Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation

4.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62621

⸱

30 Haziran 2021

 ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale, sakkaroz yoğunluğu gradyan ultracentrifugation kullanarak memeli hücrelerinden geri dönüşüm endozomlarının hazırlanması için bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.

Özet

Endosomal kaçakçılık, çok çeşitli biyolojik olayları düzenleyen önemli bir hücresel süreçtir. Proteinler plazma zarından içselleştirilir ve daha sonra erken endozomlara taşınır. İçselleştirilmiş proteinler bozulma için lizozomlara iletilebilir veya plazma zarı geri dönüştürülebilir. Membran malzemelerinin endositozdan uzaklaştırılmasını dengelemek için sağlam bir endositotik geri dönüşüm yolu gereklidir. ADP-ribosilasyon faktörü 6 (ARF6) dahil olmak üzere çeşitli proteinlerin yolu düzenlediği bildirilmektedir. Yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme hücre fraksiyonasyonu için klasik bir yöntemdir. Santrifüjlemeden sonra organeller izopik yüzeylerine çökeltilir. Kesirler toplanır ve diğer aşağı akış uygulamaları için kullanılır. Burada, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjasyonunu kullanarak transfected memeli hücrelerinden geri dönüşüm endozom içeren bir fraksiyon elde etmek için bir protokol açıklanmıştır. İzole fraksiyonlar, protein içeriklerini analiz etmek için standart Batı şişkinliğine maruz kaldı. Bu yöntemi kullanarak, Ras ile ilişkili bir C3 botulinum toksin substratı 1 (Rac1) guanin nükleotid değişim faktörü olan yutkunma ve hücre hareketliliği 1 'in (ELMO1) plazma zarının hedeflenmesinde ARF6 aracılı endosit geri dönüşümünden geçtiğini belirledik.

Giriş

Endosomal kaçakçılık, çeşitli biyolojik olayları bulaştıran temel bir fizyolojik süreçtir1, örneğin, sinyal reseptörlerinin, iyon kanallarının ve yapışma moleküllerinin taşınması. Plazma membranda lokalize proteinler endositoz ile içselleştirilir2. İçselleştirilmiş proteinler daha sonra erken endozom3ile sıralanır. Bazı proteinler bozulma için lizozomlara yöneliktir4. Bununla birlikte, hızlı geri dönüşüm ve yavaş geri dönüşüm işlemleri ile önemli miktarda protein hücre yüzeyine geri dönüştürülmektedir. Hızlı geri dönüşümde proteinler erken endozomları bırakır ve doğrudan plazma zarlarına geri döner. Tersine, yavaş geri dönüşümde proteinler önce endosit geri dönüşüm bölmesine sıralanır ve daha sonra plazma zarı ile geri taşınır. Clathrin, retromer kompleksi, retriever kompleksi ve Wiskott-Aldrich sendromu proteini ve SCAR Homologue (WASH) kompleksi gibi çeşitli kargo proteinleri, bu tür membran geri dönüşümsüreçlerine katılır 4,5,6,7 ,8,9. Endositoz ve geri dönüşüm olayının dengesi hücre sağkalımı için çok önemlidir ve çeşitli hücresel olaylara katkıda bulunur10, örneğin, hücre yapıştırma, hücre göçü, hücre polaritesi ve sinyal transdüksiyon.

Küçük bir GTPase olan ARF6, endosit kaçakçılığı7, 11,12'nin bildirilen bir düzenleyicisi. İlgi çekici olan, çeşitli araştırma grupları ARF6'nın endosit geri dönüşümünde önemini göstermiş13,14,15,16,17. Çalışma, ARF6 aracılı neurit büyümesi ve endosit geri dönüşümü arasındaki ilişkiyi araştırmayı amaçlamaktadır. Önceki rapor, ARF6'nın aktivasyonunun, sitokinoz 1 (DOCK180) kompleksi 18'in ELMO1-ayırıcısına göre hareketederekRac1 etkinliğine kadar olduğunu göstermektedir. Ancak ARF6'nın ELMO1-DOCK180 aracılı Rac1 sinyalini nasıl tetiklediği belirsizliğini koruyor. Arf6 aracılı endosit geri dönüşümün bu süreçteki rolünü araştırmak için yoğunluk gradyan ultracentrifugation kullanıldı. Bunu kullanarak, geri dönüşüm endozom içeren fraksiyon hücre lizatları19elde edildi. Fraksiyon protein içeriği analizi için Batı şişkinliğine maruz kaldı. İmmünoblot sonuçları, beyin bakımından zenginleştirilmiş bir adaptör proteini olan FE65'in varlığı altında, aktif ARF6'nın geri dönüşüm endozom içeren fraksiyonda ELMO1 seviyesini önemli ölçüde artırdığını ortaya koydu. Aşağıdaki protokol, (1) memeli hücrelerinin transfecting prosedürlerini içerir; (2) örneklerin ve yoğunluk degrade sütunlarının hazırlanması; ve (3) geri dönüşüm endozom içeren fraksiyonu elde etmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Memeli hücre kültürü ve transfeksiyon

  1. Plaka 2 x 106 hücre 100 mm kültür çanasında. Her transfection için dört yemek kullanın.
    NOT: Gerekli hücre sayısı farklı hücre hatları için değişebilir. İzolasyon adımına geçmeden önce optimizasyon gerekebilir.
  2. Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre hücreleri Lipofectamine ile transfect.

2. Hücre hasadı

  1. Kültür ortamını 48 saat post-transfection atın.
  2. Hücreleri buz gibi PBS (10 mM sodyum fosfat, 2,68 mM potasyum klorür, 140 mM sodyum klorür) ile iki kez yıkayın.
  3. Her yemeğe 1 mL buz gibi PBS+ (0,5x proteaz inhibitörü kokteyli ve 0,5x fosfataz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş PBS) ekleyin.
  4. Hücreleri bir hücre kazıyıcı ile toplayın ve hücre süspansiyonu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
  5. 5 dakika boyunca 400 x g'da bir salıncak kova rotor kullanarak hücreleri santrifüjleme ile pelet.
  6. Süpernatantı atın ve hücre peletini 5 mL homojenizasyon tamponunda (HB; 250 mM sakkaroz, pH 7.4'te 3 mM imidazol, 0.03 mM sikloeximid, 1x proteaz inhibitörü kokteyli ve 1x fosfataz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş 1 mM EDTA).
  7. Hücreleri 10 dakika boyunca 1.300 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
  8. Hücre peletini 1 mL HB'de yeniden kullanın.
  9. Hücreleri 15-20 vuruş için bir Dounce homojenizatör ile homojenize edin.
    NOT: Örneğin, örneği bir şırınnadan geçirmek gibi diğer homojenizasyon yöntemleri kullanılabilir. Homojenizasyon verimliliği, homojenatın faz kontrastlı bir mikroskop altında gözlemlenmesiyle ortaya çıkabilir.
  10. Homojenatı 2 mL santrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: 50 μL homojenatı 12,5 μL 5x numune tamponu ile hasat edin ve toplam lysate olarak etiketleyin.
  11. Homojeneye 0,7 mL HB ekleyin.
  12. Seyreltilmiş homojenatı 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün.
    NOT: Pelet çekirdek ve kırılmamış hücreler içerir.
  13. Süpernatant 1,5 mL toplayın ve 2,12 adımını bir kez yineleyin.
  14. Süpernatanttan 1,4 mL toplayın ve nükleer sonrası süpernatant (PNS) olarak etiketleyin.

3. Yoğunluk gradyan kolon hazırlama

  1. 1,2 mL PNS'yi ultracentrifuge tüpüne aktarın.
  2. Numuneye 1 mL% 62 sakkaroz çözeltisi (2.351 M sakkaroz, pH 7.4'te 3 mM imidazol) ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın.
    NOT: Eldeki çözüm% 40,6 sakkaroz çözeltisidir.
  3. Numunenin üzerine dikkatlice %35 sakkaroz çözeltisinin (1.177 M sakkaroz, pH 7.4'te 3 mM imidazol) 3.3 mL'sini ekleyin.
  4. %35 sakkaroz çözeltisinin üzerine 2,2 mL%25 sakkaroz çözeltisi (0,806 M sakkaroz, pH 7,4'te 3 mM imidazol) dikkatlice ekleyin.
    NOT: Oda sıcaklığındaki %62, %40,6, %35 ve %25 sakkaroz çözeltilerinin kırılma indisi sırasıyla 1,44, 1,40, 1,39 ve 1,37'dir. Sakkaroz çözeltilerinin kırılma indeksleri, deneyin hassasiyetini ve tutarlılığını sağlamak için bir refraktometre ile kontrol edilebilir.
  5. Ultracentrifugation tüpünü HB ile doldurun.
    NOT: Hazırlanan yoğunluk degrade sütununu geçici olarak 4 °C'de saklayın.

4. Geri dönüşüm endozom içeren fraksiyonun fraksiyonasyonu ve geri kazanımı

  1. Sütunu 4 °C'de 3 saat boyunca 210.000 x g'da santrifüj edin.
  2. Degradenin üstünden başlayarak 12 kesir (her biri 1 mL) dikkatlice toplayın.
    NOT: Geri dönüşüm endozomları arayüzde %35 ile %25 sakkaroz çözeltileri arasında bulunmalıdır. Toplanan fraksiyonlar sıvı nitrojen içinde çıtlatılabilir ve -80 °C'de saklanabilir.
  3. Tüm fraksiyonları 1 mL seyreltme tamponu ile seyreltin (pH 7.4'te 3 mM imidazol, 1 mM EDTA).
  4. Seyreltilmiş numuneyi 100.000 x g'da 4 °C'de 1 saat boyunca santrifüj edin.
  5. Süpernatantı aspire edin ve fraksiyonları toplamak için 50 μL 1x numune tamponu ekleyin.
  6. Fraksiyonlardaki protein içeriğini batı şişkinliği ile analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İletilmemiş HEK293 hücrelerini yoğunluk gradyan ultrasantrifüjasyonu ile kesirlendikten sonra, degradenin üstünden başlayarak 12 fraksiyon toplandı. Hasat edilen fraksiyonlar seyreltme tamponu ile 1:1 oranında seyreltildi ve ikinci bir santrifüjleme turuna tabi tutuldu. Numuneler daha sonra protein içeriklerini analiz etmek için batı şişkinliğine maruz kaldı. Şekil 1'degösterildiği gibi, geri dönüşüm endozom işaretçisi Rab11 kesir 720'detespit edilir. β-COP, COX IV, G...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yukarıdaki protokol, kültürlü hücrelerden geri dönüşüm endozomlarını ultracentrifugation ile izole etme prosedürlerini özetlemektedir. Bu yöntemin güvenilirliği en son yayınla gösterilmiştir 22 Geri dönüşüm endozomlarının Golgi aparatı ve mitokondri gibi diğer organellerdenbaşarıylaizole edildiğini kanıtlayan22. İyi bir ayrılık sonucu elde etmek için bazı kritik adımlara dikkat edilmesi gerekir. Sakkaroz çözeltileri hazırlanırken, çözeltilerin kırılma indekslerinin bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu makalenin içeriği ile herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Araştırma Hibeleri Konseyi Hong Kong, CUHK doğrudan hibe programı, United College bağış fonu ve TUYF Hayır Kurumu'ndan fonlarla desteklendi. Bu çalışmadaki rakamlar, Ekim 2020'de FASEB Dergisi'nde yayınlanan "ARF6-Rac1 sinyal aracılı neurit büyümesi, nöronal adaptör FE65 tarafından ARF6 ve ELMO1'i düzenleyerek güçlenmiştir" adlı önceki yayınımızdan uyarlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL, Üstü Açık Kalın Duvar Polipropilen Tüp, 11 x 34 mmBeckman Coulter347287
100 mm doku kültürü kabıSPL20100
13,2 mL, Sertifikalı Ücretsiz Üstü Açık İnce Duvar Ultra Şeffaf Tüp, 14 x 89 mmBeckman CoulterC14277
5x Örnek TamponuGenScriptMB01015
cOmplete, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitör KokteyliRoche11873580001
COX IV (3E11) Tavşan mAbHücre Sinyal Teknolojisi4850SCOX IV'ü tespit etmek için tavşan monoklonal antikoru.
SikloheksimidSigma-AldrichC1988
Dounce Doku Öğütücü, 7 mLDWK Yaşam Bilimleri357542
Dulbecco'nun düşük glikozlu Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) HyCloneSH30021.01
ELMO1 antikoru (B-7)Santa Cruz BiyoteknolojiSC-271519ELMO1'i tespit etmek için fare monoklonal antikoru.
EndoFree Plazmid Maxi KitiQIAGEN12362
FE65 antikoru (E-20)Santa Cruz BiotechnologySC-19751FE65'i tespit etmek için keçi poliklonal antikoru.
Fetal Sığır Serumu, Araştırma SınıfıHyCloneSV30160.03
GAPDH Monoklonal Antikor (6C5)AmbionAM4300GAPDH'yi tespit etmek için fare monoklonal antikoru.
ImageLab YazılımıBio-RadBant yoğunluğunun ölçümü
İmidazolSigma-AldrichI2399
Lipofektamin 2000 Transfeksiyon ReaktifiInvitrogen11668019
Monoklonal Anti-β-COP antikoruSigmaG6160β-COP'u tespit etmek için fare monoklonal antikoru.
Myc-tag (9B11) fare mAbHücre Sinyal Teknolojisi2276SMyc etiketli proteinleri tespit etmek için fare monoklonal antikoru.
OmniPur EDTA, Disodyum Tuzu, DihidratCalbiochem4010-OP
Optima L-100 XPBeckman Coulter392050
Optima MAX-TLBeckman CoulterA95761
Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıGibco31985070
PhosSTOPRoche
RAB11A-Spesifik Poliklonal antikorProteintech20229-1-APRab11'i tespit etmek için tavşan poliklonal antikoru.
SucroseAffymetrixAAJ21931A4
SW 41 Ti Sallanan Kovalı RotorBeckman Coulter331362
TLA-120.2 Sabit Açılı RotorBeckman Coulter362046
Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızısıGibco25300062
PBS Tabletleri Gibco 18912014 4906845001

Kaynaklar

  1. Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
  2. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
  3. Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
  4. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
  5. Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
  6. Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
  7. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  8. Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
  9. McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
  10. O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074(2020).
  11. D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
  12. Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
  13. Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
  14. Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
  15. Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471(2019).
  16. Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
  17. Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074(2020).
  18. Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
  19. Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
  20. Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
  21. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  22. Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
  23. Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
  24. Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
  25. Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
  26. Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
  27. Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
  28. Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
  29. Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
  30. Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
  31. Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
  32. Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
  33. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
  34. Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Endozomal TrafikGeri D n m EndozomlarH cre FraksiyonlamaWestern BlottingARF6 Reg lasyonuRab11 Mark rProtein Trafi i
Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.