İnsan Retinoblastomunu In Vitro Yeniden İnşa Etmek

İnsan retinoblastomu (RB), retinal koni öncüllerinden ^1,2,3 köken alan nadir görülen^, ölümcül bir tümördür ve çocukluk çağında en sık görülen göz içi malignite tipidir 4. RB1 geninin homozigot inaktivasyonu, RB^5'te başlatıcı genetik lezyondur. Bununla birlikte, RB1 mutasyonlarına sahip fareler retinal tümör^2'yi oluşturamaz. Fare tümörleri Rb1 mutasyonlarının ve diğer genetik modifikasyonların kombinasyonu ile üretilebilse de, hala insan RB^6'nın özelliklerinden yoksundurlar. Retinal organoid farklılaşmasının gelişmesi sayesinde, insan RB^1'in karakterlerini gösteren hESC türevi RB elde edilebilir.

Son on yılda, retinal organoid farklılaşması için 2D⁷, 3D⁸ ve 2D ve 3D^9'un bir kombinasyonu da dahil olmak üzere çok sayıda protokol oluşturulmuştur. Burada insan RB'sini üretmek için kullanılan yöntem, yapışkan kültürün ve yüzen kültürün konsolidasyonudur⁹. RB1 mutasyona uğramış hESC'yi retinal organoidlere ayırarak, RB oluşumu yaklaşık 45. günde tespit edilir ve daha sonra 60. günde hızla çoğalır. 90. günde, RB'lerin izolasyonu ve RB hücre hattının oluşturulması mümkündür; Ayrıca, RB 120. günde neredeyse tüm retinal organoidleri çevreler.

hESC kaynaklı RB, RB'nin kökenini, tümörigenezini ve tedavilerini araştırmak için yenilikçi bir modeldir. Bu protokolde, gen düzenleme hESC'nin üretimi, RB'nin farklılaşması ve RB için karakterizasyon ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Bu çalışma, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Tongren Hastanesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. H9 hESC'ler WiCell Araştırma Enstitüsü'nden temin edilmektedir.

1. RB1 mutasyona uğramış hESC üretimi

1. RB1'in nakavtı (KO) için CRISPR / Cas9 hedefleme vektörü.
   1. Bir çift sgRNA tasarlayın. RB1'in ablasyonu için, bu genin ilk ekzonunu hedefleyin. İleri astar dizisi CACCGCGTGGCGGCCGTTTTTCGG ve ters astar dizisi AAACCCGAAAAACGGCCGCCCCCCACCGC'dir.
      NOT: Belirli RB1 mutasyonu için, onarılmış bir şablon da gereklidir. Bu protokolde örnek olarak RB1-KO hücre hattı kullanılmıştır.
   2. Üreticinin talimatlarını izleyerek 1 μg pX330-U6-Kimerik BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro'yu BbsI kısıtlama enzimleri ile ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de 30 dakika boyunca sindirin.
   3. Sindirilmiş plazmidleri, üreticilerin talimatlarına göre bir saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın.
      NOT: Enzimatik reaksiyonlar, saflaştırma kiti kullanılarak agaroz jeli olmadan doğrudan temizlenebilir (bkz.
   4. T4 polinükleotid kinaz (PNK) (Malzeme Tablosu) kullanılarak her bir oligo çiftini fosforilat ve tavlama, 1 μL oligo1 (100 μM), 1 μL oligo2 (100 μM), 1 μL 10x T4 Ligasyon Tamponu, 6.5 μL ddH₂O ve 0.5 μL T4 PNK'dan oluşan reaksiyonla.
      NOT: Adım 1.1.1'deki ileri ve geri primerler bir çift oligodur. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir termosikler içindeki oligoları fosforile edin ve tavlayın: 30 dakika boyunca 37 ° C; 5 dakika boyunca 95 °C; dakikada 5 °C'de 25 °C'ye kadar rampa.
   5. Oda sıcaklığında (RT) 199 μL nükleaz içermeyen suya 1 μL oligo reaktifi ekleyerek fosforile edilmiş ve tavlanmış oligoları 200 kez seyreltin.
   6. Ligasyon reaksiyonunu ayarlayın ve aşağıdakileri karıştırarak RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin: Adım 1.1.3'ten 50 ng Bbs1 sindirilmiş plazmid, adım 1.1.5'ten 1 μL oligo dubleks, 5 μL 2x ligasyon tamponu, 1 μL ligaz ve nükleaz içermeyen su kullanarak 10 μL'ye kadar doldurun.
   7. Ligasyon karışımını dönüştürün ve bir sonraki adım için pozitif kolonileri sıralayın.
      NOT: Sıralama için U6 ileri veya geri astar kullanın.
      1. Yetkin hücreleri buz üzerinde çözün.
      2. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde yetkin hücrelerin 50 μL'sini alın.
      3. Ligasyon karışımının 1 μL'sini 1.1.6 adımından yetkin hücrelere ekleyin.
      4. Tüpü üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, hafifçe karıştırın.
         NOT: Girdap yapmayın.
      5. Karışımı 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
      6. Karışımı 42 °C'de 90 sn için ısıtın.
      7. Tüpe antibiyotiksiz 950 μL oda sıcaklığında Luria-Bertani (LB) suyu ekleyin.
      8. Tüpü 60 dakika boyunca 37 ° C'de 300 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
      9. LB plakalarını (pepton, kazeinden pepton, sodyum klorür, agar-agar ve ampisilin) önceden 37 ° C'ye ısıtın.
      10. RT'deki plakalara 50-100 μL hücre ve ligasyon karışımı yayın.
      11. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      12. Plakadan 12 koloni alın ve bunları ampisilin ile LB ortamına aktarın. Ortamı 60 dakika boyunca 300 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
      13. PCR için şablon olarak bakteri çözeltisinin 1 μL'sini (adım 1.1.7.12'den) kullanın ve pozitif kolonileri seçin.
      14. Pozitif kolonileri U6 primerleri ile sıralayın, bir sonraki adımda tasarlanan sgRNA dizileri ile koloniyi kullanın.
   8. Plazmidi bir midi kiti kullanarak çıkarın (bkz.
      NOT: Mini kit kullanan plazmidin kalitesi ve miktarı, aşağıdaki nükleofeksiyon deneyi için yeterli değildir. Midi veya maxi kit, mini kitten daha uygundur.
2. HESC kültürü ve nükleofeksiyonu.
   NOT: Tüm reaktifleri RT'ye önceden ısıtın.
   1. 1 x 10 6 H9 hücrelerini, 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitörü) ve 2 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı içeren önceden kaplanmış⁶ delikli bir plakaya çözün.
      NOT: 6 delikli plakayı, kullanımdan önce 37 °C'de en az 30 dakika boyunca %1 Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi ile kaplayın.
   2. Ertesi gün, süpernatanı çıkarın, hücreleri 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) ile durulayın ve ardından 2 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ekleyin.
   3. Hücreler yaklaşık% 80 akıcılığa ulaşana kadar takip eden 3-5 gün içinde ortamı 2 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ile her gün değiştirin.
   4. hESC'nin durumunu ayarlamak için bir veya iki kez geçiş.
      NOT: hESC'nin durumunu tanımlamanın en kolay yolu morfolojidir.
   5. Farklılaşmamış H9 hücrelerini% 80 akıcılığa ulaşana kadar 6 delikli bir plakada kültürleyin.
   6. 10 μM Y-27632 ile karıştırılmış 2 mL taze ncEpic-hiPSC/hESC kültür ortamı ile nükleofeksiyondan 2 saat önce ortamı değiştirin ve% 1 Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi kullanarak 12 delikli bir plakanın bir kuyuğunu önleyin.
   7. Ortamı aspire edin ve 1 mL önceden ısıtılmış DPBS ile durulayın.
   8. DPBS'yi çıkarın ve 37 ° C'de 3,5 dakika boyunca 1 mL hücre ayrışma enzimi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
   9. H9 hücrelerini tek hücreli bir süspansiyon haline getirmek için hücrelere 1 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ve pipet iki kez ekleyin.
   10. Hücre sayımı için karışımın 100 μL'sini çıkarın ve kalanını içinde 2 mL ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
   11. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve yaklaşık 2 x 10⁶ hücreyi 100 μL reaksiyon hacmine geri sarkıtın. Üreticinin protokolüne göre, hücreler, plazmidler, nükleofektör ve reaksiyon koşulları için hacmi optimize edin. Bu protokolde kullanılan nükleofeksiyon sistemi için Malzeme Tablosuna bakınız.
       NOT: Genel olarak, nükleofeksiyon sırasında kabarcıklara izin verilmez.
   12. Transfeksiyondan sonra, hücreleri önceden kaplanmış 12 delikli plakaya aktarın, 1.5 mL ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ve 10 μM Y-27632 ile takviye edin ve daha sonra hücreleri 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatörde kültürleyin.
   13. Ortamı günlük olarak değiştirin. 48 saat sonra, bir hafta civarında hücre seçimi için 2 μg / mL puromisin ekleyin.
       NOT: İlk 3 gün boyunca çok sayıda hücre ölür. Kalan hücreler çoğalabilir ve puromisin seçiminden sonraki hafta içinde koloniler halinde üretebilir. Seçim haftasında, ortamın her zaman 2 μg / mL puromisin içerdiğinden emin olun.
   14. Kolonileri mikroskop altında manuel olarak seçin.
       NOT: Koloni morfolojisi hES kolonisi ile aynıdır. Kolonileri, ortamda 10 μL beyaz / normal pipet ucu ile parçalara ayırın (koloni başına 2-6 adet) ve bir koloniyi 12 delikli bir plakanın önceden kaplanmış bir kuyucuğuna aktarın.
   15. İlk olarak, RB1 mutasyonlarını ve hedef dışı durumları tanımlayın (Tablo 1) ve ardından RB1 nakavt H9 hücre hattını karakterize etmek için pluripotensi.
       NOT: PCR ve sanger dizilimini kullanarak RB1 mutasyonlarını ve hedef dışı durumları tespit edin. RT-PCR ve İmmünofloresan ile pluripotens belirteçlerini tanımlayın.

2. İnsan retinoblastomunun oluşumu

1. RB1-KO hESC'nin bakımı.
   1. Kültür gen-düzenlenmiş H9 hücreleri bir Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matris kaplı 6 delikli plaka ile 2 mL ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ve her gün ortamı değiştirin.
   2. EDTA tamponunu kullanarak 37 °C'de 3,5 dakika veya RT'de 5 dakika boyunca geçiş.
      NOT: EDTA tamponu, 1x DPBS, 5 mM EDTA ve 0.9 mg / mL NaCl karışımıdır.
2. Retinal hücre farklılaşması.
   NOT: Farklılaştırmadan önce Medium I'i hazırlayın. Orta I'i hazırlamak için, 24.5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) / Besin Karışımı F-12 (F12)-Glutamin (1x), 24.5 mL Nöronal bazal ortam, 250 μL 100x takviyesi A, 500 μL 50x takviyesi B, 0.1 mM ß-merkaptoetanol ve 250 μL 100x L-glutamin karışımı. Kullanmadan önce tüm karışımları RT'ye önceden ısıtın.
   1. RB1-KO hESC'yi 6 delikli plakanın bir kuyucuğunda %80 birleşime kadar büyütün.
   2. Ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mL 1x DPBS ile durulayın.
   3. Hücre kolonilerini 1 mL dispase tamponu kullanarak ( bakınız Malzeme Tablosu) 37 °C'de 5 dakika boyunca yükseltin.
      NOT: Hücre kolonilerini mikroskop altında kontrol edin. Genellikle, kolonilerin kenarının ortaya çıkması 5 dakika sürer.
   4. Dispase tamponunu aspire edin ve hücreleri 1 mL 1x DPBS ile bir kez nazikçe durulayın.
   5. Kuyuya 1 mL Orta I ekleyin.
   6. Kolonileri, ortada 10 μL beyaz/normal pipet ucu ile parçalara ayırın (koloni başına 6-9 adet).
      NOT: Genel olarak, hücrelerin yaklaşık% 60-70'i kuyudan ayrılır. Ortamdaki kalan hücreleri kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
   7. Tüm hücreleri, 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 mL'lik bir tüpte santrifüj yaparak toplayın.
   8. Ortamdaki hücreleri dağıtmak için süpernatantın yaklaşık 50 μL'sini bırakın ve daha sonra hücreleri 250 μL Büyüme faktörü ile karıştırın ve nazik ajitasyonla azaltılmış bazal membran matrisini karıştırın.
      NOT: Kullanmadan önce Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisini 4 °C'de veya buz üzerinde tutun. Aliquoted edilir ve -20 ° C'de saklanırsa, kullanımdan önce gece boyunca veya en az 1 saat önce 4 ° C'ye yerleştirin.
   9. Asılı hücrelerle birlikte 15 mL'lik tüpü 20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde tutun.
      NOT: Hücrelerin ve Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisinin katılaşmış bir jel oluşturduğundan emin olun.
   10. 15 mL tüpe 1 mL Orta I ekleyin ve ardından kümeyi 1 mL'lik bir pipetle dağıtmak için katılaşmış jeli iki ila üç kez hafifçe pipetin.
   11. 9 mL Orta I ekleyin ve hücre süspansiyonunu 10 cm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın.
   12. Çanağı% 5 CO₂ ile 37 ° C'lik bir inkübatöre taşıyın ve günü 0. gün olarak ayarlayın.
   13. 1. günde mikroskop kullanarak hücreleri inceleyin.
       NOT: Çanakta binlerce içi boş kist görülebilir. Ortalama olarak, bir parça jelde 3 ila 4 kist gözlenir.
   14. 5. günde ortamı değiştirin. Süpernatantı 15 mL'lik bir tüpe toplayın, kistlerin dibe çökmesini bekleyin ve ardından ortamı çıkarın ve taze Orta I ile değiştirin.
       NOT: Ortam 4. günde sararırsa, ortamı 4. günde, aksi takdirde 5. günde değiştirin. Orijinal yemeğe 10 mL taze Orta I ekleyin. Yüzlerce kist zaten kültür yüzeyine bağlanmıştır; onları orada tutun.
   15. Tüpteki kistleri iki adet 10 cm'lik kaba dağıtın.
       NOT: Bir tabakta en az 300 kist olduğundan emin olun. Kistler birleşmiş değilse, kistleri diğer bulaşıklara ayırmayın; onları orijinal 10 cm'lik tabağa geri getirin.
   16. 7. günde, çoğu kist (% 95'in üzerinde) yemeğe bağlanır, yayılır ve yapışkan koloniler oluşturur.
       NOT: 3. gün gibi erken bir tarihte, yapışkan koloniler gözlemlenebilir.
   17. 10. günde, ortamı taze Orta I ile değiştirin.
   18. Aşağıdakileri karıştırarak bir sonraki adımdan önce Medium II'yi hazırlayın: 36 mL DMEM, 12 mL F12, takviye B'nin% 2'si (v / v), 0.1 mM MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (NEAA).
   19. Hücrelerin 13-17. güne kadar yayıldığından emin olun. Hücrelerin yayıldığı ancak komşu kolonilerle etkileşime girmediği 15. günde bir sonraki adımı uygulayın.
   20. Hücreleri 1 mL DPBS ile bir kez durulayın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca 1 mL dispase çözeltisi ekleyin.
       NOT: 5 dakika içinde hücrelerin kenarı yükselir.
   21. Dispase tamponunu çıkarın ve kültürleri 1 mL 1x DPBS ile nazikçe durulayın.
   22. Her 10 cm'lik çanağa ve kültüre 37 °C, %5 CO₂ inkübatörde 10 mL Orta II ekleyin.
   23. Yapışkan kültürler 24 saat sonra kendiliğinden ayrılır ve retinal organoidlere birleşir.
       NOT: Organoidleri oluşturmayan çok sayıda hücre takip eden 2 gün içinde ölecektir.
   24. Ayrılmadan üç gün sonra, hücreleri hücre kültürü kabından toplayın ve organoidlerin 15 mL'lik bir tüpe yerleşmesine izin verin.
   25. Süpernatantı tüpten çıkarın ve organoidleri takip eden dört gün boyunca 10 mL Orta II ile yeni bir yapışkan olmayan kaba (Petri kabı) aktarın.
   26. DMEM'yi karıştırarak Orta III'ü hazırlayın: F12'yi 3: 1 oranında (v / v), % 2 takviye B (v / v), 0.1 mM MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (NEAA), % 8 Fetal Sığır Serumu (FBS) (v / v), 100 μM Taurin ve 2 mM Glutamin.
   27. Ayrılmadan bir hafta sonra, ortamı Orta III olarak değiştirin.
   28. Bu günden itibaren, organoidleri Orta III'te kültürleyin ve haftada iki kez ortamı yenileyin.
3. RB hücre hattının kurulması.
   NOT: Tüm reaktifler RT'de önceden ısıtılır.
   1. 90. günde, RB'ler (%80-%90) retinal organoidleri kapsar. Bu nedenle, RB hücre hattının oluşturulması için 90 günlük RB organoidlerini seçin.
   2. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 ortamını %10 FBS ile karıştırarak 1640 ortamını hazırlayın.
   3. RB'yi RPMI-1640 ortamında mikroskop altında mikrocerrahi bir bıçakla parçalara ayırın (RB başına 20-25 adet).
   4. RPMI-1640 ortamını çıkarın ve parçaları 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.25 Tripsin / EDTA ile tedavi edin.
   5. Reaksiyonu sonlandırmak için RPMI-1640 ortamını ekleyin ve 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
   6. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri 1640 ortamında yapışkan olmayan bir kapta yeniden askıya alın.
   7. RB hücre hattı yüzen bir kültürdür. Ortamı haftada iki kez değiştirin ve RB hücrelerini 2 hafta içinde geçirin.
      NOT: Primer RB hücrelerinin proliferasyon hızı oldukça yavaştır.

RB üretiminin prosedürü, yapışkan ve yüzen kültürü birleştiren Şekil 1'de açıklanmıştır. İnsan RB'sini RB1-KO hESC'den toplamak ve RB organoidlerini izole ederek RB hücre hattını elde etmek mümkündü.

Burada, protokol farklı aşamalardaki farklılaşmanın ayrıntılarını sağlar (Şekil 2). İlk 3 gün içinde kültür yüzeyine yapışan ve daha sonra genişleyen içi boş küreler oluşur (Şekil 2A-E). 15. günden itibaren, hücreler yükselir ve kültür süspansiyondadır (Şekil 2F). Ayrılmadan sonraki gün, retinal organoidler oluşur ve parlak jantlar görünür (Şekil 2G, siyah oklar). Dahası, organoidlerin dışındaki hücrelerin bir sonraki hafta içinde ölmesi muhtemeldir (Şekil 2G, turuncu oklar). 27. günde, optik vezikül mimarisi belirgindir ve organoidlerin yaklaşık% 90'ı bu yapıyı gösterir (Şekil 2H); bu yapıya sahip olmayan organoidler atılabilir. RB'nin ilk tespiti 45. günde gerçekleşir ve daha sonra 50. günde elle tutulur hale gelir (Şekil 2I). 90. güne kadar büyüdüğünde, optik vezikül yapıları esas olarak RB tarafından kaplanır (Şekil 2J). Bu arada, RB daha fazla kültür için bir RB hücre hattı olarak izole edilebilir (Şekil 2K). % 80'in üzerinde retinal organoidler, 105. günde RB tarafından tamamen sarılmış olacaktır (Şekil 2L). RB organoidlerindeki tümörigenezi gösteren H9 türevi retinal organoidlerle karşılaştırıldığında Ki67 (proliferasyon belirteci) ve SYK (onkogen belirteci) ekspresyonunu yüksek oranda gösterirler (Şekil 2M, N). Ek olarak, RB organoidlerinde ARR3 (koni öncü yapıcı) ve CRX'in (fotoreseptör öncü belirteci) yüksek ekspresyonu, koni öncü hücrelerinden kaynaklandıklarını göstermektedir (Şekil 2O, P).

RB üretimi prosedürü esas olarak RB oluşumundan önce morfoloji değişiklikleri ile üç aşamadan geçer; burada çalışma bu aşamalarda alt ve üstün sonuçlar vermektedir (Şekil 3). Diferansiye ve farklılaşmamış hESC'nin (Şekil 3A,B) morfolojiden ayırt edilmesi kolaydır ve RB oluşumu için farklılaşmamış hESC seçilir. 5. günde, katı küre yerine içi boş bir küre (Şekil 3D) üretmelidir (Şekil 3C). RB, optik vezikül mimarisini gösteren retinal organoidlerden türetilmiştir (Şekil 3F). İnferior organoidlerde oluşacak RB yoktur (Şekil 3E).

Şekil 1: RB organoidlerinin farklılaşmasının şematik görünümü. 0. gün 15. gün, hücreler orta I'de 2D kültürdür ve 15. günden sonra hücreler süspansiyon kültürüdür. RB yaklaşık 45. günde oluşur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: RB jenerasyonu ve karakterizasyonu. (A-C) Erken evredeki prosedürde, hESC kistleri oluşturacak şekilde yükseltilir. (B) içindeki siyah oklar, dispase işleminden sonra hESC'nin yuvarlanmış kenarlarını gösterir. (D,E) Kistler plakalara (D) bağlanır ve sonra genişler (E). (F) Yapışkan hücreler retinal organoidleri oluşturmak için yükseltilir. Siyah oklar, dispase işleminden sonra yuvarlanmış kenarları gösterir. (G,H) RB'siz retinal organoidlerin erken günleri. (I, J) RB'li retinal organoidler 50. gün (I) ve 90. gün (J), yeşil daireler RB kısımlarını kanıtlar. (K) 90 günlük retinal organoidlerden izole RB hücre hattı. (L) RB organoidleri 105. günde. (M-P) Onkogen belirteçleri (M,N) ve fotoreseptör belirteçleri (O,P) için immünofloresan görüntüler. A-L'de, ölçek çubukları = 200 μm; M-P'de, ölçek çubukları = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Olumsuz ve olumlu sonuçların karşılaştırılması. 0. gün (A,B), gün 5 (C,D) ve gün 30'da (E,F) farklılaşma için aşağı ve üstün görüntüler. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar, bu çalışmanın tarafsızlığını etkileyebilecek herhangi bir bağlantı, üyelik, finansman veya finansal holdingin farkında değildir.