Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Açık Küre Yaralanmalarını ve Terapötik Performansı İzlemek için Ön Segment Organ Kültürü Platformu

1.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62649

⸱

25 Ağustos 2021

 , 
1Department of Sensory Trauma, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston, 2Engineering Processes and Product Development Group, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston

Bu makalede

Özet

Açık küre göz yaralanmaları, kırsal veya askeri senaryolarda birden fazla gün boyunca tedavi edilmeyebilir ve bu da körlüğe neden olabilir. Görme kaybını en aza indirmek için terapötiklere ihtiyaç vardır. Burada, bir organ kültürü açık küre yaralanma modelini detaylandırıyoruz. Bu model ile, bu yaralanmaları stabilize etmek için potansiyel terapötikler uygun şekilde değerlendirilebilir.

Özet

Açık küre yaralanmaları kötü görsel sonuçlara sahiptir ve genellikle kalıcı görme kaybına neden olabilir. Bu kısmen, kırsal ortamlarda yaralanma ve tıbbi müdahale ile oftalmik bakımın hazır olmadığı askeri tıp uygulamaları arasındaki uzun gecikmeden kaynaklanmaktadır. Tedavi edilmeyen yaralanmalar, göz su geçirmez mührünü kaybettikten sonra enfeksiyona ve göz içi hipotensiyona bağlı doku canlılığı kaybına karşı hassastır. Açık küre yaralanmalarını geçici olarak mühürlemek için terapötikler, uygun şekilde geliştirilirse, göz içi basıncını geri getirebilir ve uygun oftalmik bakım mümkün olana kadar enfeksiyonu önleyebilir. Ürün geliştirmeyi kolaylaştırmak için, burada ayrıntılı olarak, yaralanma sonrası en az 72 saat boyunca terapötik performansı izlemek için ön segment organ kültürü açık küre yaralanma platformunun kullanımı ayrıntılı olarak açıktır. Porcine ön segment dokusu özel tasarlanmış organ kültürü yemeklerinde tutulabilir ve fizyolojik göz içi basıncında tutulabilir. Delinme yaralanmaları, askeri yaralanma boyutlarına benzer şekilde 4,5 mm çapa kadar yaralanma boyutları üretebilen pnömatik güçte bir sistemle oluşturulabilir. Göz içi basıncı kaybı, uygun yaralanma indüksiyonunu ve gözün su geçirmez contasının kaybını doğrulayan 72 saat sonrası yaralanma için gözlenebilir. Terapötik performans, yaralanma indüksiyonu sonrası göze uygulama ve daha sonra göz içi basıncının birden fazla gün boyunca izlenmesi ile takip edilebilir. Ayrıca, ön segment yaralanması modeli, saydamlığı, oküler mekaniği, kornea epitel sağlığını ve doku canlılığını değerlendirmek gibi ön segment fizyolojisini fonksiyonel ve biyolojik olarak izlemek için yaygın olarak kullanılan yöntemler için geçerlidir. Genel olarak, burada açıklanan yöntem, oftalmik bakım hazır olmadığında açık küre yaralanmalarını geçici olarak kapatmak için biyomalzeme terapötikleri geliştirmek için gerekli bir sonraki adımdır.

Giriş

Açık küre (OG) yaralanmaları tedavi edilmezse veya yaralanmadan sonra en azından stabilize edildiğinde kalıcı görme kaybına neden olabilir1. Ancak gecikmeler, kırsal alanlarda veya askeri senaryolarda savaş alanında olduğu gibi oftalmik müdahaleye erişimin hazır olmadığı uzak bölgelerde yaygındır. Tedavi hazır olmadığında, mevcut bakım standardı, tıbbi müdahale mümkün olana kadar gözü sert bir kalkanla korumaktır. Askeri tıpta, bu gecikme şu anda 24 saate kadardır, ancak hava tahliyenin mümkün olmadığı kentsel ortamlarda gelecekteki savaş operasyonlarında 72 h'ye kadar artması bekmektedir2,3,4. Oftalmik müdahaleye erişimin sınırlı olduğu kırsal, uzak sivil uygulamalarda bu gecikmeler daha da uzun olabilir5,6. Tedavi edilmemiş bir OG yaralanması, gözün su geçirmez mührü tehlikeye atıldığınız için enfeksiyona ve göz içi basıncı kaybına (Gİb) oldukça duyarlıdır7,8. Gİb kaybı doku canlılığını etkileyebilir, yaralanma ve terapötik arasındaki gecikme çok uzunsa, herhangi bir tıbbi müdahalenin görüşü geri getirme olasılığını düşük hale getirir9.

Bir oftalmik uzmana ulaşılana kadar OG yaralanmalarını kapatmak için uygulanması kolay terapötiklerin geliştirilmesini sağlamak için, daha önce10 , 11. Bu model ile tüm gözenekli gözlerde yüksek hızlı yaralanmalar oluşturulurken, Gİb basınç dönüştürücüler tarafından yakalandı. Terapötikler daha sonra OG yaralanma bölgesini mühürleme yeteneklerini değerlendirmek için uygulanabilir12. Bununla birlikte, bu model tüm gözenekli gözleri kullandığından, sadece hasta özel bakıma ulaşana kadar terapötik yaralanma bölgesini stabilize etmesi gereken olası 72 saat penceresinde daha uzun süreli performansı izlemenin bir yolu olmadan hemen terapötik performansı değerlendirebilir. Sonuç olarak, ön segment organ kültürü (ASOC) OG yaralanma modeli geliştirilmiş ve uzun süreli terapötik performansı izlemek için bir platform olarak bu protokoldedetaylandır 13.

ASOC, kornea gibi ön segmentin avasküler dokusunun, enükleasyon sonrası 14 , 15,16,17gibi birkaç hafta boyunca korunması için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Ön segment fizyolojik akış hızlarında sıvı perfüzyon ve TRABEKÜler meshwork çıkış bölgesi korunarak fizyolojik Gİb altında korunur, Gİb düzenleme sorumlu doku, ASOC kurulumu sırasında18,19. ASOC platformu doku fizyolojik olarak koruyabilir, pnömatik güçlendirilmiş bir cihaz kullanarak OG yaralanmasına neden olabilir, terapötik uygulayabilir ve yaralanma sonrası en az 72 saat boyunca yaralanma stabilizasyonunu izleyebilir13.

Burada, protokol ASOC platformunu kullanmak için adım adım bir metodoloji sağlar. İlk olarak, ASOC platformunun nasıl kurulayıp üretılacağını detaylandırıyor. Daha sonra, protokol ön segmentin nasıl aseptik olarak parçalanıp trabeküler mesh çalışmasının nasıl korunduğunu ve ardından özel yapım organ kültürü yemeklerinde ön segment dokusunun nasıl kurulduğunu detaylandırıyor. Daha sonra, açık küre yaralanmalarının nasıl oluşturulacağını ve yaralanmadan hemen sonra terapötik nasıl uygulanacağını detaylandırıyor. Son olarak, protokol, gözün fonksiyonel, mekanik ve biyolojik özelliklerini ve yaralanmanın ne kadar iyi stabilize edildiğini değerlendiren bu yöntemle kullanımı mümkün olan karakterizasyon parametrelerine genel bir bakış sağlar. Genel olarak, bu model açık küre yaralanmalarını stabilize etmek ve tedavi etmek için ürün geliştirmeyi hızlandırmak ve yaralanmadan sonra zayıf görme prognozunu iyileştirmek için çok ihtiyaç duyulan bir platform sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolü gerçekleştirmeden önce, hayvanların araştırma ve eğitimde kullanımı için yasal ve etik gerekliliklerin mevcut olduğunu unutmayın. Canlı hayvanlar oküler doku kaynağı için kullanılıyorsa, başlamadan önce yerel etik veya yasal otorite (IACUC veya Etik kurulu vb.) tarafından onay alın. Hayvanların kullanımı için onay alma konusunda herhangi bir soru varsa, devam etmeyin. Daha önce in vivo fizyolojiye en yakın 24 saat içinde elde edilen ve kullanılan taze gözenekli gözlerin in vivo fizyolojiye en yakın olduğunu ve bu çalışmalar için iyi uzak olduğunu belirledik ve bildirdik (Hayvan Teknolojileri, Tyler, TX, ABD)10,13. Bu protokol boyunca 24 saat içinde doku elde etmek için bir doku satıcısı kullanılarak canlı hayvan kullanılmamıştır.

NOT: Doku gelmeden önce organ kültürü yemeklerini (Tamamlayıcı Protokol 1), sıkma halkalarını (Tamamlayıcı Protokol 1),çanak standlarını (Tamamlayıcı Protokol 1), basınç dönüştürücü veri toplama kurulumunu (Tamamlayıcı Protokol 2) ve pnömatik delinme platformunu (Tamamlayıcı Protokol 3) imal edin. Bulaşıkları, aletleri ve malzemeleri sterilize edin ve çalışma alanlarını hazırlayın. Genellikle bağcı, ekstra yörünge dokusu ile birlikte geldikleri için gözlerde brüt diseksiyon yapmak için steril olmayan bir alana sahip olmak yararlıdır. Bu ilk adımları açık, temiz bir çalışma yüzeyinde uygulayın ve ardından gözleri mikro diseksiyon için bir BSC II kabinine aseptik olarak aktarın (dolap #1). En uygun şekilde, mikro diseksiyon için kullanılan BSC II kabini, hava akışını en aza indirmek ve çalışma alanını en üst düzeye çıkarmak için çanak montaj BSC II kabininden (kabin #2) ayrılır. Mikro diseksiyon kabinini bir diseksiyon mikroskobu ve çalışma yüzeyini görselleştirmenin bir yolu (kabinden çıkıntılı kamera veya göz merceği) ile ayarlayın.

1. Sterilizasyon adımları, sarf malzemeleri (daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosu'nu görün) ve kurulum

  1. Aşağıdaki öğeleri hazırlayın ve gaz sterilize edin (her göz için 1 kit): ASOC çanağı, sıkma halkası, O halkalı iki akışkan konektör, iki adet 18 G iğne göbeği, dört vida, iki uzunlukta PE-100 boru (mesafe uzunluğu, inkübatörün içindeki çanaktan şırınga pompasına ve basınç dönüştürücü veri toplama kurulumuna kadar uzanacak kadar uzun olmalıdır), iki adet 18 G 90° bükülmüş iğne göbeği, iki adet 3'lü vana.
  2. Aşağıdaki kitleri hazırlayın ve otoklav yapın.
    1. Bir çift ince forseps, bir çift Vannas makası, bir çift orta dişli forseps, bir çift büyük makas, pamuklu çubuk ve bir jilet veya neşter içeren mikro diseksiyon aleti kitini hazırlayın ve otoklavlayın.
    2. Bir çift orta dişli forseps, bir çift cerrahi makas ve bir L-anahtar içeren montaj aleti kitini hazırlayın ve otoklavlayın.
    3. Gerektiğinde her gün bulaşıklara sıkma halkalarını sıkmak için bir L tuşu içeren günlük kiti (miktar: kültür günde bir adet) hazırlayın ve otoklavleyin.
    4. Gözleri ve ön segmentleri dezenfekte etmek ve depolamak için dört 100 mL beheri otoklavlav edin.
    5. Delinme nesnelerini otomatik olarak örtün.
  3. Aşağıdaki steril eşyaları toplayın: Petri kabı (1 tabak/göz), gazlı bez (1-2/göz), çanak standı, 20 mL şırıng (1/göz), 10 mL şırıng (1/göz), naylon şırıng filtreleri (1/göz).
  4. Steril ortam hazırlayın: %4 FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamisin, 1x Antibiyotik-Antimikotik (AA; yaklaşık 30-40 mL komple ortam/göz) ile DMEM.
  5. AA-PBS: 1x AA (~500 mL) ile PBS hazırlayın.
  6. Brüt diseksiyon takım paketini hazırlayın: büyük cerrahi makas ve toparlayıp temizleyin.
  7. Steril olmayan diseksiyon çalışma alanını kurun: Brüt diseksiyon takım paketinden, PBS'ye batırılmış enüklet gözenekli gözlerden ve buzda, cerrahi perdeden, PBS'li 100 mL beherden malzeme toplayın. Brüt diseksiyon için gerekli cerrahi örtü ve öğeleri düzenlemek.
  8. Steril diseksiyon çalışma alanını kurun: Mikro diseksiyon aleti kiti, steril gazlı bez, diseksiyon mikroskobu, betadin çözeltisi, steril PBS, steril ortam, dört sterilize edilmiş 100 mL beher, steril Petri kabından malzeme toplayın. BSC II kabine #1'e aseptik olarak aktarın. Diseksiyon mikroskopunda gözleri görselleştirmek için kabini kurun.
  9. ASOC montaj çalışma alanını kurun: Gaz sterilize edilmiş kitleri (bulaşık kiti ve kapak kiti), montaj aleti kiti, steril ortam, bulaşık standları, steril Petri tabakları, steril şırıngarlar ve şırıngar filtreleri toplayın. BSC II kabinesine aseptik olarak aktarın #2. Dolabı bulaşık montajı için ayarlayın.
  10. Gözler stabilize edildiğinde ve delinmeye hazır olduğunda (kurulum sonrası 72 saat), bunları bir BSC II kabinine aseptik olarak aktarın. OG yaralanma indüksiyon çalışma alanını kurun: Pnömatik güçlendirilmiş yaralanma indüksiyon cihazı (Ek 3'teayrıntılı montaj) ve Lab Jack ve ASOC çanağı tutmak için çapraz izleme mengenesi.

2. Dokunun diseksiyonu

  1. Steril olmayan diseksiyon çalışma alanını kullanarak porcine dokusunu hazırlayın.
    1. Yerel bir a sittoirden, hayvan çalışmalarından veya satıcıdan enükle edilmiş porcine gözler temin edin. Teslimat sırasında PBS'ye batırılmış buzda gözleri koruyun ve aldıktan hemen sonra kullanın.
    2. Ekstraorbital dokuyu kesin ve konjonktivayı sadece korneoskleral kabuk ve optik sinir bırakarak kesin. Steril olmayan koşullarda, büyük bir diseksiyon takım paketinde büyük cerrahi makas ve asalarla diseksiyonu gerçekleştirin.
    3. Deneysel kurulum için gerekli tüm gözler ön/brüt diseksiyon yapılana kadar gözleri buz üzerinde taze PBS'ye geri yerleştirin.
    4. Gözleri kapalı kaplarda 2 dakika boyunca% 10 betadin çözeltisine batırın ve BSC II kabinine aseptik olarak aktarın #1. Kurulum sırasında kontaminasyonları en aza indirmek için sonraki tüm çalışmaları steril koşullarda gerçekleştirin.
  2. Ön segmentleri steril olarak parçalara ayırır.
    1. Betadin çözeltisinde 2 dakika sonra, göz dokusunun sterilitesini korurken fazla betadin çözeltisini oküler yüzeyden çıkarmak için gözleri steril AA-PBS'nin üç seri yıkamasına aktarın. Üç yıkamadan sonra, bir sonraki kullanıma kadar dokuyu AA-PBS'de tutun.
    2. Jilet/neşter ve kavisli makas kullanarak gözü şaşır. Gözü AA-PBS'ye batırılmış bir gazlı bezin üzerine yerleştirin ve gözün ekvatorunun yanında steril bir jilet veya neşterle bir kesi oluşturun (ön tarafta 40 ile 60/40 bölün). Kavisli cerrahi makas kullanarak, ön gözü izole etmek için gözü yarı yarıya (kornea yarısı).
      NOT: Organ kültüründe kurulumdan sonra sıvı sızıntısı yaratacak skleradaki pürüzlü, pürüzlü kenarları önlemek için ön segmentin etrafındaki kesimin sürekli olması gerekir.
    3. Ön segmentten vitreus mizahı kepçek için kürek olarak mikroscisörler kullanın. Lensi mikrosirsörler kullanarak ön segmentten çıkarın. Ön segmentleri, daha fazla diseksiyon adımına kadar AA-PBS'de bırakın.
      NOT: Diseksiyon yapılacak tüm gözler bu adımda tutulabilir ve diseksiyon işleminin geri kalanı boyunca tek tek alınabilir.
    4. Diseksiyon mikroskobu ile, iris kökünü trabeküler meshwork (TM) görünene kadar kademeli olarak, radyal olarak kesin. TM, korneoskleral kabuğun etrafında çevreye yönlendirilmiş liflerden oluşan pigmentli bir dokudur. İris köküne doğru irise dikkatli kesikler, doku altındaki TM'nin derinliğini ortaya çıkaracaktır.
    5. Tüm TM bölgesini açığa çıkarmak için dokuya ilk kesimle aynı derinlikte iris etrafında 360 ° kesin. TM'yi kaplayan kalan irisleri gerektiği gibi temizleyin.
    6. Silier gövde kalıntılarını TM'ye arka olarak kırpın ve TM bölgesine sadece ince bir doku arka bandı bırakın (yaklaşık 1 mm).
    7. BSC II kabin #2'deki ASOC'de daha fazla kurulum olana kadar, parçalanmış ön segmenti (AS) ortama yerleştirin.
      NOT: Tek bir kullanıcı diseksiyon ve organ kültürü çanak montajı yapıyorsa, ASOC kurulumu öncesinde tüm gözler bu noktada tutulabilir.

3. Organ kültürü yemeklerinde ön segmentlerin kurulması

  1. As ters (fincan yukarı) ile bir Petri kabına tek bir AS yerleştirin. Bir pamuklu çubuk kullanarak, medyada ıslak ve herhangi bir pigmenti çıkarmak için korneanın ortasına hafifçe dab. Gözü ve aynı bezi tutmak için tokmaklar kullanarak, ekstra pigmenti çıkarmak için skleranın etrafındaki pamuklu çubuğu silin.
  2. AS'yi ters çevirin ve korneayı çanaktaki yükseltilmiş bölgenin üzerine ortalayarak yemeğin alt kısmının üzerine yerleştirin. Sıkma halkasını yeni yerleştirilen AS'nin üzerine yerleştirin.
  3. Halkayı halkanın altında AS ile yerinde tutmak için ilgili deliklere dört vida yerleştirin. Vidaları L tuşu ile hafifçe sıkın.
    NOT: Sıkma adımı deney boyunca her gün gerçekleşecektir, bu nedenle buradaki ilk sıkmanın amacı, sıkıştırma halkasını kırmaktan kaçınırken ortamın sızmamasını sağlamaktır.
  4. Steril bir Petri kabı seti ile üst mekanı kabın üzerine yerleştirin ve kurulumu ters çevirin. Çanak standını takın. O halkalı akışkan konektörleri çanağın altındaki dişli bağlantı noktalarına takın.
  5. Bir akışkan konektöre, 18 G 90° bükülmüş bir iğne göbeği, bir boru uzunluğu, 18 G iğne göbeği, naylon şırınga filtresi, üç yönlü valf ve medya ile dolu 20 mL şırınga takın.
  6. İkinci akışkan konektöre, 18 G 90° derece bükülmüş bir iğne göbeği, boru uzunluğu, 18 G iğne göbeği, üç yönlü bir valf ve steril bir 10 mL şırınganın namlu kısmını takın (bu, ASOC'den sıvı ve kabarcıkları yakalamak için bir rezervuar görevi görecektir).
  7. Şırındlara uygun şekilde açılan üç yönlü vanalarla, AS'yi şişirmek, borudaki medyayı doldurmak ve sonunda rezervuarı doldurmak için 3,5 adımda tanımlanan akışkan konektör bağlantı noktasını kullanarak ortamı sisteme hafifçe itin.
    NOT: Asoc kabına medya sızarsa, AS sıkma halkası ile yeterince sıkı bir şekilde sabitlenir.
  8. Ortamı yavaşça yemeğe iterek ve kabarcıkları dışarı ve rezervuara itmek için tabağı ters çevirerek kabarcıkları çıkarın.
  9. Tabağı yerleştirin ve dik durun. Petri kabının alt kısmını standın ayaklarının altına yerleştirin, boruyu kaplamamaya dikkat edin.

4. Ön segment organ kültürünün başlatılması

  1. ASOC artık kuluçka için hazır. ASOC çanasını hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin (37 °C, %5 CO2). AKÜ'nün yüksekliğini, basınç dönüştürücülerinin üzerindeki inkübatörde, Gİb'i doğru hesaplamak için bilindiğinden ve hesaba katıldığından emin olun (Tamamlayıcı Protokol 4).
  2. Boru hatlarını 37 °C, %5 CO2 inkübatör kapısının altından dışarı doğru yönlendirin, böylece kapının açılıp kapanmasına engel olmazlar. 20 mL şırınnayı 2,5 μL/dk'da ayarlanan şırınna pompasına takın.
  3. Boru hattını basınç dönüştürücü cihazına rezervuarla yerleştirin. Boru hatlarına giren hava kabarcıklarını önlemek için PBS'yi çizgiden geçirirken yan 3 yönlü vanayı basınç dönüştürücü kurulumuna bağlayın.
    NOT: Organ kültürü süresince mikrobiyal büyüme ile rezervuar kirlenmesi olasılığını azaltmak için sistem kurulduktan sonra PBS'yi rezervuarlardan boşaltın.
  4. Önce veri dosyalarını kaydetmek için bir microSD kartın bulunduğuna emin olarak Gİb veri toplamayı başlatın. Ardından, veri toplamaya başlamak için basınç dönüştürücü kurulumunu açın.
    NOT: Basınç dönüştürücü veri toplama cihazının kurulmasına ilişkin ayrıntılar Ek Protokol 2 'de verilmiştir.

5. ASOC'nin günlük bakımı

  1. ASOC'nin dengeyi sağlamak için 24 saat geçirdikten sonra, bulaşıkları 37 °C, % 5 CO2 inkübatöründen çıkarın ve BSC II kabinine yerleştirin.
    NOT: Basınç verisi alımında, ASOC'ler inkübatörden çıkarıldığından (yükseklik değişimi) ve kabinde ayarlandığından bu zaman aralıkları ani artışlar gibi görünür.
  2. Petri plakasındaki her kabın altında sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Varsa, kabın altında sıkı akışkan bağlantılar olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse yeniden sıkın. Sıkma halkasındaki vidaları sıkmak için steril bir L tuşu kullanarak bulaşık üst kısmındaki sızıntıları kontrol edin.
    NOT: AS sklera dokusu kalınlığı 24 saat sıkıştırır ve azaltır ve sıkma halkasının sıkılması gerekir.
  3. Medyayı tabak kuyusundan epire edin.
    NOT: Trabeküler meshwork, ASOC'ye pompalanan ortamdan sıvıyı filtreliyor. Bu nedenle, kenarlar boyunca ASOC çanasında medya mevcut olacaktır.
  4. Sıkışan hava kabarcıklarını gidermek için 3.7 ve 3.8 adımlarını yineleyin.
  5. Şırınna pompalarındaki şırınnaları yeniden doldurun, şırınna pompalarının çalıştığından emin olun ve perfüzyon için vanaların ASOC'ye hizalamasını onaylayın. ASOC çanasını 37 °C, %5 CO2 inkübatörüne geri verin.
    NOT: En iyi şekilde, bu adımlar günlük olarak gerçekleştirilmelidir. Bununla birlikte, 20 mL başlangıç ortamı hacmi, ASOC çanak kuyusu hacmi ve 2,5 μL / dk pompa oranı, sistemin birkaç gün boyunca bozulmadan çalışmasına izin vermek için yeterli olmalıdır.

6. Pnömatik güçlendirilmiş delinme cihazı ile OG yaralanma indüksiyonu

NOT: Pnömatik delinme cihazının yapımı Ek Protokol 3 'te ayrıntılı olarak yer unun. OG yaralanmaları, normalde kültürde 3 gün sonra ortaya çıkan Gİb stabilize edildikten sonra indüklenir. Kabul edilebilir Gİb değerleri, IOP veri dosyalarının değerlendirilmesi veya Basınç ölçüm sisteminde LED göstergelerinin ayarlanması ile belirlenebilen fizyolojik Gİb tabanlı 5-20 mmHg'dir Ek Protokol 2.

  1. BSC II kabinini, 1.10. Delinme platformunu basınçlı hava hattına bağlayın. Steril delinme nesnesini aynaya takın.
    NOT: Cihaza güç sağlamak için bir hava kompresörü kullanılabilir, ancak basınç 50 psi'den büyükse tank basınçlı hava veya dahili laboratuvar hatları yeterli olabilir.
  2. Çapı 4,5 mm'ye kadar olan nesneler üzerinde yeterli delinme kuvveti için delinme platformundaki basınç regülatörünü 50 psi'ye ayarlayın. Yaralanma indüksiyonu sırasında ASOC çanasını tutmak için çapraz izleme mengenesini laboratuvar jakının önüne delinme platformunun önüne yerleştirin.
  3. ASOC kurulumunu 37 °C'den,%5 CO 2 inkübatöründen çıkarın ve kapağı çıkarıp bir kenara yerleştirdikten sonra delinme platformuna(Şekil 2)dik çapraz izleme mengenesine yerleştirin. Ön segmenti perfüzyonda tutun, ancak dönüştürücünün aşırı basınç hasarını önlemek için 3 yönlü valf portunu basınç dönüştürücüye kapatın.
  4. Piston kolunu maksimum mesafesine kadar uzatın ve kornea tepesini delinme nesnesinin 1 mm'sine yerleştirin. Piston kolunu geri çek ve ön segmenti delinme nesnesine 1 cm yaklaştırın.
    NOT: Bu mesafe, ASOC çanaktan çarpmadan yüksek verimli yaralanma indüksiyonu için optimize edilmiştir.
  5. Delinme cihazını açarak ve cihazın ikinci anahtarıyla solenoid vanayı açarak ateşleyin. Cihazı geri çekmek için, ikinci düğmeye tekrar basarak delinme cihazını gözden çıkarın. Yaralanma bölgesinden sızan görsel inceleme ve ortam ile uygun yaralanma indüksiyonunu doğrulayın.
  6. ASOC kabını mengeneden çıkarın; kapağı tekrar bulaşık tertibatına yerleştirin ve akışkan hattı basınç dönüştürücüye açın. ASOC'yi tekrar 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
    NOT: Bu noktada, OG yaralanmalarının sızdırmazlık etkinliğini değerlendirmek için AS'ye terapötik uygulanabilir.

7. ASOC'nin kültürden çıkarılması

NOT: Uç nokta analizine bağlı olarak (olası uç nokta yöntemleri için Temsili Sonuçlar'a bakın), AS'nin ASOC kabında şişirilmiş olarak kalması gerekirken, diğer yöntemler kültür odasından izole edilmiş AS dokusu gerektirir. Aşağıdaki metodoloji, AS'nin organ kültürü yemeklerinden nasıl çıkarılacağını ve kurulumun geri kalanının nasıl kaldırılacağını açıklar.

  1. ASOC yemeklerini 37 °C, %5 CO2 inkübatöründen çıkarın. Şırınd ve hazneye giden 3 yönlü vanayı kapatın ve boruyu sistemden çıkarın. Şırınd, rezervuar ve filtreyi atın. 3 yönlü vanaları, boruları ve iğne göbeklerini yıkamak ve sterilize etmek için ayrı bir kaba yerleştirin.
  2. İğne göbeklerini kabın altındaki akışkan bağlantılardan ayırın. Akışkan konektörleri ve o-halkaları okuma. Tüm eşyaları yıkamak ve sterilize etmek için bir kaba yerleştirin.
  3. L tuşunu kullanarak dört vidayı sıkıştırma halkasından çıkarın. Sıkma halkasını dikkatlice çıkarın.
  4. As'ı eşak kullanarak, AS'yi çanaktan çıkarın ve uç nokta analizine ve görüntüye bağlı olarak, sabitleyici veya uygun biyolojik tehlike atıklarına yerleştirin.

8. Gİb veri analizi

  1. En son deneysel çalıştırmadan veri içeren .txt dosyasını kaldırmak için microSD kartı bir bilgisayara bağlayın.
    NOT: Dosya mikrodenetleyiciyi denetleyen kodda adlandırılır ve her deneme için güncelleştirilmelidir (bkz. Tamamlayıcı Protokol 2).
  2. Verileri elektronik tabloya alın.
  3. Verileri 12 sütun halinde düzenleyin: 11 basınç dönüştürücü kanalının her biri için zaman (en az) ve mV sinyali. İlk on kanal on ASOC deneysel kurulumuna karşılık gelir. Son dönüştürücü sinyali, giriş sinyalindeki değişiklikler nedeniyle mV sinyalinin değişmediğini onaylamak için kontrol kanalı olarak havaya açık bir sensör içindir. MV sinyalinin boyunca tutarlı olduğunu onaylamak için zamana karşı kontrol kanallarını çizin.
  4. Her sensörün ilk kalibrasyonundan oluşturulan eğim kesme denklemlerini kullanarak on kanal için mV sinyallerini mmHg'ye dönüştürün (bkz. Tamamlayıcı Protokol 4).
  5. Gİb'in deneysel zaman kursunda nasıl dalgalandığını belirlemek için on kanalın her birine karşı zamanı çizin (veri yorumlamayı basitleştirmek için günlere dönüştürün).
  6. OG yaralanma indüksiyonu öncesi ve sonrası değerleri her biri ile nasıl değiştirildikleri arasında daha kolay karşılaştırmak için verilerdeki önemli noktalarda ortalama Gİb değerlerini belirleyin. ASOC'nin her gününde Gİb'i belirlemek için her 24 saat aralığı için ortalama 2-3 h veri.
    NOT: Temsili Gİb sonuçları Şekil 4'te gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Optik Koherens Tomografi (OCT) ile çekilen görüntüler, başarılı bir yaralanma indüksiyonun nasıl göründüğünü göstermek için OG yaralı gözleri için gösterilir. Şekil 3, yaralanmadan hemen sonra ve 72 saat sonra kontrol ve OG yaralı AS dokusu için görüntüler göstermektedir. İki görünüm gösterilir: yaralanma bölgesinden kesitsel görüntüler ve görüntünün yüzey alanını görselleştirmek için yukarıdan aşağıya maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP'ler). Kontrol gözleri korneada gözle görülür bir bozul...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

ASOC OG yaralanma platformunda, metodolojiyi kullanırken başarı olasılığını artırmak için vurgulanması gereken kritik adımlar vardır. İlk olarak, ön segment diseksiyonu sırasında, trabeküler meshwork'ü korumak esastır, ancak doğru şekilde yapılması zordur. TM bozulursa, göz fizyolojik basıncı korumaz ve deneysel kullanım için uygunluk kriterlerini karşılamaz. Uygun diseksiyonlar elde edilene kadar ek aseptik teknik zorluklarının ortaya konması yerine, diseksiyon işleminin normal koşullarda uygulanması önerilir. İkincisi,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir. Bu makalede ifade edilen görüşler yazar(lar)ın görüşleridir ve ABD Ordusu Tıp Departmanı, Ordu Bakanlığı, Savunma Bakanlığı veya ABD Hükümeti'nin resmi politikasını veya konumunu yansıtmamaktadır.

Teşekkürler

Bu materyal, Geçici Kornea Onarım satın alma programı (Amerika Birleşik Devletleri Ordusu Tıbbi Materiel Geliştirme Ajansı) ile kurumlar arası bir anlaşma (#19-1006-IM) aracılığıyla Amerika Birleşik Devletleri Savunma Bakanlığı tarafından desteklenen çalışmalara dayanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10-32 Polikarbonat düz fiş, erkek dişli boru konektörüMcMaster-Carr51525K431
10-32 Soket kapaklı vida, ½ "McMaster-Carr92196A269
10 mL şırıngaBD302995
20 mL şırıngaBD302830
Anti-AntiGibco15240-096
Ball-End L anahtarıMcMaster-Carr5020A25
BetadineFisher ScientificNC1696484
BD  Intramedik  PE 160 BoruFisher Scientific14-170-12E
Pamuklu çubuklarPüriten25-8061WC
DMEM ortamıATCC30-2002
FBSATCC30-2020
İnce forsepsDünya Hassas Aletler15914
Gazlı BezCovidien8044
GentamisinGibco15710-064
GlutamaxGibco35050-061
Yüksek sıcaklık silikon O-ring, 2 mm genişlik, 4 mm IDMcMaster-Carr5233T47
Büyük forsepsDünya Hassas Aletler500365
Büyük cerrahi makasDünya Hassas Aletler503261
Orta dişli forsepsDünya Hassasiyeti Aletler501217
Çivi (delinme nesnesi)McMaster-Carr97808A503
Naylon şırınga filtreleriFisher09-719C
PBSGibco10010-023
Petri kabı (100 mm)FisherFB0875713
Polikarbonat, üç, erkek  luer  kilitFisherNC9593742
Tıraş bıçağıFisher12-640
Paslanmaz çelik 18 G  90 derece  açılı dağıtım iğnesiMcMaster-Carr75165A81
Paslanmaz çelik 18 G düz ve frak12; '’ dağıtım iğnesiMcMaster-Carr75165A675
Kapaklı steril 100 mL beherlerVWR15704-092
Vannas  makasDünya Hassas AletlerWP5070

Kaynaklar

  1. Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
  2. Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
  3. Riesberg, J., Powell, D., Loos, P. The loss of the golden hour. Special Warfare. , 49-51 (2017).
  4. Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
  5. Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
  6. Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954(2012).
  7. Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
  8. Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
  9. Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
  10. Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218(2020).
  11. Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98(2020).
  12. Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
  13. Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546(2021).
  14. Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
  15. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
  16. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  17. Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251(2018).
  18. Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
  19. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
  20. Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18(2021).
  21. Ren, H., Wilson, G. Apoptosis in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (6), 1017-1025 (1996).
  22. Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
  23. Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732(2020).
  24. Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
  25. Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
  26. Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
  27. Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
  28. Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496(2011).
  29. Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
  30. Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
  31. Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
  32. Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
  33. Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
  34. Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
  35. Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541(2013).
  36. Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
  37. Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
  38. Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
  39. Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

A k Globus YaralanmasTerap tik Performans Takibintraok ler Bas nKornea Epiteli Sa lPorcine G z ModeliOptik Koherens TomografisiDoku Canl lPonksiyon Yaralanmas nd ksiyonuBiyomalzeme Tedavileri
Açık Küre Yaralanmalarını ve Terapötik Performansı İzlemek için Ön Segment Organ Kültürü Platformu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.