Burada, hücre yığınlarında yetişen yapışan HEK 293 hücrelerini ve benzeşim kromatografisi saflaştırmayı kullanarak araştırma sınıfı AAV vektörlerinin büyük ölçekli üretimi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak >1 x 1013 vektör genomları /mL verir ve büyük hayvan çalışmaları için uygun vektör miktarları sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Büyük Hayvan Modellerinde Preklinik Çalışmalar İçin Hücre Yığınlarında Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Üretimi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörleri, insanlar için onaylanmış üç AAV gen tedavisi ile klinik olarak en gelişmiş gen tedavisi vektörleri arasındadır. AAV için yeni uygulamaların klinik ilerlemesi, fareler gibi küçük hayvan modellerinden köpekler, koyunlar ve insan olmayan primatlar da dahil olmak üzere daha büyük hayvan modellerine geçişi içerir. AAV'yi daha büyük hayvanlara uygulamanın sınırlamalarından biri, büyük miktarlarda yüksek titre virüsü gereksinimidir. Süspansiyon hücre kültürü AAV vektör üretimi için ölçeklenebilir bir yöntem olsa da, çok az araştırma laboratuvarı ekipmana (örneğin biyoreaktörler) sahiptir veya bu şekilde AAV'nin nasıl üretileceği hakkında bilir. Ayrıca, AAV titreleri süspansiyon HEK 293 hücrelerinde üretildiğinde, yapışan HEK293 hücrelerine kıyasla genellikle önemli ölçüde daha düşüktür. Burada açıklanan hücre yığınları kullanarak yüksek titre AAV büyük miktarlarda üretmek için bir yöntemdir. AAV'yi titretmeye yönelik ayrıntılı bir protokol ve vektör saflığını doğrulama yöntemleri de açıklanmıştır. Son olarak, bir koyun modelinde AAV aracılı transgene ekspresyonunun temsili sonuçları sunulmuştur. AAV vektörlerinin yapışan hücrelerde büyük ölçekli üretimi için optimize edilmiş bu protokol, moleküler biyoloji laboratuvarlarının yeni AAV tedavilerinin daha büyük hayvan modellerinde test edilmesini ilerletmesini sağlayacaktır.
Giriş
Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerini kullanan gen tedavisi son otuz yılda büyük adımlar attı1,2. Konjenital körlük, hemofili ve kas-iskelet sistemi ve merkezi sinir sistemi hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli genetik hastalıklarda ortaya konan gelişmeler, AAV gen tedavisini klinik araştırmalarda ön plana çıkarmıştır3,4. 2012 yılında, Avrupa İlaç Ajansı (EMA), LPL eksikliğinin tedavisi için lipoprotein lipazını (LPL) ifade eden bir AAV1 vektörü olan Glybera'yı onayladı ve avrupa veya Amerika BirleşikDevletleri'ndebir gen tedavisi tedavisi için ilk pazarlama izni 5 . O zamandan beri, iki ek AAV gen tedavisi, Luxturna6 ve Zolgensma7, FDA onayı aldı ve pazarın önümüzdeki 5 yıl içinde 20258'ekadar beklenen 10-20 gen tedavisi ile hızla genişlemesi bekleniyor. Mevcut klinik veriler, AAV gen tedavisinin güvenli, iyi tolere edilmiş ve etkili bir modalite olduğunu ve AAV'nin ClinicalTrials.gov kayıtlı 244'ün üzerinde klinik çalışma ile onu en umut verici viral vektörlerden biri haline getirdiğini göstermektedir. AAV vektörlerini içeren klinik uygulamalara artan ilgi, AAV tedavilerinin büyük hayvan modellerinde değerlendirilmesini kolaylaştırmak için sağlam ve ölçeklenebilir üretim yöntemleri gerektirir, çünkü bu çeviri boru hattında kritik bir adımdır9.
AAV vektör üretimi için iki temel gereklilik AAV genom ve kapsiddir. Vahşi tip (wt)-AAV'nin genomları, yaklaşık 4,7 kb uzunluğunda10olan tek iplikli DNA'dır. wt-AAV genom, ambalajlama için önemli olan genomun her iki ucunda bulunan ters terminal tekrarlarını (ITR'ler) ve rep ve cap genleriniiçerir 11. Genom replikasyonu, viral kapsid montajı ve genomun viral kapsid içine kapsüllenmesi için gerekli olan rep ve cap genleri viral genomdan çıkarılır ve AAV vektör üretimi için trans olarak sağlanır12. Bu genlerin viral genomdan çıkarılması, terapötik transgenlere ve promotör ve polyA sinyali de dahil olmak üzere gerekli tüm düzenleyici unsurlara yer sağlar. ITR'ler, uygun genom replikasyonu ve viral kapsülleme sağlamak için vektör genomunda kalır13,14. Transgene ekspresyonunun kinetiğini iyileştirmek için, AAV vektör genomları, AAV genom replikasyon sırasında tek iplikten çift iplikli DNA dönüşümüne dönüştürme ihtiyacını azaltan, ancak kodlama kapasitesini ~ 2.4 kb15'e düşüren kendi kendini tamamlayıcı olacak şekilde geliştirilebilir.
AAV genom tasarımının ötesinde, kapsid serotip seçimi AAV vektörün doku ve hücre tropizmini belirler in vivo2. Doku trompisine ek olarak, farklı AAV serotiplerinin farklı gen ekspresyasyonu kinetiği gösterdiği gösterilmiştir16. Örneğin, Zincarelli ve ark.17 farklı AAV serotiplerini düşük ekspresyon serotipleri (AAV2, 3, 4, 5), ılımlı ifade serotipleri (AAV1, 6, 8) ve yüksek ekspresyon serotipleri (AAV7 ve 9) olarak sınıflandırdı. Ayrıca AAV serotiplerini yavaş başlangıçlı ifade (AAV2, 3, 4, 5) veya hızlı başlangıçlı ifade (AAV1, 6, 7, 8 ve 9) olarak kategorize ettiler. Bu farklı tromizmler ve gen ekspresyasyonu kinetikleri kapsid proteinlerindeki amino asit varyasyonlarından, kapsid protein oluşumlarından ve konak hücre reseptörleri/ ko-reseptörleri ile etkileşimlerden kaynaklanmaktadır18. Bazı AAV kapsidleri, intravasküler uygulama (AAV9) sonrasında kan-beyin bariyerini geçme veya dayanıklı transgene ekspresyasyonu için uzun ömürlü kas hücrelerinde yaşama (AAV6, 6.2FF, 8 ve 9)19,20gibi ek faydalı özelliklere sahiptir.
Bu makale, klinik öncesi büyük hayvan modellerinde kullanılmak üzere yüksek saflıkta, yüksek titreli, araştırma sınıfı AAV vektörleri üretmek için uygun maliyetli bir yöntemi detaylandırmayı amaçlamaktadır. Bu protokol kullanılarak AAV üretimi, hücre yığınlarında yetişen yapışan insan embriyonik böbreği (HEK)293 hücreye çift plazmid transfeksiyon kullanılarak elde edilir. Ayrıca, çalışma, AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 ve DJ21,22 dahil olmak üzere heparin bağlayıcı alanlar içeren AAV serotipleri için kullanılabilen heparin sülfat benzeşim kromatografisi saflaştırma için bir protokol açıklanmaktadır.
AAV vektörlerinin üretimi için bir dizi paketleme sistemi mevcuttur. Bunlar arasında, iki plazmid eş transfeksiyon sistemlerinin kullanımı, Rep ve Cap genlerinin ve Reklam yardımcısı genlerinin (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 ve VA RNA) bir plazmid (pHelper) içinde bulunduğu, plazmid üretimi için azaltılmış maliyet de dahil olmak üzere ortak üç plazmid (üçlü) transfeksiyon yöntemine göre bazı pratik avantajlara sahiptir23,24 . Transgene ifade kasetini (pTransgene) içeren AAV genom plazmidi, ITR'ler tarafından kuşatılmalı ve uzunluğu ~4,7 kb'ı geçmemelidir. Vektör titresi ve saflık transeksiyon sırasında potansiyel sitotoksik etkiler nedeniyle transgeneden etkilenebilir. Vektör saflığının değerlendirilmesi burada açıklanmıştır. Her biri için 1 x 1013 vg/mL veren bu yöntem kullanılarak üretilen vektörler fare, hamster ve yumurta hayvan modellerinde değerlendirildi.
Tablo 1: Gerekli çözümlerin bileşimi. Protokol boyunca çeşitli çözümler için gereken bileşenlerin yüzdeleri ve hacimleri de dahil olmak üzere gerekli bilgiler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre yığınlarındaki HEK293 hücrelerinin çift plazmid transfeksiyon
- 37 °C'de ayarlanmış bir boncuk banyosunda hek293 hücrelerinin kriyo şişelerini çözün.
NOT: Soğuk sıcaklığın kaplama sırasında hücreleri şoklamamasını sağlamak için hücreler çözülürken, önceden ısınan komple DMEM ila 37 °C. Optimum büyüme ve transeksiyon verimliliği sağlamak için hücrelerin ideal olarak 20'den az düşük geçiş sayısına sahip olduğundan emin olun. Hücrelerin mikoplazma içermediğinin onaylı olduğundan emin olun. - Kriyo şişesinin içeriğini damla yönünde 10 mL önceden ısıtılmış komple DMEM içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
- Ortamı aspire edin ve ardından HEK293 hücrelerini önceden ısıtılmış 20 mL'lik komple DMEM'de yeniden biriktirin. Hücreleri 15 cm'lik bir plakada tohumlayın ve% 5 CO 2 ile 37 ° C'de kuluçkayayatırın.
- Hücre kültürü odasında tohumlama için hücreleri bir 15 cm plakadan üçe bölün.
- Hücreler % 80 birleştiğinde, ortamı aspire edin ve monolayer'ı bozmamak için plakayı 3 mL PBS ile hafifçe yıkayın. Ardından, PBS'yi aspire edin ve 3 mL tripsin ekleyin.
- Hücreler plakadan kaldırınceye kadar 37 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın ve plakaya 7 mL komple DMEM ekleyerek tripsin nötralize edin.
- Tüm ortamları ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj yaparak hücreleri peletlayın.
- Süpernatantı 15 mL tüpten epire edin ve hücre peletini 3 mL'lik komple DMEM'de yeniden süzülür. 20 mL komple DMEM içeren her 15 cm plakaya 1 mL ekleyin; hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın ve% 5 CO 2 ile 37 ° C'de kuluçkayayaslayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Küçük kemirgen modellerinden daha büyük hayvan modellerine ve nihai klinik uygulamaya çeviri, daha büyük hayvanları transdüze etmek ve terapötik etkiler elde etmek için gereken büyük miktarda AAV nedeniyle önemli bir zorluk ortaya sömektedir. Rasyonel olarak tasarlanmış AAV6.2FF kapsidinin transdüksiyon verimliliğini karşılaştırmak için, daha önce AAV63'ekıyasla murine kas hücrelerinde transdüksiyon verimliliğinde 101 kat artış gösterdi, fareler, hamsterlar ve kuzulara insan monoklonal antikorunu ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede açıklanan rekombinant AAV (rAAV) vektörlerinin üretimi, moleküler biyoloji araştırma laboratuvarlarının ve tesislerinin çoğunda bulunan ortak malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar kullanmaktadır. Bu makale, okuyucu tarafından yüksek kaliteli in vitro ve in vivo sınıf rAAV üretilmesini sağlar. Her şeyden önce, rAAV üretimi için bu protokol, sezyum klorür saflaştırmayı içeren daha sıkıcı protokollere kıyasla verimlidir ve ultrasantrifüj kullanımını önler. HEK293 hücreleri transfected edildikten...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Sarah K. Wootton, AAV6.2FF kapsid için US10806802B2 abd patenti üzerinde bir mucittir.
Teşekkürler
Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas ve Jacob G. E. Yates, Ontario Veteriner Koleji Öğrenci Burslarının yanı sıra Ontario Lisansüstü Bursları'nın da sahibiydi. Amira D. Rghei, Mitacs Accelerate Studentship'in alıcısıydı. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) Proje Hibesi (#66009) ve SKW'ye İşbirlikçi Sağlık Araştırma Projeleri (NSERC ortaklı) hibesi (#433339) tarafından finanse edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.22 μ m filtre | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| %0.25 Tripsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| 10 odacıklı hücre yığını | Corning | 3271 | |
| 1L PETG şişe | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| %30 Akrilamid/Bis Solüsyonu | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96 kuyulu etekli plaka | FroggaBio | FS-96 | |
| Yapışkan plaka contaları | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Amonyum persülfat (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| Kan ve Doku Temizleme Kiti | Qiagen | 69506 | Bromofenol mavisi Fisher Scientific B392-5 protokolünün 4.6 bölümünde DNA temizliği için kullanın |
| DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin | |||
| Hücre Kültürü Yemekleri | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plakalar |
| Kültür Konik Boru | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL konik tüp |
| Kültür Konik Boru | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL konik tüp |
| Dulbecco'nun 1000 mg/L D-glikoz, L-glutamin içeren Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) | Cytiva Yaşam Bilimleri | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrat | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Etanol | Greenfield | P016EA95 | Etil alkolü (%95 hacim) bölüm 3.7.4 için %20'ye ve bölüm 6.1.1.1 için %70'e seyreltin |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Buzlu asetik asit | Fisher Scientific | A38-500 | DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| Mg | |||
| 2+ ve Ca | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS ile Mg2+ ><< / sup> ve Ca / sup> | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 hücreleri | Amerikan Doku Kültürü Koleksiyonu | CRL-1573 | Aldıktan sonra, hücreleri ve kültürü üreticinin açıklamasına göre çözün. s protokolü. Hücreler minimum düzeyde geçtikten ve iyi bir şekilde büyüdükten sonra, gelecek için bir alt fraksiyonu alikotlarda dondurun ve sıvı nitrojen içinde saklayın. Her zaman 30 numaralı pasajın altındaki hücreleri kullanın. Kültürlenmiş hücreler 30 defadan fazla geçildikten sonra, depolanan alikotlardan bir kültürün yeniden başlatılması önerilir |
| HEK293 konak hücre proteini ELISA kiti | Cygnus Technologies | F650S | Üreticiyi takip edin s talimatları |
| Heparin sülfat sütunu | Cytiva Yaşam Bilimleri | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutamin (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Büyük Hacimli Santrifüj Tüpü Destek Yastığı | Corning | CLS431124 | Destek yastığı, santrifüj rotorunun uygun V-alt yastıklara sahip olması durumunda büyük hacimli santrifüj tüpleriyle kullanılmalıdır |
| Hacimli Santrifüj Tüpleri | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL santrifüj tüpleri |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Mikrosantrifüj tüpü | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü, kullanmadan önce sterilize edin |
| Moleküler Sınıf Su | Cytiva Yaşam Bilimleri | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu | Sigma Aldrich | L5125 | DİKKAT. Eldiven giyin |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, azaltılmış serum ortamı | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipetleri | Fisher Scientific | 13-678-20D | Kullanmadan önce sterilize edin |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Hücrelerde kullanım için 1x'e seyreltin |
| Penisilin-Streptomisin Çözeltisi | Cytiva Yaşam Bilimleri | SV30010 | |
| pHelper plazmid | De novo tasarım veya plazmit deposundan elde edilen | NA | |
| Pipet havzası | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Steril pipet havzaları satın alın |
| Polietilen glikol tert-oktilfenil eter (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | DİKKAT. Eldiven giyin |
| Polietilamin (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Üreticinin takipçisi olun 1 litrelik bir çözelti üretme talimatları. 0.22μ m filtre ve 4 derecede saklayın; C |
| Polipropilen yarı etekli PCR Plakası | FroggaBio | WS-96 | |
| Polisorbat 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | DİKKAT. Eldiven giyin |
| poliviniliden diflorür (PVDF) membran | Cytiva Yaşam Bilimleri | 10600023 | Manipüle etmek için forseps kullanın. Eldiven giyin. |
| Birincil antikor | Progen | 65158 | |
| Protein Merdiveni | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinaz K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pOrtanca plazmid | De novo tasarım veya plazmit deposundan elde edilen | NA | Bölüm 5.0'daki AAV titrasyonu ile uyumlu olması için genomda SV40 poliA içermelidir |
| Pompa hortumu | Cole-Parmer | RK-96440-14 | E1-E5 fraksiyonlarında boru uzunluğunu ve virüsün tutulmasını optimize |
| RQ1 Dnase 10 Reaksiyon Tamponu | Promega | M6101 | Bölüm 4.0'daki protokolde 10x konsantrasyonda kullanım |
| RQ1 Rnaz içermeyen Dnase | Promega | M6101 | |
| Örnek seyreltici | Cygnus Technologies | I700 | HEK293 konak hücre proteini ELISA kiti |
| ile kullanım için ayrıca satın alınmalıdırİkincil antikor, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Yağsız süt tozu | Oksoit | LP0033B | |
| Sodyum dodesil sülfat (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| Sodyum hidroksit (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 poliA astar probu | IDT | Sentez için IDT'den alıntı yapmak için Tablo X'teki sırayı kullanın | |
| Tetrametetilendiamin (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Tripan mavisi | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filtre | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Santrifüj 10K cihazı, hücre lizisi için 10000 moleküler ağırlık kesme |
| Evrensel Nükleazına | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Evrensel qPCR ana karışımı | NEB | M3003L | |
| Whatman Kağıt | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-merkaptoetanol | Fisher Scientific | 21985023 | DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| DİKKAT: Tehlikeli kimyasalların kullanımına ilişkin yönergeler için Malzeme Tablosuna bakın. |
Kaynaklar
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020).
- FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020).
- Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020).
- Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
- Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
- Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
- Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
- Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
- Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310(2013).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
- Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
- van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
- Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
- Liu, J., Moon, Y. -A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601(2019).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- dsDNA copy number calculator. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html (2021).
- qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html (2021).
- Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
- Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).
- Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
