın alma kutusundaki barkod numarasına göre indirilecek DMAP'leri seçin ve DMAP'leri kaydetmek için iletişim kutusunda hedefi belirtin.
   6. Karşıdan yüklemeyi başlatmak için düğmeyi tıklatın.
      NOT: İndirme işleminin sonunda, indirilen klasörlerin boş olmadığından emin olun ve denemeleri Intensity Data Files'a (IDAT dosyaları) dönüştürmek için son adım için gerekli olacağından, dosyaları güvenli bir şekilde saklayın. Son kullanma tarihinden sonra, Illumina DMAP'lerin verilerini çevrimiçi veritabanından kaldırabilir.

6. DNA metilasyon boru hattı

NOT: DNA metilasyon deneyi 4 güne ayrılmıştır (Şekil 1). Doğru sonuçlar elde etmek için üreticinin tavsiyelerine ve teknik özelliklerine uyun.

1. 1. Gün: Bisülfit tedavisi
   1. 500 ng genomik DNA'yı denatüre ederek başlayın, ardından dönüşüm reaktiflerini ekleyin. Bu adımı gerçekleştirmek için bisülfit ve mikroarray kitlerinin tavsiyelerine ^uyun29.
   2. Denatüre DNA'yı, üretici tarafından sağlanan standart konsantrasyonda 130 μL bisülfit dönüşüm reaktifi ile tedavi edin.
   3. Tüpü bir termosikler içinde 30 s için 95 ° C'de 16 döngü ve 1 saat boyunca 50 ° C'de inkübe edin. Termosikler'i 10 dakika boyunca 4 °C'ye kadar yükseltin.
   4. Yıkama tamponuna 100 μL ekleyerek ve ardından 30 saniye boyunca tam hızda santrifüj yaparak yıkama adımını gerçekleştirin. Konsantrasyon kullanım kılavuzunda sağlanmamıştır ve üretici hacimleri standartlaştırır.
      NOT: Bu reaktif kit ile birlikte gelir ve seyreltilmesi veya hazırlanması gerekmez.
2. 2. Gün: Amplifikasyon - Metilasyon Testi, Manuel Protokol
   1. Hibridizasyon fırınını önceden 37 ° C'ye ısıtın ve sıcaklığın dengelenmesini sağlayın.
   2. 0,8 mL mikro plakaya barkod etiketi uygulayın.
   3. Amplifikasyon reaktiflerini (Çok Numuneli Amplifikasyon Karışımı 1, Rastgele Astar Karışımı ve Çok Numuneli Amfi Ana Karışımı) oda sıcaklığında çözün (bu reaktifler kit ile birlikte gelir ve seyreltilmesi veya hazırlanması gerekmez). Ardından, tüplerin tüm içeriği karışana kadar en az 10x yumuşak bir ters çevirme işlemi gerçekleştirin.
   4. Çok Numuneli Amplifikasyon Karışımı 1'in (MA1) 20 μL'sini plakanın kuyucuklarına dağıtın.
   5. DNA örneğinin 4 μL'sini bisülfit dönüştürülmüş plakadan 0.8 mL plakadaki karşılık gelen kuyucuklara aktarın. Bu noktada, orijinal DNA örneğinin kimliğini plaka kuyularına karşılık gelen laboratuvar izleme formuna kaydedin.
   6. Çok Örnekli Amplifikasyon Karışımı 1 (MA1) ve DNA örneğini içeren plakanın her bir kuyucuğuna 4 μL 0.1 N NaOH dağıtın.
   7. Plakayı plastik bir conta ile kapatın.
   8. Reaktifleri numunelerle 1 dakika boyunca 1.600 rpm'de karıştırmak için plakayı vorteksleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatın ve contayı dikkatlice çıkarın.
   9. Plakanın her bir kuyucuğuna 68 μL Rastgele Astar Karışımı (RPM) pipeti. Pipet, plakanın her bir kuyucuğuna 75 μL Çok Numuneli Amp Master Mix (MSM) (önceki çözeltiyi çıkarmadan). Plakayı örtmek için yeni bir conta kullanın.
      NOT: Kuyucukları plaka ile birleştirmeye ve doğru şekilde yönlendirmeye özen gösterin.
   10. Kapalı plakayı 1 dakika boyunca 1.600 rpm'de vorteksleyin. Hibridizasyon fırınında 37 °C'de 20-24 saat inkübe edin.
3. 3. Gün: Hibridizasyon - Metilasyon Testi, Manuel Protokol
   1. Bloğu önceden 37 ° C'ye ısıtın.
   2. Tüpün içeriğini oda sıcaklığında çözün. İçeriği iyice karıştırmak için Parçalanma Çözeltisi (FMS) tüplerini en az 10 kat dikkatlice ve nazikçe ters çevirin.
   3. Plakayı hibridizasyon fırınından dikkatlice çıkarın. Plakayı 280 x g'de darbe-santrifüj yapın.
   4. Şimdi contayı plakadan çıkarın. Bir numune içeren plakanın her bir kuyucuğuna, 50 μL Parçalanma Çözeltisi (FMS) ekleyin ve plakayı tekrar kapatın. Plakayı 1 dakika boyunca 1.600 rpm'de vorteksleyin.
   5. Plakayı birkaç saniye boyunca 280 x g'de santrifüj yapın (darbe santrifüjleme yapın). Ardından, sızdırmaz plakayı ısıtma bloğuna 1 saat boyunca 37 ° C'ye yerleştirin.
   6. Deneyi duraklatmaya ve plakayı dondurmaya karar verilirse, oda sıcaklığında çözün ve 280 x g'de santrifüj yapın. Dondurulmamışsa, bu adımı atlayın ve Adım 6.3.7'ye geçin.
   7. Isıtma bloğunu 37 °C'ye kadar ön ısıtmak için bırakın.
   8. Yıkama Tamponunu oda sıcaklığında çözülmesi için bırakın. Buzu çözüldüğünde, içeriği karıştırmak için en az 10x ters çevirin.
   9. Contayı plakadan çıkarın.
   10. Numuneleri içeren plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL Yağış Çözeltisi (PM1) ekleyin.
   11. Plakayı conta ile tekrar kapatın.
   12. Plakayı 1 dakika boyunca 1.600 rpm'de vorteksleyin.
   13. 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   14. Ardından, nabız santrifüjüne 1 dakika boyunca 280 x g'de yerleştirin.
       NOT: Bir sonraki adım için santrifüjü 4 °C'ye ayarlayın.
   15. Contayı plakadan dikkatlice çıkarın ve atın.
   16. Numuneyi içeren her bir kuyucuğa 300 μL 2-propanol (%100) ekleyin.
   17. Yeni bir conta kullanarak plakayı çok dikkatli bir şekilde kapatın. Tabağı sallamamaya dikkat edin.
   18. Tüm içeriği karıştırarak plakayı en az 10x ters çevirin.
   19. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   20. 20 dakika boyunca 4 ° C'de 3.000 x g'de santrifüj.
       NOT: Adım 6.3.20'nin sonunda, santrifüj plakasını derhal çıkarın.
   21. Contayı plakadan çıkarın ve atın.
   22. Plakayı hızla ters çevirin ve süpernatanı atmak için sıvıyı bir ped üzerinde boşaltın. Ardından, sıvıyı boşaltmak için plakayı kuru bir alanda bir kağıt havlu üzerinde vurun.
   23. 1 dakika boyunca veya tüm kuyucuklar herhangi bir sıvı içermeyene kadar birkaç kez sıkıca dokunun.
   24. Plakayı ters çevirin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca açıkta bırakın.
       NOT: Kuyuların dibinde mavi topaklar görülmesi beklenmektedir.
   25. Hibridizasyon fırınını önceden 48 °C'ye ısıtın.
   26. Ön ısıtmak için ısı bloğunu açın. Bu işlem için 20 dakika bekleyin.
   27. Oda sıcaklığında Dikme Resuspension, Hibridizasyon ve Yıkama Çözeltisi. En az 10x ters çevirin. Çözeltide çökelmiş tuz bulunmadığını kontrol edin.
   28. Plakanın her bir oluğuna 46 μL Resuspension, Hibridizasyon ve Yıkama Çözeltisi (RA1) ekleyin.
       NOT: Kalan reaktifler boyama ve hibridizasyon adımları için ayrılmalıdır.
   29. Contayı plakaya uygulayın. Plakayı örtmek için alüminyum bir conta kullanın. Sızdırmazlığı eşit şekilde gerçekleştirmek için sıkıca tutun.
   30. Buharlaşmayı önlemek için tüm kuyuların güvenli bir şekilde kapatılıp kapatılmadığını kontrol edin.
   31. Yeni kapatılmış plakayı hibridizasyon fırınına dikkatlice yerleştirin ve 1 saat boyunca 48 ° C'de inkübe edin.
   32. Plakayı 1 dakika boyunca 1.800 rpm'de vorteksleyin.
   33. 280 x g'de darbe santrifüjü.
   34. Plakayı 1 saat boyunca 95 °C'de ısı bloğuna aktarın.
   35. Hibridizasyon (Hyb) Odalarını bir araya getirerek hazırlayın. Hyb Odalarının rezervuarlarına 400 μL Nemlendirici Tampon (PB2) dağıtın. Kapağı hemen takın.
   36. Her bir numuneyi plakadan mikrodizinin numune giriş açıklığına yükleyin.
   37. Mikrodizileri içeren Hyb Odası eklerini Hyb Odasına yükleyin. Hyb Odasının olası yer değiştirmesini önlemek için Hyb Odası'nı çapraz olarak kapatın.
       NOT: Hyb Haznelerinin 48 °C'de en az 16 saat boyunca inkübe edilmesi gerekir, ancak 24 saatten fazla olmamalıdır.
4. 4. Gün: Boyama - Metilasyon Testi, Manuel Protokol
   1. Staining Solution 4'ü 330 mL'lik %100 EtOH ile yeniden askıya alın ve 350 mL'lik bir son hacim elde edin. Tam bir yeniden süspansiyon sağlamak için Boyama Çözeltisi 4 şişesini kuvvetlice sallayın. Oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Boyama Çözeltisi 4, 2 °C ile 8 °C arasındaki bir sıcaklıkta 2 haftaya kadar saklanabilir.
   2. Odaları hibridizasyon fırınından çıkarın ve açmadan önce tezgahta 30 dakika soğumaya bırakın.
   3. Hyb Odası soğurken, iki yıkama kabını Yıkama Tamponu (yıkama kabı başına 200 mL) ile doldurun. Her kabı "Yıkama Arabelleği" (PB1 ve PB2) olarak etiketlemeyi unutmayın.
   4. Mikroarray hizalama aksesuarlarını 150 mL Yıkama Tamponu ile doldurun.
   5. Plastik ara parçaları ayırın ve gerekirse camı temizleyin.
   6. Mikroarray slaytları yıkamak için, tel halkayı ızgaraya takın ve damlama ekipmanını toplam 10x boyunca 200 mL Yıkama Tamponu ile kaplara batırın.
   7. Tüm uçları Hibridizasyon Odasından çıkarın ve her diziyi kesici uçlardan çıkarın. Mührü çıkarın.
      NOT: Çıkarma sırasında, açıkta kalan matrislere dokunmayın.
   8. Mikroarray slaytlarını Hibridizasyon Odasından çıkarırken, hiçbir şey dökmemeye dikkat edin.
   9. Yıkama tamponu (PB1) çözeltisindeki mikro dizileri yavaşça ve hafifçe yıkayın, 10x yukarı ve aşağı hareket ettirin. Yeni bir PB1 çözeltisine geçin ve mikro dizileri çözelti içinde yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirerek yıkama işlemini gerçekleştirin.
   10. Mikrodiziyi kaptan çıkarın ve kalıntı olmadığını onaylayın.
   11. Her mikrodizinin üst kısmında şeffaf bir ara parça kullanın ve ara parçaları karşılık gelen konumlara yönlendirin.
       NOT: Beyaz olanları değil, yalnızca saydam ara parçaları kullanmaya dikkat edin.
   12. Hizalama çubuğunu hizalama aksesuarının üzerine yerleştirin.
   13. Şeffaf ara parçanın üstüne bir cam arka plaka yerleştirin; tüm mikrodiziyi kaplamaya dikkat edin. Ardından, akış odalarına metal kelepçeler takın. Gerekirse, akış odası ara parçalarının uçlarını kesmek için makas kullanın.
   14. Hibridizasyon Odası rezervuarlarını _ddH2O kullanarak hemen yıkayın ve küçük bir temizleme fırçasıyla fırçalayın. Rezervuarda herhangi bir Nemlendirici Tamponun kalmasına izin vermeyin.
   15. Uzatma ve Boyama Mikrodizisinden sorumlu olan bir sonraki adıma geçin.
       NOT: Tüm akış odalarını laboratuvar tezgahına yatay olarak monte edilmiş halde bırakın. Sadece tüm boyama adımı hazır olduğunda bunları tekrar kullanın. Resuspension, Hybridizasyon ve Yıkama Solüsyonunu 20 °C ile 25 °C arasındaki bir sıcaklığa ısıtın. Çözeltide kristal görünmeyene kadar hafifçe karıştırın.
   16. Reaktifleri sırayla bir rafa yerleştirin. Herhangi biri donmuşsa, oda sıcaklığında bırakın ve daha sonra çözeltileri karıştırmak için en az 10x ters çevirin.
   17. Su sirkülatörünü uygun seviyeye doldurun.
   18. Pompayı açın ve sıcaklığı 44 ° C'ye ayarlayın.
   19. Oda rafına takılı olan kabarcıkları çıkarın.
   20. Bir sıcaklık probu kullanarak hazne rafında testler yapın. Test edilen tüm yerler 44 °C ile 0,5 °C ± arasında olmalıdır.
       NOT: Aşağıdaki adımlar kesintisiz olarak gerçekleştirilmelidir.
   21. Raf 44 °C sıcaklığa ulaştığında, her bir tertibatı akış odasına hızlı bir şekilde yerleştirin.
       NOT: Aşağıdaki adımlar için, tüm reaktifleri arka cam plakaya pipetleyin.
   22. Pipet 150 μL Resüspansiyon, Hibridizasyon ve Yıkama Çözeltisi (RA1). Ardından, 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bu adımı toplam 5 kat tekrarlayın.
   23. Pipet 450 μL Boyama Çözeltisi 1 (XC1) ve 10 dakika kuluçkaya yatırın.
   24. Pipet 450 μL Boyama Çözeltisi 2 (XC2) ve 10 dakika kuluçkaya yatırın.
   25. Pipet 200 μL İki Renkli Uzatma Master Mix (TEM) ve 15 dakika kuluçkaya yatırın.
   26. Pipet 450 μL% 95 formamid / 1 mM EDTA ve 1 dakika kuluçkaya yatırın.
   27. 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
   28. Oda rafının sıcaklığını 32 °C'ye düşürün (Superior Two-Color Master Mix'te belirtilmiştir).
   29. Pipet 450 μL Leke Çözeltisi 3 (XC3) ve 1 dakika kuluçkaya yatırın.
   30. Odadaki rafın doğru sıcaklığa ulaşmasını bekleyin.
       NOT: Mikrodizi görüntüsünü renklendirme işleminden hemen sonra okumak için, bu aşamada tarayıcıyı açın.
   31. Şimdi 250 μL Üstün İki Renkli Master Mix (STM) dağıtın, ardından 10 dakikalık bir inkübasyon yapın.
   32. Ardından, 450 μL Leke Çözeltisi 3 (XC3) dağıtın, ardından 1 dakikalık inkübasyon uygulayın. 1x'i tekrarlayın.
   33. 5 dakika bekleyin ve ardından 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) ekleyin ve 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
   34. Şimdi 250 μL Üstün İki Renkli Master Mix (STM) dağıtın, ardından 10 dakikalık bir inkübasyon yapın.
   35. Ardından, 450 μL Leke Çözeltisi 3 (XC3) dağıtın, ardından 1 dakikalık inkübasyon uygulayın. 1x'i tekrarlayın.
   36. 5 dakika bekleyin.
   37. 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) ekleyin ve 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
   38. 450 μL Leke Mikroarray Çözeltisi 3 (XC3) ekleyin ve 1 dakika kuluçkaya yatırın, ardından tekrar tekrarlayın.
   39. 5 dakika bekleyin.
       NOT: Aşağıdaki tekrarlama şemasını yapın: Adım 6.4.34., Adım 6.4.35. ve Adım 6.4.36.; Adım 6.4.37., 6.4.38. ve Adım 6.4.39.; Adım 6.4.34., Adım 6.4.35. ve Adım 6.4.36.
   40. Şimdi, akış odalarını derhal raftan çıkarın ve laboratuvar tezgahına yatay olarak dikkatlice yerleştirin. Sıcaklığın ortam olduğundan emin olun.
   41. 6.4.41.Her mikroarray için 310 mL Yıkama Çözeltisi (PB1) bir yıkama kabına yerleştirin.
   42. Metal kelepçeleri ve camı ve son olarak mikrodiziyi çıkarın.
   43. Mikrodizileri bir boyama rafına yerleştirin ve 10x PB1 çözeltisi içeren yıkama kabına yerleştirin. Barkodların, onları kullanan kişiden uzağa baktığından ve tüm mikro dizilerin suya batırıldığından emin olun.
   44. 10x yukarı ve aşağı hareketlerle yavaş ve hafif hareket edin. Mikrodizi, tekrar suya batırılmadan önce çözeltiden tamamen çıkarılmalıdır. Ardından, 5 dakika boyunca su altında kalmasına izin verin.
   45. Tam süspansiyon sağlamak için Leke Çözeltisi 4 (XC4) reaktifini kuvvetlice sallayın. 310 mL XC4'ü bir yıkama kabına koyun.
       NOT: Solüsyonun yıkama kabında 10 dakikadan fazla bekletmeyin.
   46. Boyama standını XC4 ile diğer kaba hafifçe taşıyın.
   47. 10x yukarı ve aşağı hareketlerle yavaş ve hafif hareket edin. Mikrodizinin tekrar suya batırılmadan önce çözeltiden tamamen çıkarıldığından emin olun.
   48. Ardından, mikrodizinin 5 dakika boyunca su altında kalmasına izin verin.
   49. Boyama standını çözeltinin dışına taşıyın ve barkodlar yukarı bakacak şekilde bir tüp tutucuya yerleştirin.
   50. Kilitleme forseps kullanarak mikrodiziyi dikkatlice çıkarın ve kuruması için bir rafa yerleştirin.
   51. Vakumlu kurutucuyu kullanarak 675 mm Hg'de (0,9 bar) 50-55 dakika kurutun.
   52. EtOH kullanarak her mikrodizinin arkasını temizleyin.
       DİKKAT: Çizgilere dokunmaktan kaçının ve EtOH'nin çizgilere hiçbir şekilde damlamasına izin vermeyin.
   53. Mikrodiziyi görüntülemeye devam edin.
   54. Mikrodiziyi oda sıcaklığında bir saklama kutusunda dikkatlice saklayın.
       NOT: Mikroarray görüntüleri 72 saat içinde çekilmelidir.

7. Biyoinformatik analizi

NOT: Mikroarray türünün bazı özniteliklerinin değiştirilmesi gerekir (örneğin; arraytype = "450k", arraytype = "EPIC" ile değiştirilmelidir). ChAMP işlem hattının yazarı, paketin Bioconductor sayfasındaki dizileri analiz etmek için değiştirilmesi gereken tüm alanları ayrıntılı olarak ^açıklar30.

1. Örnek sayfa
   1. Biyoinformatik analizine devam etmek için IDAT dosyalarını bilgisayara ^aktarın31. Veri analizini gerçekleştirmek için bir örnek sayfa ^oluşturun31.
      NOT: Bu elektronik tablo dosyası için üç sütun gereklidir. Birincisi Sample_name. Bu sütun, örnekleri tanımlamak için kullanılan adları veya kodları içermelidir. İkincisi Sentrix_position. Bu sütun, örneklerin karşılık gelen R01C01'ini yerleştirir, R01 çip satırından sorumludur ve sütun C01 olarak adlandırılır. Üçüncü temel sütun Sentrix_ID ve mikrodiziyi tanımlayan sayıyı almaktan sorumludur. Doğru sayıları koyduğunuzdan emin olun. Örnek sayfaya değişken değerler olarak başka bilgiler eklemek mümkündür. Bu deneyde, metal analizinden elde edilen veriler dahil edilmiştir.
2. ChAMP boru hattı
   1. Analizi gerçekleştirmek için RStudio'yu (V.4.0.2) bilgisayara ^yükleyin30.
      NOT: Bilgisayarda en az 8 G RAM bulunduğundan emin olun. Veri analizi, daha düşük miktarda RAM ile mücadele edecek veya çökecektir.
   2. Kurulumdan sonra, RStudio'yu açın ve ilgili komut satırını kullanarak ChAMP Bioconductor ^paketini30 takın (bkz. Ek Malzeme 1).
      NOT: Yüklemenin sonunda herhangi bir hata oluşursa, gerekli ChAMP kitaplıklarını el ile, tek ^tek26 yükleyin.
   3. Şimdi, ham verileri içe aktarın ve analizi gerçekleştirin. Bkz. Ek Materyal 1.
      champ.load(), düşük algılama pvaline sahip problar, çoklu isabetli bölgeler, CG olmayan problar, SNP'lere yakın CpG bölgeleri ve cinsel kromozomlarda bulunan CpG'ler hariç, ham verileri içe aktarır ve filtreleme işlemini yapar.
      champ.impute(), varsayılan olarak KNN atama işlemini gerçekleştirir.
      Şampiyon. QC , veri kalitesi grafiklerini alır (örneğin, yoğunluk grafiği).
      Şampiyon. SVD , toplu iş etkilerini örnek sayfada sağlanan meta verilere göre değerlendirir.
      champ.refbase() hücre tipi tahmini ve düzeltmesi gerçekleştirir.
      Şampiyon. DMP( ), Ek Materyal 1'de gösterildiği gibi, gruplar arasındaki DNA metilasyonunu kontrol etmek ve parametreleri değiştirmek için farklı metillenmiş pozisyonları ve yağ kütlesi gibi özellik ilişkilerini alır.
3. Zenginleştirme (String DB)
   NOT: İşlevsel zenginleştirme, bir dizi genin biyolojik işlevlerini çıkarmak için kullanılır.
   1. Bir dizedeki verileri zenginleştirmek için, zenginleştirilecek ve giriş olarak kullanılacak hedeflerin listesini seçin: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
   2. Organizma için, homo sapiens'i seçin ve Ara düğmesine basın.
   3. Zenginleştirmede gezinmek için Analiz düğmesine tıklayın.
4. GEO gönderimi
   1. Verileri NCBI'nin GEO gibi genel bir depoya yatırın. Bunun için gönderen hesabına kaydolun.
      NOT: Genel deney ve bireysel örnekler için açıklayıcı bilgiler ve protokoller içeren meta veri sayfasını indirerek GEO gönderimini (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) tamamlayın. GEO arşiv gönderimleri herhangi bir elektronik tablo yazılımında oluşturulabilir. İkinci olarak, tüm kitaplıklar için hücre korucusu sayım betiğinden oluşturulan ham veri dosyasını dizine ekleyin. IDAT ve ilişkili dosyalar veya matris çalışma sayfası normalleştirilmemiş veriler içerir. Üçüncü klasör, işlenen veri dosyalarıdır. Matris tablosu, satırlar ve örnekler arasında karşılaştırılabilir son, normalleştirilmiş değerleri içeren ve tercihen beraberindeki herhangi bir makalede açıklandığı gibi işlenen bir elektronik tablodur.
   2. Tüm kitaplıklar için hücre aralıkçısı sayım komut dosyasından oluşturulan işlenmiş veri dosyalarını dizine yerleştirin. Üç bileşenin tümünü içeren dizini aktarmak için GEO göndericisinin FTP sunucusu kimlik bilgilerini kullanın.

Sonuçlar

ChAMP boru hattını kullandıktan sonra, tüm filtrelerden sonra analizde 409.887 prob dikkate alınmıştır (niteliksiz CpG'ler, CG olmayan problar, SNP'lerin yakınındaki CpG'ler, çoklu isabetli siteler ve XY ile ilgili CpG'ler); bir şema Şekil 2'de gösterilmiştir.

Şekil 2: Biyoinformatik analizinin boru hattı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ayrıca, yoğunluk grafiği, tüm numunelerin kalite kontrol adımlarıyla ilgili beta dağılımının benzer yoğunluklarına sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu analiz, beta değerlerinin dağılımını değerlendirir ve hariç tutulması gereken herhangi bir örnek olup olmadığına işaret eder. Bu partide, bu analize dayanarak hiçbir örnek hariç tutulmamıştır.

Şekil 3: ChAMP paketi ile elde edilen beta değerleri yoğunluk grafiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tekil değer ayrışması (SVD) analizi, DNA metilasyon verilerinin değişkenliğini önemli ölçüde etkileyen ana bileşenleri doğrulamak için kullanıldı. Veriler VKİ, WC (p < 1e10-5) ve FM'nin (p < 0.05) veri değişkenliği üzerinde anlamlı bir etkiye sahip olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 4).

Şekil 4: Tekil değer ayrışma analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre tipi tahmini, obez kadınlarda hem doğal öldürücü hücrelerin (NK) hem de B hücrelerinin daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 5).

Şekil 5: Houseman'ın yöntemiyle tahmin edilen hücre fraksiyonları. Gran: granülosit. CD4T: yardımcı T hücresi, lenfosit. CD8T: sitotoksik T hücresi, lenfosit. Mono: monosit. B Hücresi: B lenfosit. NK: doğal öldürücü hücreler, lenfositler. *p 0,05 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Obez ve obez olmayan kadınlar arasındaki DNA metilasyon seviyeleri, hücre tipi düzeltmeden önce ve sonra farklılık gösterdi. Hücre tipleri için DNA metilasyon verilerinin düzeltilmesinden önce, 43.463 diferansiyel metillenmiş pozisyon (DMP) gözlendi ve 3.329 CpG daha sonra anlamlı kaldı. 445 CpG bölgesi intergenik bölgelerde (IGR) ve 2.884'ü jenik bölgelerde, çoğu promotör bölgede (n = 1.438) idi. Tüm bölgeler boyunca dağılım TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), ilk ekzon (n = 273), gövde (n = 724) ve 3'UTR (n = 59) idi. Δβ değerleri <-0.05 ve >0.05 dikkate alındığında, obez olmayan bireylere kıyasla 162 CpG hipometilasyona ve 576 CpG'ye hipermetilasyon uygulanmıştır (Şekil 6). Veriler GEO veritabanında GSE166611 kayıt kodu altında mevcuttur.

Şekil 6: Diferansiyel metillenmiş pozisyonlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gruplar arasındaki farklı metilasyonu değerlendirmek ve metilasyon çalışmalarında spesifik özelliklerle ilişkili CpG bölgelerini bulmak mümkündür. Yağ kütlesi çalışmaları için 13.222 CpG bölgesi bulundu. Promotör bölgedeki 6.159 CpG, 470 hipermetillenmiş ve 94 hipometillenmiş yağ kütlesi ile ilişkiliydi (Şekil 7) ve ilgili genler zenginleştirildi (Tablo 2).

Şekil 7: Hipometillenmiş ve hipermetillenmiş genlerin yağ kütlesi ile bağımsız olarak ilişkili promoter bölgeleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Diferansiyel metillenmiş CpG bölgelerinden genlerin fonksiyonel olarak zenginleştirilmesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Materyal 1: Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

DNA metilasyon dizileri, maliyet-fayda oranları nedeniyle DNA metilasyonuna erişmek için en çok kullanılan ^{yöntemlerdir14}. Bu çalışma, Brezilyalı bir kohortta gerçekleştirilen bir pilot çalışmada DNA metilasyonunu değerlendirmek için ticari olarak temin edilebilen bir mikroarray platformu kullanan ayrıntılı bir protokolü tanımlamıştır. Pilot çalışmadan elde edilen sonuçlar, protokolün etkinliğini doğruladı. Şekil 3 , numune karşılaştırılabilirliğini ve tam bisülfit dönüşümünü ^{göstermektedir32}.

Bir kalite kontrol adımı olarak ChAMP algoritması, filtreleme işlemi sırasında CpGs sitelerinin hariç tutulmasını önerdi. Probları hariç tutmanın amacı, veri analizini geliştirmek ve önyargıyı ortadan kaldırmaktır. Veri kümesindeki deneysel gürültüyü ortadan kaldırmak için düşük kaliteli CpG'ler (0,05'ten düşük p-değerleri) kaldırıldı. Hedefler yoğunluk grafiği analizinde geçilmeye devam etti. Zhou33, uyumsuzlukları, polimorfik sitozinlerin metilasyonunun yanlış yorumlanmasını ve tip I prob tasarımının anahtar rengine neden olmasını önlemek için SNP'lerin yakınında CpG'lerin filtrelenmesinin önemini ^{açıkladı34}. Ayrıca, XY kromozomları baskıdan farklı şekilde etkilendiğinden, Heiss ve Just35 bu probların filtrelenmesinin önemini güçlendirdi, çünkü kadınlarda hibridizasyon ile ilgili sorunlar kafa karıştırıcı faktörler ^olabilir35.

DMAP'lerin son kullanma tarihi, formamid açılış tarihi, mutlak etanolün analitik kalitesi ve toplam lökosit sayıları protokolde kritik adımlar olarak kabul edilir.

Ayrıca, gözlemlerimize göre, hücre tipi tahmini, biyoinformatik analizin gerçekleştirilmesinde esastır. Houseman yöntemi, Tian'ın çalışmasında açıklandığı gibi hücre tipi tahminini ^{gerçekleştirir30}. Bu yöntem, granülositler, monositler, B hücreleri ve T hücreleri gibi en önemli hücre tiplerinin yüzdelerini tahmin edebilen 473 spesifik CpG bölgesine ^{dayanmaktadır36}. ChAMP paketinden önerilen "myRefbase" işlevini kullandık. Tahminden sonra, ChAMP algoritması beta değerlerini ayarlar ve bu önyargıyı veri kümesinden kaldırır. Bu adım, obeziteye odaklanan çalışmalarda çok önemlidir, çünkü bu popülasyonun kronik enflamatuar durumları nedeniyle beyaz kan hücrelerinde önemli bir farkı vardır.

Ortak PCR mührünün orijinal kapak haritasını yalnızca yöntem modifikasyonu ve sorun giderme ile değiştirdik. Her santrifüjleme işleminden sonra, conta yenisi için değiştirildi. Standart ısı sızdırmazlığını kullanamadık ve plakanın etrafındaki alüminyum folyo kullanarak uyarladık.

Ticari tahliller epigenetik çalışmalar için altın standart olarak kabul edilmesine rağmen, protokolün bir sınırlaması, benzersiz bir markadan reaktiflerin ve ekipmanın özgüllüğü olabilir37,38,39,40. Diğer bir sınırlama, deneyin doğru ilerlemesinin belirlenmesine izin veren göstergelerin ^{eksikliğidir41}.

Mevcut protokolün standardizasyonu, epigenetik araştırmalar için harika bir rehber teşkil eder, süreç boyunca insan hatalarını azaltır ve başarılı veri analizi ve farklı çalışmalar arasında karşılaştırılabilirlik sağlar.

Sonuçlarımıza göre, DNA metilasyon deneyleri, obezitesi olan ve olmayan bireyleri karşılaştıran çalışmalar için ^uygundur43. Ayrıca, önerilen biyoinformatik analiz yüksek kaliteli veriler sağladı ve büyük ölçekli çalışmalarda dikkate alınabilir.

SVD analizini kullanarak, obezite ile ilişkili özelliklerin (BMI, WC ve FM) DNA metilasyon verilerindeki değişkenliği etkilediğini belirledik. Anlamlı bir sonuç olarak, hücre tipi tahmini, hem doğal öldürücü hücrelerin (NK) hem de B hücrelerinin obezitesi olan kadınlarda obezitesi olmayan kadınlara göre daha yüksek olduğunu göstermektedir (Şekil 5). Bu hücrelerin daha yüksek sayımları, bu bireylerin düşük dereceli enflamatuar durumu ile ^{açıklanabilir44}. Obeziteli hastaların yağ kütlesi ile ilişkili genlerin promotör bölgelerinde hipo- ve hipermetillenmiş CpG'lere sahip olduklarını gözlemledik. Bölgelerin çoğu hipometilasyona uğradı, bu da bu bireylerdeki reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerindeki doğal artışla ilişkili olabilir. Bu oksidatif stres durumu, dinükleotid bölgesinde guanin perturbanzını teşvik edebilir, 8-hidroksi-2'-deoksiguanozin (8-OHdG) oluşturabilir, 5mCp-8-OHdG dinükleotid bölgesi ile sonuçlanır ve TET enzimlerinin işe alınmasına neden olur. Tüm bu olaylar, DNA hipometilasyonunu ve hipermetilasyonunu farklı etki mekanizmalarıyla teşvik etmekten sorumlu ^olabilir45.

Ek olarak, obezitesi olan bireylerde adipogenez oranının arttığı, yeni hücrelerin yaklaşık% 10'unun eski hücrelere olduğu ^{görülmektedir46,47}. Obezojenik ortamı vurgulayan epigenetik katkılar, hücrelerin çoğalma ve farklılaşma oranlarını değiştirebilir ve yağ kütlesinin gelişimini ^{destekleyebilir48}. Epigenetik değişiklikler ayrıca adipojenik programları etkileyebilir, gelişimlerini kolaylaştırabilir veya kısıtlayabilir. Birincil transkripsiyon faktörleri (PPARγ veya C / EBPa) veya epigenetik modifiye edici enzimleri dahil ederek veya hariç tutarak çalıştırılan aşağı akış promotör bölgelerinde konumlandırılmış multiprotein komplekslerinin montajı, hiper veya hipometilasyon yoluyla gen ekspresyonunu ^düzenler45. PPARγ yolu, bu çalışmada zenginleştirilmiş genlere sahip olan WNT yolunu değiştirmek için daha önce tanımlanmıştır. WNT sinyallemesinin adipogenez sırasında nasıl gerçekleştiği hala bilinmemekle birlikte, son çalışmalar özellikle obezojenik koşullar altında adiposit metabolizmasında önemli rollere sahip olabileceğini ^{bildirmiştir49}.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mutlak etanol	JT Baker	B5924-03
Agaroz jel	Kasvi	K9-9100
Elektrikli biyoempedans	Quantum BIA 450 Q - RJL Sistemi
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Corning	46-000-CI
EZ DNA Metilasyon-Altın kiti	ZymoResearch, Irvine, CA, ABD	D5001
Formamid	Sigma	F9037
FMS ve mdash; Parçalanma çözeltisi	Illumina	11203428	Sağlanan Reaktifler
HumanMethylation450 BeadChip	Illumina
Maxwell Instrument	Promega, Brezilya	AS4500
MA1 & Çoklu Örnek Amplifikasyonu 1 Karışım	Illumina	11202880	Sağlanan Reaktifler
MicroAmp Optik Yapışkan Film	Thermo Fisher Scientific	201703982
MSM— Çoklu Örnek Amplifikasyonu Master Mix	Illumina	11203410	Sağlanan Reaktifler
NaOH	F. MAIA	114700
PB1— BeadChips'i hibridizasyon için hazırlamak için kullanılan reaktif	Illumina	11291245	Sağlanan Reaktifler
PB2— Hibridizasyon sırasında kullanılan nemlendirme tamponu	Illumina	11191130	Sağlanan Reaktifler
2-propanol	Emsure	10,96,34,01,000
RA1— Süspansiyon, hibridizasyon ve yıkama çözeltisi	Illumina	11292441	Sağlanan Reaktifler
RPM & mdash; Rastgele Primer Karışımı	Illumina	15010230	Sağlanan Reaktifler
STM & mdash; Üstün İki Renkli Master Mix	Illumina 11288046		Sağlanan Reaktifler
TEM & mdash; İki Renkli Uzatma Master	Mix Illumina	11208309	Sağlanan Reaktifler
Ultrasaf EDTA	Invitrogen	155576-028
	Barkodlu 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası (0.1mL)Barkodlu 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası (0.8mL	ByoSystems
Barkodlu 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası (0.8mL)	Thermo Fisher Scientific	AB-0859
XC1— XStain BeadChip çözümü 1	Illumina	11208288	Sağlanan Reaktifler
XC2— XStain BeadChip çözümü 2	Illumina	11208296	Sağlanan Reaktifler
XC3— XStain BeadChip çözümü 3	Illumina	11208392	Sağlanan Reaktifler
XC4— XStain BeadChip çözümü 4	Illumina	11208430	Sağlanan Reaktifler