Bu makale, sakkaroz yoğunluğu gradyan ultracentrifugation kullanarak memeli hücrelerinden geri dönüşüm endozomlarının hazırlanması için bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Endosomal kaçakçılık, çok çeşitli biyolojik olayları düzenleyen önemli bir hücresel süreçtir. Proteinler plazma zarından içselleştirilir ve daha sonra erken endozomlara taşınır. İçselleştirilmiş proteinler bozulma için lizozomlara iletilebilir veya plazma zarı geri dönüştürülebilir. Membran malzemelerinin endositozdan uzaklaştırılmasını dengelemek için sağlam bir endositotik geri dönüşüm yolu gereklidir. ADP-ribosilasyon faktörü 6 (ARF6) dahil olmak üzere çeşitli proteinlerin yolu düzenlediği bildirilmektedir. Yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme hücre fraksiyonasyonu için klasik bir yöntemdir. Santrifüjlemeden sonra organeller izopik yüzeylerine çökeltilir. Kesirler toplanır ve diğer aşağı akış uygulamaları için kullanılır. Burada, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjasyonunu kullanarak transfected memeli hücrelerinden geri dönüşüm endozom içeren bir fraksiyon elde etmek için bir protokol açıklanmıştır. İzole fraksiyonlar, protein içeriklerini analiz etmek için standart Batı şişkinliğine maruz kaldı. Bu yöntemi kullanarak, Ras ile ilişkili bir C3 botulinum toksin substratı 1 (Rac1) guanin nükleotid değişim faktörü olan yutkunma ve hücre hareketliliği 1 'in (ELMO1) plazma zarının hedeflenmesinde ARF6 aracılı endosit geri dönüşümünden geçtiğini belirledik.
Giriş
Endosomal kaçakçılık, çeşitli biyolojik olayları bulaştıran temel bir fizyolojik süreçtir1, örneğin, sinyal reseptörlerinin, iyon kanallarının ve yapışma moleküllerinin taşınması. Plazma membranda lokalize proteinler endositoz ile içselleştirilir2. İçselleştirilmiş proteinler daha sonra erken endozom3ile sıralanır. Bazı proteinler bozulma için lizozomlara yöneliktir4. Bununla birlikte, hızlı geri dönüşüm ve yavaş geri dönüşüm işlemleri ile önemli miktarda protein hücre yüzeyine geri dönüştürülmektedir. Hızlı geri dönüşümde proteinler erken endozomları bırakır ve doğrudan pl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Memeli hücre kültürü ve transfeksiyon
- Plaka 2 x 106 hücre 100 mm kültür çanasında. Her transfection için dört yemek kullanın.
NOT: Gerekli hücre sayısı farklı hücre hatları için değişebilir. İzolasyon adımına geçmeden önce optimizasyon gerekebilir. - Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre hücreleri Lipofectamine ile transfect.
2. Hücre hasadı
- Kültür ortamını 48 saat post-transfection atın.
- Hücreleri buz gibi PBS (10 mM sodyum fosfat, 2,68 mM potasyum klorür, 140 mM sodyum klorür) ile iki kez yıkayın.
- Her yemeğe 1 mL buz gibi PBS+ (0,5x proteaz inhibitörü ko....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İletilmemiş HEK293 hücrelerini yoğunluk gradyan ultrasantrifüjasyonu ile kesirlendikten sonra, degradenin üstünden başlayarak 12 fraksiyon toplandı. Hasat edilen fraksiyonlar seyreltme tamponu ile 1:1 oranında seyreltildi ve ikinci bir santrifüjleme turuna tabi tutuldu. Numuneler daha sonra protein içeriklerini analiz etmek için batı şişkinliğine maruz kaldı. Şekil 1'degösterildiği gibi, geri dönüşüm endozom işaretçisi Rab11 kesir 720'detespit edilir. β-COP, COX IV, G.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yukarıdaki protokol, kültürlü hücrelerden geri dönüşüm endozomlarını ultracentrifugation ile izole etme prosedürlerini özetlemektedir. Bu yöntemin güvenilirliği en son yayınla gösterilmiştir 22 Geri dönüşüm endozomlarının Golgi aparatı ve mitokondri gibi diğer organellerdenbaşarıylaizole edildiğini kanıtlayan22. İyi bir ayrılık sonucu elde etmek için bazı kritik adımlara dikkat edilmesi gerekir. Sakkaroz çözeltileri hazırlanırken, çözeltilerin kırılma indekslerinin bi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar bu makalenin içeriği ile herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Araştırma Hibeleri Konseyi Hong Kong, CUHK doğrudan hibe programı, United College bağış fonu ve TUYF Hayır Kurumu'ndan fonlarla desteklendi. Bu çalışmadaki rakamlar, Ekim 2020'de FASEB Dergisi'nde yayınlanan "ARF6-Rac1 sinyal aracılı neurit büyümesi, nöronal adaptör FE65 tarafından ARF6 ve ELMO1'i düzenleyerek güçlenmiştir" adlı önceki yayınımızdan uyarlanmıştır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 mL, Üstü Açık Kalın Duvar Polipropilen Tüp, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm doku kültürü kabı | SPL | 20100 | |
| 13,2 mL, Sertifikalı Ücretsiz Üstü Açık İnce Duvar Ultra Şeffaf Tüp, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Örnek Tamponu | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitör Kokteyli | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Tavşan mAb | Hücre Sinyal Teknolojisi | 4850S | COX IV'ü tespit etmek için tavşan monoklonal antikoru. |
| Sikloheksimid | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Doku Öğütücü, 7 mL | DWK Yaşam Bilimleri | 357542 | |
| Dulbecco'nun düşük glikozlu Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) HyClone | SH30021.01 | ||
| ELMO1 antikoru (B-7) | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-271519 | ELMO1'i tespit etmek için fare monoklonal antikoru. |
| EndoFree Plazmid Maxi Kiti | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antikoru (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | FE65'i tespit etmek için keçi poliklonal antikoru. |
| Fetal Sığır Serumu, Araştırma Sınıfı | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoklonal Antikor (6C5) | Ambion | AM4300 | GAPDH'yi tespit etmek için fare monoklonal antikoru. |
| ImageLab Yazılımı | Bio-Rad | Bant yoğunluğunun ölçümü | |
| İmidazol | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoklonal Anti-β-COP antikoru | Sigma | G6160 | β-COP'u tespit etmek için fare monoklonal antikoru. |
| Myc-tag (9B11) fare mAb | Hücre Sinyal Teknolojisi | 2276S | Myc etiketli proteinleri tespit etmek için fare monoklonal antikoru. |
| OmniPur EDTA, Disodyum Tuzu, Dihidrat | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı | Gibco | 31985070 | |
| PhosSTOP | Roche | ||
| RAB11A-Spesifik Poliklonal antikor | Proteintech | 20229-1-AP | Rab11'i tespit etmek için tavşan poliklonal antikoru. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Sallanan Kovalı Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Sabit Açılı Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızısı | Gibco | 25300062 |
Kaynaklar
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
