Burada, merkezi sinir sistemindeki astrositlerin işlevselliğini ve nörolojik hastalık ve tedavilerde glial hücreleri içeren mekanizmaları incelemek için nöral benzeri dokuların biyofabrik olarak tanımlanması için 3D biyobaskı murine kortikal astrositlerin bir yöntemini rapor ediyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mühendislik Nöral Benzeri Dokular için Murine Kortikal Astrositlerin 3D Biyobaskı
Bu makalede
Özet
Özet
Astrositler, nöronal destek ve işlevsellik de dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminde (CNS) önemli bir role sahip glial hücrelerdir. Bu hücreler ayrıca sinirsel yaralanmalara yanıt verir ve dokuyu dejeneratif olaylardan korumak için hareket eder. Astrositlerin işlevselliğinin in vitro çalışmaları, bu tür olaylarda yer alan mekanizmaları aydınlatmak ve nörolojik bozuklukları tedavi etmek için tedaviler geliştirmeye katkıda bulunmak için önemlidir. Bu protokol, astrositler bakımından zengin sinir benzeri bir doku yapısını 3D biyobaskı astrosit yüklü biyoink ile biyofabrik hale getirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu çalışmada ekstrüzyon bazlı bir 3D biyobaskı kullanıldı ve C57Bl/6 fare yavrularının beyin kortikallerinden astrositler çıkarıldı. Biyoink, kortikal astrositlerin 3. 3D biyobaskı koşulları hücre stresini en aza indirerek, hücrelerin% 74.08'inin ±% 1.33'ünün biyobaskıdan hemen sonra uygulanabilir olduğu işlem sırasında astrositlerin yüksek canlılığına katkıda bulundu. 1 haftalık inkübasyondan sonra, astrositlerin canlılığı önemli ölçüde% 83.54'e ±% 3.00'e yükseldi ve bu da 3D yapının hücre büyümesi için uygun bir mikroçevrasyonu temsil ettiğini gösteriyor. Biyomalzeme bileşimi hücre bağlanmasına izin verdi ve astrositik davranışı uyardı, hücreler spesifik astrosit belirteci glial fibril asidik proteini (GFAP) ifade etti ve tipik astrositik morfolojiye sahip oldu. Bu tekrarlanabilir protokol, hücrelerin yerel mikroçevresine benzeyen astrositler bakımından zengin 3D sinir benzeri dokuyu biyofabrilleştirmek için değerli bir yöntem sağlar, astrositlerin işlevselliğini ve nörolojik hastalıklarda yer alan mekanizmalarla ilişkilerini anlamayı amaçlayan araştırmacılar için yararlıdır.
Giriş
Astrositler Merkezi Sinir Sistemi'ndeki (CNS) en bol hücre tipidir ve beyin homeostazında önemli bir rol oynar. Kalıcı nöronal desteğe ek olarak, astrositler nörotransmitter alımını modüle etmekten, kan-beyin bariyer bütünlüğünü korumaktan ve nöronal sinaptogenez1,2'yi düzenlemekten sorumludur. Astrositler ayrıca CNS iltihabında önemli bir role sahiptir, astrosit reaktivitesine veya reaktif astrogliosis3,4, dejeneratif ajanlara sağlıklı doku ekspozisyonlarını önleyen bir glial skar oluşturan bir süreçte beyindeki yaralanmalara yanıt verir
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanları içeren tüm prosedürler araştırmalarda hayvan kullanımı için uluslararası yönergelere uydu (http://www.iclas.org) ve Universidade Federal de São Paulo Araştırma Etik Komitesi (CEUA 2019/ 9292090519) tarafından onaylandı.
1. Farelerin beyin diseksiyonu
- 10 mL soğuk Hanks Tamponlu Tuz Çözeltisini (HBSS) 100 mm kültür yemeğine ve 1 mL'yi 1,5 mL mikrotüpe aktarın. Hayvan başına bir mikrotüp hazırlayın.
NOT: Hem kültür yemeğinin hem de mikrotüplerin buzda tutulması gerekir. - DMEM F12 + %10 Fetal Sığır Serumu (FBS), %2 glutamin ve %1 Penisilin-Streptomisidin (P/S) kullanarak astrosit kültür ortamını hazırlayın. 0,2 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışma, katman katman primer astrositler yüklü jelatin /GelMA/fibrinojen biyoink biriktirmek için 3D biyobaskı teknolojisini kullanarak sinir benzeri bir doku geliştirmeyi amaçlamaktadır. Astrositler, canlı bir 3D yapının biyofabrikasyonuna izin vererek biyomalzeme bileşimine eklenen fare yavrularının serebral korteksinden çıkarıldı ve izole edildi .
Bilgisayar destekli tasarım (CAD), besin maddelerinin ve oksijenin difüzyonunu kolaylaştırmayı amaçlayan, 1 mm'.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
3D biyobaskı teknolojisi, yapısal ve fizyolojik olarak doğal dokulara benzeyen rafine yapıların mühendisliğine izin veren bir biyofabrikasyon alternatifi olarak ortaya çıkmıştır22, beyindahil 23. Nöral benzeri dokuların biyofabrikasyonu, CNS11'ietkileyen birçok hastalığın gelişimi ve tedavisi ile ilişkili hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için önemli bir araç olan in vitro yerel mikroçevre modellemesine izin verir. Glial hücrelerin.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir ihtilafı yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma São Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP), 2018/23039-3 ve 2018/12605-8 hibe numaraları tarafından desteklendi; Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Gelişim Konseyi (CNPq), 465656/2014-5 ve 309679/2018-4 hibe numaraları; ve Yükseköğretim Personelinin İyileştirilmesi Koordinasyonu (CAPES), mali kod 001.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3D Biyoyazıcı | 3D Biyoteknoloji Çözümleri | Ekstrüzyon tabanlı biyoyazıcı | |
| Künt uçlu forseps | Integra Miltex | 6--30 | Beyin diseksiyonu için forseps önceden sterilize edilmiş |
| Sığır serum albümini | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Proteaz içermez, yağ asidi içermez, esasen globulin içermez |
| CaCl2< / sub> | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Hücre kültürü şişesi | Fisher Scientific | 156340 | Kültür şişesi T25 |
| Hücre süzgeci | Corning Incorporated | 352340 | Hücre süzgeci 40 ve mikro; m |
| Konfokal mikroskop | Leica | Konfokal TCS SP8 mikroskobu, Olympus FluoView 300 konfokal sistem ile birleştirilmiş | |
| Konik tüpler | Thermo Scientific | 339651, 339652 | 15 mL ve 50 mL'lik steril tüpler |
| DAPI | Abcam | ab224589 | DAPI boyama solüsyonu |
| DMEM/F12 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12500062 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco'nun Mod. Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Karışımı) L-glutamin |
| Dyalisis tüpü | Sigma-Aldrich | D9527 | Moleküler ağırlık kesme = 14 kDa |
| Etanol | Fisher Scientific | 64-15-5 | Reaktif sınıfı |
| Fetal Sığır Serumu | Gibco; Life Technologies Corporation | 12657011 | Araştırma Sınıfı |
| Fibrinojen | Sigma-Aldrich | 9001-32-5 | Sığır plazmasından Fibrinojen kristalin tozu |
| Jelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | Domuz derisinden jelatin tozu |
| Glisin | Sigma-Aldrich | 56-40-6 | Glisin tozu |
| Hanks Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS) | Gibco; Yaşam Teknolojileri A.Ş | . 14175095 | Kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol yok kırmızı |
| L-Glutamin | Sigma-Aldrich | 56-85-9 | L-Glutamin kristal toz |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin 1-2 mg / mL L 50 mM Tris-HCl |
| Canlı ölü kiti hücre görüntüleme kiti | Thermo Scientific | R37601 | Canlı hücrelerde yeşil floresan (ex/em 488 nm/515 nm). Ölü hücrelerde kırmızı floresan (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Metakrilik anhidrit | Sigma-Aldrich | 760-93-0 | GelMA hazırlama |
| mikrotüpleri | Corning Incorporated | MCT-150-C | 1,5 mL |
| NaCl | Mikrotüpleri Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| İğne 22G | Fisher Scientific | NC1362045 | Steril künt iğne |
| Çalıştırma makas | Integra Miltex | 05--02 | Beyin diseksiyonu için keskin makas önceden sterilize edilmiş |
| Paraformaldehit | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehit tozu |
| Penisilin / Streptomisin | Gibco; Life Technologies Corporation | 15070063 | Pen Strep (5.000 Ünite / mL Penisilin; 5.000 ug / mL Streptomisin) |
| Petri kabı | Corning Incorporated | 430591, 430588 | 35 ve 100 mm steril petri kapları |
| Phalloidin | Abcam | ab176753 | iFluor 488 reaktif |
| Foto başlatıcı Sigma-Aldrich | 106797-53-9 | 2-Hidroksi-4 ve prime;-(2-hidroksietoksi)-2- metilpropiyofenon | |
| Fosfat tampon salin (PBS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 10010023 | PBS 1 x, kültür sınıfı, kalsiyum yok, magnezyum yok |
| Poli-L-lizin | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Poli-L-lizin hidrobromür mol wt 30.000-70.000 |
| Birincil antobody | Abcam | ab4674 | Tavuk poliklonal - GFAP |
| İkincil antikor | Abcam | ab150176 | Alexa fluor 594 anti-tavuk |
| Spatula | Miltex | V973-70 | Numara 24 çimento spatula önceden sterilize edilmiş |
| Stereomikroskop | Fisherbrand | 3000038 | Beyin diseksiyonu için mikroskop |
| Şırınga 5 mL | BD | 1222C84 | Steril şırınga |
| Şırınga filtresi 2 ve mikro; m | Fisher Scientific | 09-740-105 | Sterilizasyon için polipropilen filtre |
| Trombin | Sigma-Aldrich | 9002--04-4 | Sığır plazmasından trombin kristalin tozu |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Laboratuvar sınıfı |
| Tripsin-EDTA | Gibco; Life Technologies Corporation | 15400054 | Tripsin fenol içermez, kırmızı 1 x PBS |
| Versene çözeltisi | Gibco'da seyreltilmiş; Life Technologies Corporation | 15040066 | litresi başına 0,2 g EDTA(Na4) olarak formüle edilmiş Versene Çözeltisi (0,48 mM) |
| Thermo Scientific | 144530 | Steril 24 oyuklu plaka |
Kaynaklar
- Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114(2019).
- Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
