Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümör Hücrelerinde Floks Alellerinin Ex vivo Ablasyonu ile Tümörigenezde Gen Fonksiyonlarının Tanımlanması

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62740

⸱

25 Ağustos 2021

 ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, 3Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

Bu makalede

Özet

Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli kaynaklı tümörlerde in vivo embriyonik öldürücü olan gen nakavtlarını gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz ve daha sonra nakavtın tümör büyümesi, proliferasyon, sağkalım, göç, invazyon ve transkriptom in vitro ve in vivo üzerindeki etkisini değerlendiriyoruz.

Özet

İnsan kanserlerinde anahtar proteinleri tam olarak hedef alan yeni ilaçların geliştirilmesi, kanser terapötiklerini temelden değiştirmektedir. Bununla birlikte, bu ilaçların kullanılabilmesi için önce, hedef proteinlerinin spesifik kanser türlerinde terapötik hedefler olarak doğrulanması gerekir. Bu doğrulama genellikle, genetiği değiştirilmiş bir fare (GEM) kanser modelinde aday terapötik hedefi kodlayan geni nakavt ederek ve bunun tümör büyümesi üzerindeki etkisinin ne olduğunu belirleyerek gerçekleştirilir. Ne yazık ki, geleneksel nakavtlarda embriyonik öldürücülük ve koşullu nakavtlarda mozaiklik gibi teknik konular genellikle bu yaklaşımı sınırlar. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, bir GEM modelinde üretilen malign periferik sinir kılıfı tümörlerinin (MPNST'ler) kısa süreli kültürlerinde ilgi çekici bir floks embriyonik ölümcül genin ablatasyonuna yönelik bir yaklaşım geliştirilmiştir.

Bu yazıda, uygun genotipe sahip bir fare modelinin nasıl oluşturulacağı, bu hayvanlardan kısa süreli tümör kültürlerinin nasıl türetileceği ve daha sonra Cre rekombinaz ve gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) eksprese eden adenoviral bir vektör kullanarak floklu embriyonik ölümcül genin nasıl ablate edileceği açıklanmaktadır. Daha sonra floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanılarak adenovirüs ile dönüştürülen hücrelerin saflaştırılması ve gen ablasyonunun hücresel proliferasyon, canlılık, transkriptom ve ortotopik allogreft büyümesi üzerindeki etkilerinin ölçülmesi detaylandırılır. Bu metodolojiler, terapötik hedefleri in vitro ve in vivo olarak tanımlamak ve doğrulamak için etkili ve genellenebilir bir yaklaşım sağlar. Bu yaklaşımlar aynı zamanda in vitro büyüme artefaktları azalmış düşük pasajlı tümör türevi hücrelerin yenilenebilir bir kaynağını sağlar. Bu, hedeflenen genin biyolojik rolünün, sekretomun aracılık ettiği göç, istila, metastaz ve hücreler arası iletişim gibi çeşitli biyolojik süreçlerde incelenmesini sağlar.

Giriş

Son yirmi yıldan önce, insan kanserlerinin tedavisi, DNA'ya zarar vererek veya DNA sentezini inhibe ederek hızla çoğalan hücresel popülasyonları geniş ölçüde hedef alan radyoterapi ve kemoterapötik ajanlara dayanıyordu. Bu yaklaşımlar kanser hücresi büyümesini inhibe etmesine rağmen, bağırsak epitel hücreleri ve saç folikülü hücreleri gibi normal hızla çoğalan hücre tipleri üzerinde zararlı yan etkileri de vardı. Daha yakın zamanlarda, kanser tedavisi, bireysel bir hastanın neoplazmının büyümesi için kritik öneme sahip sinyal yolaklarındaki proteinleri tam olarak hedef alan kemoterapötik ajanları kullanmaya başlamıştır. Genellikle "Hassas Tıp" olarak adlandırılan bu yaklaşım, monoklonal antikorların ve küçük moleküler inhibitörlerin sürekli genişleyen bir repertuarının geliştirilmesine yol açmıştır. Bu ajanlar, tümör hücrelerinin proliferasyonunu ve sağkalımını etkili bir şekilde inhibe ederken, konvansiyonel kemoterapötik ajanlar ve radyoterapi ile görülen normal hücre tipleri üzerindeki zararlı yan etkilerden kaçınır. İnsan kanserlerinin tedavisinde kullanılan monoklonal antikorlar en yaygın olarak büyüme faktörü reseptörleri 1 (örneğin, membranı kapsayan reseptör tirozin kinazların geniş ailesi) ve immün yanıt modülatörleri2 (örneğin, programlanmış hücre ölüm proteini 1, programlanmış ölümligandı 1) gibi hücre yüzey moleküllerini hedef alır. Küçük moleküler inhibitörler, hücre yüzey proteinlerini veya hücre içinde bulunan sinyal proteinlerini inhibe edebilir3. Bununla birlikte, bu yeni terapötik ajanları etkili bir şekilde kullanmak için, belirli bir kanserin, aday bir terapötik ajan tarafından hedeflenen moleküle bağımlı olduğu tespit edilmelidir.

Bu yeni terapötik ajanların daha odaklanmış etkileri olmasına rağmen, birçoğu hala birden fazla proteinin etkisini inhibe etmektedir. Ek olarak, belirli bir proteini hedeflemek için değişen etkinlik ve özgüllüğe sahip çoklu ajanlar sıklıkla mevcuttur. Sonuç olarak, klinik öncesi araştırmalar sırasında, bir aday proteini terapötik bir hedef olarak doğrulamak için genetik ablasyon gibi ek yaklaşımlar kullanmak akıllıca olacaktır. Bir proteini terapötik bir hedef olarak doğrulamak için özellikle yararlı bir yaklaşım, aday proteini kodlayan geni, spesifik kanser türünü geliştiren genetiği değiştirilmiş bir hayvan modelinde ablatmaktır. Bu yaklaşım, boş mutasyona sahip fareler (doğal bir mutasyon, genetiği değiştirilmiş bir boş mutasyon [bir "nakavt"] veya bir gen tuzağı tarafından tanıtılan boş bir mutasyon) mevcutsa ve fareler yetişkinliğe kadar yaşayabilirse, nispeten basit olabilir. Ne yazık ki, bu kriterleri karşılayan null mutasyona sahip fareler genellikle mevcut değildir, çünkü tipik olarak null mutasyon embriyonik olarak veya doğum sonrası yaşamın ilk günlerinde ölümle sonuçlanır. Bu durumda, tümör tipini geliştirmeye eğilimli fareler, bunun yerine, ilgilenilen genin kilit segmentlerinin loxP bölgeleri ("floksed") tarafından kuşatıldığı farelere geçebilir; bu, genin tümör hücrelerine Cre rekombinazını ifade eden bir transgen (koşullu nakavt) sokularak ablatlanmasına izin verir. Bu yaklaşım çeşitli avantajlar sağlar. İlk olarak, tümörde eksprese edilen, ancak geleneksel nakavtlarda ölüme yol açan hücre tipinde ifade edilmeyen bir Cre sürücüsü mevcutsa, bu yaklaşım potansiyel olarak aday terapötik hedefi doğrulayabilir. İkincisi, aday proteini tümör hücrelerinde kodlayan geni ablukaya almak, ancak tümörle ilişkili fibroblastlar veya bağışıklık hücreleri gibi diğer tümör içi elementlerde değil, araştırmacının terapötik hedefin hücre özerk ve hücre dışı özerk etkilerini ayırt etmesini sağlar. Son olarak, tamoksifen ile indüklenebilen bir Cre sürücüsü (CreERT2), araştırmacının tümör gelişiminde farklı aşamalarda ilgilendiği geni silmesine ve aday terapötik ajanın etkili olma ihtimalinin en yüksek olduğu pencereyi tanımlamasına izin verir.

Ne yazık ki, GEM modellerinde ortaya çıkan tümörlerde koşullu nakavt kullanımını sınırlayabilecek teknik sorunlar da vardır. Örneğin, tümör hücrelerinde eksprese edilen ve yaşam için gerekli olan normal hücrelerde gen delesyonunu önleyen bir Cre sürücüsü mevcut olmayabilir. Küçümsenebilecek bir başka konu, Cre ve CreERT2 sürücülerinin farelerde flokslu alelleri sıklıkla değişken bir şekilde ablate etmesi ve GEM kanserindeki boş mutasyon için mozaikçiliğe neden olmasıdır. Bu meydana geldiğinde, hedeflenen genin ablatlanmadığı tümör hücreleri hızla çoğalmaya devam edecek ve tümör hücrelerini ablatlanmış alellerle aşırı büyütecektir. Cre sürücü hatlarındaki mozaiklik, hedeflenen soyda her yerde bulunmayan Cre ekspresyonu ve Cre ekspresyonu4'ten bağımsız bireysel hücrelerde başarısız rekombinasyon nedeniyle ortaya çıkabilir. Bu, hücre tipine bağımlı olan ve deneysel tasarım ve veri yorumlama sırasında göz önünde bulundurulması gereken Cre sürücülerinin bilinen bir olgusudur. Mozaisizm, nakavtın etkisini maskeleyebilir ve bir araştırmacının, ilgilenilen genin tümör hücresi proliferasyonu ve / veya hayatta kalması için gerekli olmadığı ve dolayısıyla geçerli bir terapötik hedef olmadığı sonucuna varmasına neden olabilir.

Bu sorunların birçoğu, reseptör tirozin kinaz erbB4'ün MPNST hücrelerinde potansiyel bir terapötik hedef olup olmadığını belirlemeye çalışan önceki bir çalışmada karşılaşılmıştır5. Bu çalışmalarda, Schwann hücresine özgü miyelin proteini sıfır promotörünün (P 0-GGFβ3 fareleri) kontrolü altında nötregülin-1 (NRG1) izoform glial büyüme faktörü-β3'ü (GGFβ3) kodlayan bir transgeni ifade eden fareler kullanılmıştır. P 0-GGFβ3 fareleri, otozomal dominant tümör duyarlılık sendromu nörofibromatozis tip 1 (NF1)6 olan hastalarda görülen nörofibrom patogenezi ve pleksiform nörofibrom-MPNST progresyonu süreçlerini özetleyen bir süreçle MPNST olmaya ilerleyen multipleksiform nörofibromlar geliştirir. Trp53 null mutasyonlu farelere geçildiğinde, ortaya çıkan P 0-GGFβ3; Trp53+/- fareler, cis-Nf1+/-'de görüldüğü gibi MPNST'ler de novo geliştirir; Trp53+/- fareler.

Bu MPNST'ler, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) derece II'den insanlarda görülen DSÖ derece IV lezyonlarına ilerlemeyi özetlemektedir7. P 0-GGFβ3 farelerde, MPNST'ler trigeminal sinirde (% 58) ve spinal dorsal sinir köklerinde (% 68) önceden var olan pleksiform nörofibromlarda ortaya çıkar7; P 0-GGFβ3'te ortaya çıkan MPNST'ler; Trp53+/- fareler oldukça benzer bir dağılıma sahiptir. İnsanlarda, MPNST'ler en sık siyatik sinirde ortaya çıkar, bunu brakiyal pleksus, spinal sinir kökleri, vagus, femoral, medyan, sakral pleksus, popliteal obturator ve posterior tibial ve ulnar sinirlerizler 8. Bu GEM modellerindeki bu tümör dağılımı, insanlarda görülenlerden biraz farklıdır. Bununla birlikte, P 0-GGFβ3 ve P0-GGFβ3'te ortaya çıkan MPNST'ler; Trp53+/- fareler histolojik olarak insan MPNST'leri ile aynıdır, insan MPNST'lerinde görülen aynı mutasyonların çoğunu taşır ve NF1 hastalarında görülen nörofibrom-MPNST progresyon sürecini özetler. P 0-GGFβ3 veya P0-GGFβ3 üretimi; Trp53+/- Erbb4-/- olan fareler, iki Erbb4 null aleli olan fareler, kardiyak defektlere sekonder 10.5 embriyonik günde uteroda öldüğü için mümkün değildi9. Çünkü kalp-spesifik bir Erbb4 transgeni (α-miyozin ağır zinciri (MHC)-Erbb4) ekleyerek kalpteki Erbb4 ekspresyonunu kurtarmak, uygulanabilir Erbb4-/- fareler 10, karmaşık bir P 0-GGFβ3 ile farelerin oluşumu ile sonuçlanır; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotipi denendi.

Bununla birlikte, çiftleşmeler beklenen Mendel oranlarında fare üretmedi, bu da istenen genotipin zararlı olduğunu gösterdi. Bu nedenle, P 0-GGFβ3 üretimi; Trp53+/- Flokslanmış Erbb4 alelleri11 ve CreERT2 sürücüsü olan fareler, bu farelerde ortaya çıkan MPNST'lerde Erbb4'ün silinmesine izin vermeye çalışıldı. Bu hayvanlarda, bozulmamış Erbb4 alellerine sahip çok sayıda tümör hücresi hala mevcuttu (mozaiklik). Gözlenen mozaisizm, verimsiz tamoksifen dağıtımından kaynaklanabilir ve bu da doku içinde rekombinasyon etkinliğinde farklılıklara neden olabilir. Spontan kompansatör mekanizmaların olasılığı, Erbb4 ekspresyonu gereksinimini atlayarak tamoksifen aracılı rekombinasyonda mozaisizme daha fazla katkıda bulunabilir. Trp53 kaybının, tümör hücrelerini, verilerin yorumlanmasını karıştırabilecek ek spontan "izin verilen" mutasyonlara duyarlı hale getirmesi mümkündür. Erbb4-bozulmamış MPNST hücrelerinin diğer tümör hücrelerinde Erbb4'ün ablatlanmasının sonuçlarını maskelemesi muhtemel göründüğü için, bu yaklaşım terk edildi.

Bu engeller, Cre rekombinaz ve eGFP'yi eksprese eden bir adenovirüs kullanarak çok erken geçiş MPNST hücrelerinde Erbb4'ü ablatlamak için bir metodolojinin geliştirilmesine yol açtı. Bu hücreler, ablatlanmış Erbb4 geni için mozaisizmi belirgin şekilde azaltan FACS kullanılarak enfekte olmayan hücrelerden ayrılabilir. Aşağıda, bunu başarmak için kullanılan yöntemler, gen ablasyonunun in vitro ve in vivo etkilerini değerlendirmek için kullanılan yöntemlerle birlikte açıklanmaktadır. Aşağıdaki protokol, in vivo allogreft tümör büyüme değerlendirmesinden önce ex vivo eksizyon için ilgi çekici embriyonik ölümcül genlerin floklu alellerini taşıyan tümörleri veren tümör taşıyan farelerin nasıl üretileceğine bir örnektir. Bu, Erbb4 ablasyonunun tümör hücresi proliferasyonu, sağkalım ve gen ekspresyonu in vitro ve ortotopik allogreftlerde proliferasyon, sağkalım ve anjiyogenez üzerindeki etkisini analiz etmek için kullanılan yaklaşımların bir tanımını içerir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Farelerle herhangi bir prosedür gerçekleştirmeden önce, tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmeli ve onaylanmalıdır. Bu makalede açıklanan protokol, Güney Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, MUSC'nin kurumsal hayvan bakım yönergelerini izleyerek uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirilmiştir.

1. Erbb4 floks alelleri için MPNST'leri homozigot geliştiren farelerin üretimi

  1. F1 nesil P 0-GGFβ3'ü üretin; Trp53+/-; Erbb4fl/+ hayvanlar P 0-GGFβ3 çiftleşerek; Trp53+/- fareler7, Erbb4 fl/fl fareler11 ile. İstenilen P 0-GGFβ3 ile yeterli sayıda erkek ve dişi F1 yavrusu üretilmesini sağlamak için üreme şemasını yönlendirmek için bir Punnett karesi (Şekil 1) kullanın; Trp53+/-; Erbb4fl/+ genotip.
  2. Genotip F1 yavruları, IACUC kılavuzlarına uygun olarak toplanan bir kuyruk snipinden genomik DNA'yı izole ederek ve daha sonra P 0-GGFβ3 transgen 12, Trp53 vahşi tip (+) ve null (-) aleller7 ve Erbb4flox ve Erbb4 vahşi tip alelleri 13'ü tespit etmek için daha önce tarif edilen primerleri kullanarak PCR gerçekleştirir.
    1. jacks-lab.mit.edu/protocols ayrıntılı yöntemleri kullanarak kuyruk DNA'sını izole edin.
    2. PCR reaksiyonunu 25 ng DNA, 0,25 nM dNTP'ler, 0,02 U/μL Taq, her bir astarın 0,5 μM'si ve 1x PCR tamponu ile karıştırın. 1 dakika boyunca tek bir 95 °C inkübasyonla (genomik DNA'yı eritmek ve Taq'ı aktive etmek için) PCR reaksiyonunu gerçekleştirin ve ardından 94 °C, 10 s'lik 35 PCR döngüsü (erime); 55 °C, 30 s (tavlama); 72 °C, 40 s (uzatma) ve ardından 5 dakika boyunca tek bir 72 °C (uzatma). Reaksiyonları% 1.2-1.5'lik bir agaroz jeli üzerinde çalışmaya hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Tavlama sıcaklığı, kullanılan PCR tampon sistemine bağlıdır; uygun tavlama sıcaklığını belirlemek için bir tavlama sıcaklığı gradyanı yapılması önerilir.
  3. F2 nesil P 0-GGFβ3'ü üretin; Trp53+/-; Erbb4 fl/fl hayvanları uygun F1 soyunu çiftleştirerek (P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) birbirleriyle.
    NOT: Şekil 1 , istenen genotipe sahip beklenen F2 yavru sayısını hesaplamak için kullanılan Punnet kare tahminlerini göstermektedir.
  4. İstenilen P 0-GGFβ3 ile hayvanları tanımlayın; Trp53-/+; Adım 1.2'de açıklandığı gibi Erbb4 fl/fl genotipi.
  5. P 0-GGFβ3'ü korumak için F2 soyunu birbirine eşleyin; Trp53-/+; Erbb4fl / fl kolonisi ve genotipi tüm yavrular. Yeni tanıtılan floksed alelin sağkalım veya tümör gecikmesinden ödün vermediğini onaylayın. Bunu, P 0-GGFβ3'ün kohortlarını (20 fare / kohort) oluşturarak elde edin; Trp53+/- ve P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl fareleri ve hayatta kalma ve tümör oluşum sıklığını takip eder.
  6. Deneysel bitiş noktasına ulaşılana kadar hayvanları haftada birkaç kez izleyin (IACUC tarafından onaylanan izin verilen maksimum tümör boyutu/insancıl son nokta).
    1. Haftalık izleme sırasında, vücut ağırlığını, normal sosyal ve tımar davranışını ve tümör boyutu ölçümlerini değerlendirin. Vücut ağırlığının% >10'unun kilo kaybı, sosyal inzivaya çekilme ve kamburluk durumunda veteriner değerlendirmesi yapın.
    2. Tümör taşıyan bir fare tanımlandığında ve insancıl son noktasına ulaştığında, karbondioksit inhalasyonunu kullanarak hayvanı insancıl bir şekilde ötenazi yapın, ardından servikal çıkık ve bir neşter bıçağı kullanarak tümörü steril olarak çıkarın. Bir kumpas ve ağırlık tümörü (kütle ve hacim) kullanarak uzunluk, genişlik ve derinliği ölçerek tümör ölçümleri yapın. Otolizi önlemek için hızlı çalışın.
  7. Formalin fiksasyonu/parafin gömme (FFPE), erken pasaj kültürü üretimi ve flaş dondurulmuş materyal için doku segmentleri oluşturmak üzere steril koşullar altında neşter bıçağı ile ekmek somunu tarzı kesimler kullanılarak tümörü üç bölüme ayırın (Şekil 2A).
    1. Bölüm 1'in (erken pasaj kültürü üretimi için, adım 1.7.2) toplam tümör hacminin yaklaşık% 10'u, Bölüm 2'nin (fiksasyon ve IHC için, adım 1.7.3) toplam tümör hacminin% 70'i ve Bölüm 3'ün (flaş dondurma için, adım 1.7.4) toplam tümör hacminin% 20'si olduğundan emin olun.
    2. Erken geçiş kültürlerinin hazırlanması için tümörün 1. bölümünü alın (aşağıya bakınız).
    3. Tümörün 2. bölümünü 4 °C'de gece boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve daha sonra tanısal inceleme için parafin (formalin-sabit parafin-gömülü (FFPE) içine gömülün.
    4. Analitik analizler için flaş-dondurma bölüm 3 (örneğin; hedeflenen floksed gen tarafından kodlanan proteinin uygun şekilde ifade edildiğini doğrulamak için immünoblotlar).
  8. Nitelikli bir patolog tarafından tümör tanısını doğrulamak için hematoksilin ve eozin (H & E) içeren 5 μm kalınlığında FFPE doku kesitleri. Uygunsa, tümör tanısını doğrulamak için immünohistokimyasal boyama (IHC) uygulayın.
    1. S100 kalsiyum bağlayıcı protein B (S100β), nestin ve cinsiyet belirleyici bölge Y (SRY)-Kutu transkripsiyon faktörü 10 (Sox10) için immünostain MPNST'ler-hem MPNST'lerde hem de Schwann hücrelerinde (tümör hücresi kökeni) eksprese edilen üç belirteç5,6,14,15. Tümörleri, aşağı akış adımlarında ablasyon için hedeflenen gen tarafından kodlanan protein olan erbB4'ü tanıyan antikorlarla lekeleyin.
    2. Tanıyı doğrulamak için, nitelikli bir veteriner veya insan patologunun DSÖ tanı ve derecelendirme kriterleri5,6,7,16'yı takiben tüm lekeli tümör slaytlarını değerlendirmesini sağlayın.

2. MPNST hücrelerinde flokslanmış Erbb4 alellerinin ex-vivo ablasyonu

  1. Bölüm 1'deki (adım 1.7.3) dokuyu buz üzerinde 10 mL buz soğukluğunda steril fosfat tamponlu salin (PBS) içine yerleştirerek ve daha sonra steril bir çalışma alanına aktararak taze toplanan MPNST dokusundan erken geçiş kültürleri oluşturun (Şekil 2B)16.
    NOT: Sonraki tüm prosedürler steril doku kültürü başlığında gerçekleştirilmelidir.
  2. Tümör dokusunu 2-4 mm parçalara ayırın ve 10 mL büyüme ortamı ile 10cm2 ile tedavi edilmiş bir doku kültürü kabında 8-10 kez tritüre edin. Bu preparatları, 10 nM neuregulin-1β (NRG1β) ve 2 μM forskolin ile desteklenmiş% 10 fetal buzağı serumu,% 10 glutamin, 10 μg / mL streptomisin ve 10 IU / mL penisilin içeren yüksek glikozlu DMEM-10 büyüme ortamında (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) kültürleyin. Fibroblastlar gibi yaygın kirletici hücre tiplerinin büyümesini engellemek için bu aşamada forskolin ekleyin.
  3. Erken geçiş kültürü oluşturmak için mekanik olarak ayrışmış doku ve hücreleri 37 ° C'de 3 güne kadar% 5 CO2 atmosferinde tutun. Bu noktada dağılmış hücreleri ve kalan doku parçalarını ayırmayın.
  4. Her 3-4 günde bir yeni ortamla kültürleri yenileyin. Tümör hücrelerinin birleşene kadar çoğalmasına izin verin.
  5. Akıcı kültürleri çeşitli yemeklere bölerek erken geçiş kültürlerini genişletin. Büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri 1x dPBS ile yıkayın. Daha sonra, 10 cm2 işlenmiş hücre kültürü kabı başına oda sıcaklığında 2-5 dakika boyunca 1 mL%0.25 tripsin ekleyin. Ayrılmayı kolaylaştırmak ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için kültürü yavaşça tritüre edin.
    1. 2 mL DMEM-10 büyüme ortamı ekleyerek tripsinizasyonu sonlandırın. Tripsinizli hücre karışımını toplayın ve 5 mL steril santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 500 × g'da 5 dakika santrifüjleme ile toplayın.
    2. Hücre peletini 5 mL DMEM-10 içinde yeniden askıya alın. Hücreleri, her biri 10 mL büyüme ortamı içeren iki ila dört adet 10 cm'lik hücre kültürü kabına bölün (çanak başına yaklaşık 1 × 106 hücre).
  6. 5 pasajdan sonra (2.5'te tekrarlanan adımlar), NRG1β ve forskolin olmadan büyüme ortamı kullanın. Kültürün yalnızca tümör hücrelerinden oluştuğunu doğrulamak için bir anti-S100β antikoru ile kültürün bir örneğini immünostain. Hücreleri sonraki tüm pasajlarda DMEM-10 büyüme ortamında tutun.
  7. Bir sonraki pasajda, hücreleri sayın ve P 0-GGFβ3'ün bir kısmını dondurun; Trp53+/-; Akıcı kültürlerden toplanan Erbb4fl / fl MPNST hücreleri (3 × 106 hücre / şişe).
  8. Plaka P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl erken geçiş MPNST hücreleri, DMEM-10 büyüme ortamında 10 cm işlenmiş hücre kültürü kabı başına 1.5 × 106 hücre yoğunluğunda.
  9.  0. Gün: (Kaplamadan yaklaşık 12-16 saat sonra), yapışkan kültürleri 2-4 mL dPBS ile yıkayın ve 10 mL serumsuz DMEM'de yaklaşık 400 plak oluşturan birimde (pfu) / hücrede Ad5CMV-Cre / eGFP veya Ad5CMV-eGFP ile enfekte edin (yani, 10 cm kabında 2 × 10 10 pfu'nun30 μL'si). Adenovirüsü kullanarak flokslu Erbb4 alellerini, ampirik olarak belirlenen maksimum tolere edilen virüs konsantrasyonunda (enfeksiyon çokluğu, MOI) abartın. Bu ablasyon için iş akışının şeması için Şekil 2C'ye bakın.
  10. 1. Gün: Yaklaşık 16 saat sonra, enfeksiyon kokteyline 10 mL DMEM-10 ekleyerek kültürleri kurtarın.
  11. 2. Gün - 3: FACS, enfeksiyondan yaklaşık 48 saat sonra eGFP-pozitif hücreleri sıralamak için çekirdek tesisten önerilen protokolü izleyerek enfekte olmuş hücreleri sıralar. FACS sıralamadan önce, kültürlerin verimli bir şekilde enfekte olduğundan emin olmak için bir floresan mikroskobunda eGFP sinyali için hücreleri kısaca kontrol edin (~% 50-100 pozitif hücreler). FACS'tan sonra geri kazanılan hücreleri 10 cm'lik doku kültürü kaplarına geri döndürmek; genomik DNA izolasyonu için bir çanak ayırın.
  12. 4. - 5. Gün: FACS sıralamadan sonra, hücrelerin bir doku kültürü inkübatöründe en az 24-48 saat iyileşmesine izin verin ve daha sonra hücreleri in vitro hücre bazlı analizler veya in vivo aşılama için hazırlayın. Sıralanmış eGFP-pozitif hücrelerin bir kısmından izole edilen genomik DNA'yı kullanarak PCR yoluyla Erbb4 delesyonunu onaylayın. eGFP-pozitif hücrelerin PCR ile veya kültürün bir örneğini bir anti-erbB4 antikoru ile immünoboyayarak ErbB4-negatif olduğunu doğrulayın.
    1. Standart asit-guanidinyum-fenol ve kloroform bazlı DNA izolasyon yöntemi17 kullanarak genomik DNA'yı hücrelerden izole edin.
    2. Flokslanmış Erbb4 alellerini ve ablatlanmış Erbb4 alellerini ayırt etmek için standart PCR gerçekleştirin. 250 bp Erbb4-null ürün ve 350 bp flokslanmış ürün 13 üretmek için 2 ng DNA, 20 μM primer1 + 2 ile 40 döngü gerçekleştirin. Güvenilir bir antikor bulunmadığında nakavtı doğrulamak için hem PCR hem de antikor tabanlı yaklaşımlar uygulayın.
      NOT: Hücreler aşağıda açıklandığı gibi in vitro hücre bazlı tahliller için hazırdır. Bu şekilde hazırlanan hücrelerle birçok aşağı akış analizi yapılabilir. Aşağıda sunulan protokollerin amacı, Erbb4 geninin ablasyonu sonrası bu tümör hücrelerinin in vitro ve in vivo uygulamalarına birkaç örnek sunmaktır.

3. Ablatlanmış Erbb4 alelleri olan MPNST hücrelerinde proliferasyon ve canlılık testleri

  1. Önümüzdeki yedi gün boyunca, görüntü tabanlı otomatik bir sitometre kullanarak çok kuyulu bir plakaya kaplanmış sıralanmış MPNST hücreleri üzerinde proliferasyon testleri yapın.
    1. 6. Gün: 96 kuyucuklu bir plakada 150 μL (~ 13.300 hücre / mL) büyüme ortamının son hacminde kuyu başına 2.000 hücre plakası. Her deneysel kohort ve 4 günlük son nokta okuması için üçlü ölçümler yapın (3 kopya x 2 koşul x 4 gün).
    2. 7, 9, 11, 13. günler: Hoechst ve propidium iyodür (PI) boyalı leke hücreleri ve her bir kuyucuktaki canlı ve ölü hücrelerin sayısını saymak için bunları otomatik bir plaka okuyucuda görüntüleyin. Bunu başarmak için, hücreleri aynı anda hem canlı hem de ölü hücrelerin çekirdeklerini boyamak için Hoechst boyasıyla ve ölü hücreleri etiketlemek için propidyum iyodür (PI) ile boyayın. Tüm okumaları her gün veya her gün aynı saatte gerçekleştirin.
      1. O gün nicelleştirilmiş her kuyuya 50 μL 4x PI/Hoechst boyama çözeltisi (her biri 4 μg/mL) ekleyin (örneğin, sadece 7. Gün) ve doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı ışıktan koruyun.
        NOT: Hoechst'in boyama konsantrasyonunun ampirik olarak belirlenmesi gerekir ve hücre tipine bağlı olarak 1 ila 10 μg / mL arasında değişebilir.
      2. Otomatik hücre görüntüleyici üzerindeki uygun floresan kanalı kullanarak inkübasyondan sonra lekeli kuyucukları okuyun. Okuduktan sonra, sonraki günlerde gelecekteki okumalar için plakayı inkübatöre iade edin (örneğin, Gün 9, 11, 13).
      3. Kullanılan görüntüleme sistemine dayanarak boyama yoğunluklarını ölçün ve aşağıdaki ayarları kullanarak ölü hücrelerin, canlı hücrelerin ve toplam hücrelerin sayısını hesaplayın: mavi kanal (377/50 nm, Hoechst): toplam hücreler (canlı ve ölü); kırmızı kanal (531/40 nm, PI): sadece ölü hücreler; mavi - kırmızı (toplam - ölü) = canlı hücreler.
  2. İstenirse, tahlil üreticilerinin protokolünü izleyerek hücre canlılığı testini üç gün boyunca gerçekleştirin.
    NOT: Canlılık testleri, kalsein (488/32 nm; yeşil kanal, özellikle canlı hücreleri etiketler), PI ve Hoechst dahil olmak üzere üçlü bir leke gerçekleştirilerek proliferasyon testleri ile birleştirilebilir. Bir apoptoz testi, yukarıda tarif edildiği gibi ayarlanmış kültürler kullanılarak da yapılabilir; spesifik protokol görüntüleme sistemine bağlı olacaktır.
    1. 6. Gün: Üçlü olarak 96 delikli bir plakada 150 μL'lik son hacimde kuyu başına 4.000 hücre plakası.
    2. 7 - 9. Günler: 2.000x biyolüminesan hücre canlılığı testi reaktifleri (Malzeme Tablosu) ekleyin, plakayı inkübatöre geri döndürün ve plakayı 1 saat sonra okuyun. Sonraki okumaları her gün aynı saatte gerçekleştirin. Biyolüminesans (MTT) testleri için, bir luminometre plaka okuyucu kullanarak tahlili tam olarak üreticinin talimatlarında belirtildiği gibi 72 saat boyunca her 24 saatte bir yapın.

4. RNA-Seq analizleri ve ekspresyonu Erbb4 kaybı ile değiştirilen genlerin tanımlanması

  1. 6. Gün: Standart asit-guanidinyum-fenol ve kloroform bazlı yöntemler kullanarak toplam RNA'yı sıralanmış MPNST hücrelerinden izole edin. İki kohort arasındaki mRNA seviyelerindeki değişiklikleri tespit etmek için tasarlanmış deneyler için, her kohorttaki en az üç biyolojik replikasyondan toplam RNA hazırlayın.
    1. Erbb4 kaybı yerine adenoviral vektör veya eGFP ekspresyonunun neden olduğu olayları ortadan kaldırmak için, RNA'yı P 0-GGFβ3'ün üç biyolojik replikasyonundan izole edin; Trp53+/-; Ad5CMV-Cre/eGFP ile dönüştürülen Erbb4fl/fl MPNST hücreleri ve Ad5CMV-eGFP ile dönüştürülen üç biyolojik replika.
      NOT: İzole RNA, RNA-Seq analizi için 8 ≥ RNA bütünlük numarası (RIN) skoruna sahip olmalıdır. Kitaplıkları oluşturmadan önce sıralama çekirdeğinin tüm örneklerin RIN'ini belirlediğinden emin olun.
  2. RNA-Seq kütüphanelerini hazırlamak için her numuneden 100-200 ng yüksek kaliteli toplam RNA kullanın (bu adım için çekirdek dizileme tesisi ile çalışın). Yeni nesil DNA sıralayıcısı kullanarak yüksek verimli dizileme gerçekleştirin. mRNA nicelemesi için, Fastq dosyaları oluşturmak üzere tek uçlu dizileme gerçekleştirin. Her numune için en az 50 milyon okuma yapıldığından emin olun.
    NOT: RNA-Seq verilerini işlemek ve farklı şekilde ifade edilen transkriptlerin ekspresyonunu ölçmek için kullanılan iş akışını gösteren bir şematik için Şekil 3'e bakınız. Fastq dosyaları biçimindeki sıra verileri kalite kontrol prosedürlerine tabi tutulur; >80% 'i, sonraki analizler için uygun görülmesi için 30'luk bir Phred puanı vermelidir. Diziler ayrıca adaptör dizilerini kaldırmak ve düşük kaliteli okumaları filtrelemek için Trimmomatic18 kullanılarak önceden işlenir (kırpılır).
  3. Herhangi bir yetenekli yazılım programını (örneğin, DNAStar 19,20 veya Partek21) kullanarak fastq tarafından oluşturulan dosyalar üzerinde RNA-Seq hizalaması ve analizi gerçekleştirin. Fastq dosyalarını fare referans genomuna (GRCm38/mm10) hizalamak için varsayılan ayarları kullanarak programa özgü adımları izleyin.
    NOT: DNAStar'ı örnek olarak kullanarak, genel iş akışı aşağıda açıklanmıştır (Ek Şekil 1).
    1. RNA-Seq analiz yöntemini seçin.
    2. Referans genomu seçin, Fare.
    3. Sıralama çekirdeği tarafından sağlanmışsa BED dosyasını yükleyin.
    4. Fastq sıralama dosyalarını karşıya yükleyin ve onlara benzersiz çoğaltma adları atayın.
    5. Fast q dosyalarını gruplayın ve bunları bir çoğaltma kümesine (örneğin, GFP, CRE) atayın.
      NOT: Her hizalama programının kendine özgü adımları vardır ve kullanıcının programa özgü protokol için program kullanım kılavuzuna başvurması gerekir. Program daha sonra bu Fastq dosyalarından gene özgü ham sayım verileri üretecektir.
  4. Kontrol veri seti olarak Ad5CMV-eGFP örnek seti ve güçlü istatistiksel güç 22,23 ile diferansiyel gen ekspresyon sinyallerini tanımlamak için test veri seti olarak Ad5CMV-Cre seti ile 4.3'te açıklandığı gibi herhangi bir yetenekli yazılım programını kullanarak ham sayım verileri üzerinde istatistiksel ve normalizasyon analizi (DESeq2, EdgeR) gerçekleştirin.
    1. Kontrol veri kümesi olarak GFP fastq dosyalarını seçin.
    2. İstatistiksel ve normalleştirme yöntemi olarak DESeq2'yi seçin.
    3. Montaj ve analize başlayın.
      NOT: Her hizalama programının kendine özgü adımları vardır ve kullanıcının programa özgü protokol için program kullanım kılavuzuna başvurması gerekir. Program daha sonra bu Fastq dosyalarından gene özgü ham sayım verileri üretecektir. İstatistiksel ve normalleştirme analizi, buradaki örnekte gösterildiği gibi, dizi hizalama protokolü içinde birçok programda yerleşik bir adımdır. Bu sonraki yerleşik adımı sunmayan alternatif bir dizi hizalama yazılımı programı kullanılıyorsa, Bioconductor.org ücretsiz olarak indirilebilen R ile yazılmış DESeq2 veya EdgeR kodlama paketlerini kullanarak terminal düzeyinde ham sayım verileri üzerinde istatistiksel ve normalleştirme analizi gerçekleştirin.
  5. Kontrole göre en az 1,5 kat artış veya azalmayı temsil eden değişiklikleri tanımlamak için bu yaklaşımları kullanın (bu durumda, Ad5CMV-eGFP virüsü ile dönüştürülen hücreler). Daha sonraki fonksiyonel zenginleştirme analizi için yalnızca istatistiksel olarak anlamlı olduğu belirlenen ve ≥1.5 kat değişiklik ve p-değeri 0.05 veya padj 0.1 gösteren diferansiyel olarak eksprese edilen genleri (DEG'ler) kullanın.
    NOT: Bu, fonksiyonel zenginleştirme analizi için DEG genlerinin ve istatistiksel güçlerinin bir listesini oluşturacaktır.
  6. Serbestçe kullanılabilen web tabanlı araçlardan herhangi birini kullanarak, 4.4'te tanımlanan istatistiksel olarak anlamlı Erbb4 aracılı DEG üzerinde, sıralanmış bir gen listesi dosyasıyla fonksiyonel zenginleştirme analizi yapın. Bu açık erişimli fonksiyonel zenginleştirme analiz araçlarına entegre edilmiş gen ontolojisi veri kümeleri aracılığıyla Erbb4 gen kaybının biyolojik ve yol önemini belirleyin24,25,26,27 (örnekler için Malzeme Tablosuna ve Panther kullanan örnek bir iş akışı için Şekil 3'e bakınız).
    1. Adım 4.4'te elde edilen verileri elektronik tablo olarak dışa aktarın.
    2. Verileri log2 kat değişimine, p/padj değerine veya her ikisine göre sıralayın.
    3. İstatistiksel olarak anlamlı olmayan tüm verileri kaldırdığınızdan emin olun.
    4. Sıralanmış gen listesini gen kimliği ile yalnızca .txt dosyası olarak dışa aktarın ve web sitesine yükleyin.
      NOT: log2 kat değişiklikleri (en yüksekten en düşüğe), p/padj değerlerini (en düşükten en yükseğe) veya her ikisini birden [(-log10(pval)*sign(log2FC)] kullanarak sıralanmış bir giriş gen listesi oluşturmak için yalnızca istatistiksel olarak anlamlı DEG (sırasıyla 0,05 veya 0,1 < p/padj değerleri) kullanın. Sıralanmış bir gen listesi oluşturmak için çeşitli yaklaşımlar vardır ve veri kümesi ve sorulan soru için ampirik olarak belirlenir. Kullanılan spesifik fonksiyonel zenginleştirme analiz aracı türü, uygun rütbe gen listesinin belirlenmesinde de yardımcı olabilir. RNA-Seq hakkında ek kaynaklar için, aşağıdakimakalelere bakınız 28,29,30.

5. MPNST hücrelerinin ablatlanmış Erbb4 alelleri ile ortotopik allogreftlenmesi ve Erbb4 ablasyonunun etkilerinin analizi

  1. Sıralanmış MPNST hücrelerinin ortotopik tahsiftini yapmadan önce, tüm prosedürlerin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirildiğinden ve onaylandığından ve tüm prosedürlerin uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirildiğinden emin olun.
  2. Enjeksiyon gününde, enzimatik olmayan bir hücre ayrışma çözeltisi (örneğin, şelatörlerin bir karışımı; Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak hücre kültürü plakalarından veya şişelerinden düşük geçişli hücreleri (yaklaşık% 85 akıcılık) çıkarın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Siyatik sinire ortopik enjeksiyonlar için, DMEM-1031'de hücreleri 16.667 hücre / mL'de (her hayvan için 3 μL başına 50.000 hücre) yeniden oluşturun. Hücreleri buz üzerinde tutun.
    NOT: Bazı kültürler, hücreler düşük büyüme faktörlü bazal membran matrisine enjekte edilmedikçe greftleri başarılı bir şekilde oluşturamazlar. Bir bazal membran matrisi gereksinimi (% 10-50) ampirik olarak belirlenmelidir.
  3. MPNST hücrelerini 8-10 anestezik Hsd'nin siyatik sinirine enjekte ederek enfekte sonrası hücrelerde in vivo allogreft büyüme potansiyelini değerlendirin: Kohort başına Atimik Çıplak-Foxn1nu fareler (4-8 haftalık). Tümör hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu için Turk ve ark. 31'e bakınız. Burada deri altı enjeksiyonu gösterilmiştir.
    NOT: İstatistiksel anlamlılık için gereken deney hayvanlarının sayısını belirlemek için, bir biyoistatistikçiye danışın veya serbestçe kullanılabilen bir yazılım olan G*Power3'ün kullanılması önerilir32.
  4. Herhangi bir ağrı belirtisi için enjeksiyondan sonraki ilk hafta boyunca hayvanları günde iki kez yakından izleyin. Bundan sonra, kumpas ölçümleri için aşılanmış fareleri haftada üç kez izleyin ve daha önce 5,31'de açıklandığı gibi vücut durumu skorlarını (BCS'ler) değerlendirin. IACUC kılavuzlarında belirtildiği gibi, BCS'si 2 veya daha az olan hayvanları ötenazi yapın.
  5. Aşılanmış hücreler farklı oranlarda büyüdükçe, bu bölümde açıklanan deneyleri yapmadan önce kontrol (değiştirilmemiş) hücreleri kullanarak greft sürelerini ampirik olarak belirleyin. Greftleri deneysel son noktada toplamak için, karbondioksit inhalasyonunu kullanarak fareleri insancıl bir şekilde ötenazi yapın ve ardından ikincil bir önlem olarak servikal çıkığı izleyin. Her greftin son hacim ve kütle ölçümlerini kaydedin.
    NOT: Değiştirilmemiş P 0-GGFβ3 olarak; Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST hücreleri tipik olarak 30-45 gün içinde IACUC tarafından izin verilen maksimum boyuta ulaşır, tipik bir zaman çizelgesi enjeksiyondan yaklaşık 30-45 gün sonradır.
  6. Adım 1.6-1.8'de açıklandığı gibi dokuyu izole edin ve kesitleyin. Greft dokusunun bir kısmını gece boyunca% 4 paraformaldehit (Şekil 2) içinde sabitleyin ve daha sonra parafin içine yerleştirin. FFPE dokusundan 5 μm kesitler hazırlayın ve bunları slaytlara monte edin. Greft dokusunun 1.8.1'de açıklandığı gibi tümör hücrelerinden oluştuğunu doğrulamak için H & E boyama ve diğer gerekli immün boyama işlemlerini gerçekleştirin. Erbb4 ekspresyonunun kaybını doğrulamak ve Erbb4 kaybının diğer Erbb ailesi üyelerinin ekspresyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek gibi aşağı akış analizleri için tümör dokusunun geri kalanını anında dondurun.
    NOT: Greft dokusundaki tümör hücrelerinin doğrulanması yapılmalıdır, çünkü immün yetmezlikli fareler neoplazmlar geliştirmeye eğilimlidir. Küçük greftler söz konusu olduğunda, skar dokusunun veya inflamasyonun bir neoplazm ile karıştırılmamasını sağlamak önemlidir.
    1. Ad5CMV-eGFP ve Ad5CMV-Cre/eGFP ile tedavi edilen hücrelerden yetiştirilen allogreftlerde ilgi çekici proteinlerin ekspresyonunu karşılaştırmak için FFPE dokusunda standart IHC boyama işlemini gerçekleştirin. İki deney koşulu arasındaki in vivo erbB4 ekspresyonundaki farklılıkları doğrulamak için erbB4'e özgü antikorlar kullanarak eksize edilen greft dokusunu lekeleyin. Ki67 boyama yoluyla proliferatif indeksi ve terminal deoksinükleotidil transferaz aracılı dUTP nick-end etiketleme (TUNEL) boyama yoluyla apoptoz seviyesini belirleyin.
      NOT: İlgilenilen herhangi bir protein hedefi IHC ile de değerlendirilebilir. Örneğin, gen ablasyonunun aracılık ettiği in vivo vasküler mikroçevre farklılıklarını belirlemek için allogreftleri bir anti-CD31 antikoru (1:50 seyreltme) ile immün boyayarak vasküler yoğunluğu değerlendirin. 40x alan başına vasküler profil sayısı niceleme için sayılabilir. Bu IHC tabanlı testler için, boyama prosedürleri için standart IHC protokollerini ve üreticinin TUNEL boyama protokolünü izleyin. Görüntülerin niceliğini belirlemek için ImageJ eklentisi "tek renkli görüntünün otomatik sayımı" eklentisini kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 4, P 0-GGFβ3'ü dönüştürürken elde edilen tipik bir sonucu göstermektedir; Trp53-/+; Ad5CMV-eGFP adenovirüsü veya Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirüsü ile Erbb4fl/fl MPNST hücreleri (Şekil 4A). Kültürler, eGFP eksprese eden hücreleri tanımlamak için floresan mikroskobu ile ve aynı alanda bulunan toplam hücre sayısını 10x (üstte) ve 40x'te (altta) belirlemek için faz-kontrast mikroskobu ile incelenir. İstenirse, eGFP...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan ayrıntılı yöntemler, MPNST'lerin GEM modeli kullanılarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, ilgilenilen tümör dokusu bireysel hücrelere dağılabilirse, bu metodolojiler GEM'lerde ortaya çıkan çeşitli tümör tipleri için kolayca uyarlanabilir. Floksed alelin i) tümörleri taramak için yeterli fareler elde etmeyi zorlaştırabilecek sağkalımın azalmasına veya ii) yeterli tümör taşıyan farelerin elde edilmesini zorlaştırabilecek tümör gecikmesinin artmasına neden olmadığından emin olmak önemlidir. Eğer floksed al...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü (R01 NS048353, R01 NS109655), Ulusal Kanser Enstitüsü (R01 CA122804), Savunma Bakanlığı (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 ve W81XWH-15-1-0193) ve Çocuk Tümörü Vakfı (2014-04-001 ve 2015-05-007) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ad5CMV-eGFPGen Transfer Vektör Çekirdeği, Iowa ÜniversitesiVVC-U Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFPGen Transfer Vektör Çekirdeği, Iowa ÜniversitesiVVC-U Iowa-1174
Alexa 568 İkincil AntikorThermo / FisherGaR A11036
Biyoninformatik Biyoiletken için Açık Kaynak YazılımBiyoiletken http://www.bioconductor.orgAdım 4.4
CD31Abcamab28364
Celigo Görüntü SitometresiNexcelom BioscienceN/A
Hücre SıyırıcıCorning25-056-Clşelatör karışımı
DAB boyama kitiVector LabsMP-7800
DAVID (Ek Açıklama, Görselleştirme ve Entegre Keşif Veritabanı)DAVIDhttps://david.ncifcrf.govadım 4.5 için kullanılan fonksiyonel zenginleştirme analiz yazılımı
DMEMCorning15-013-Cl
DreamTaq ve Tampon (Genotipleme PCR)Thermo/FisherEP0701 ve K1072
erbB4 antikorlarıSanta Cruzsc-284
erbB4 antikorlarıAbcamab35374
erbB4 antikorlarMilliporeHFR1: 05-1133
FACS SorterBD BiosciencesAria II
ForskolinSigmaF6886
GenomeSpace Araçları ve Veri KaynaklarıGenomeSpacehttps://genomespace.org/support/tools/adım 4.5 için çeşitli açık kaynaklı biyoinformatik araçlar için genel kaynak
GlutaminCorning25-005-
Gorilla Gene Ontology enRIchment analizi ve visuaLizAtion aracıGorillaN/A,adım 4.5 için kullanılan http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il fonksiyonel zenginleştirme analiz yazılımı
GSEA Gen Seti Zenginleştirme AnaliziBroad InstituteN/A,adım 4.5 HSD için kullanılan https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp fonksiyonel zenginleştirme analiz yazılımı
: Athymic Nude-FOxn1nu farelerEnvigo (Daha önce Harlan Labs)69
Illumina HiSeq2500 (yeni nesil DNA dizileyici)Adım 4.2 için kullanılanIlluminaHi Seq 2500
Lasergene: ArrayStar Gen ekspresyonu ve varyant analiziDNAStar LaserGene yazılımıN/Ayazılımı adım 4.4 için kullanılan istatistiksel ve normalizasyon analizi
Lasergene: SeqMan NGen dizi hizalama düzeneğiadım 4.3 için kullanılan yazılım hizalamasıN/Aadım 4.3 için kullanılan yazılım hizalaması
Matrigel, düşük büyüme faktörlü bazal membran matrisiCorning354230
NRG1-betaŞirket içiSLC tarafından üretilmiştir, ayrıca R & D Sistemleri (396-HB-050 / CF).
Nükleer Leke Hoeschst 33342Thermo62249
Panter Gen Ontolojisi Sınıflandırma SistemiPantherhttp://pantherdb.orgadım 4.5 için kullanılan fonksiyonel zenginleştirme analiz yazılımı
Partek (BWA hizalayıcı ve analizörü)Partek, Ver 7N/Aadım 4.3 için kullanılan yazılım hizalaması ve istatistiksel/normalleştirme
/StrepCorning30-002-Cl
Astar 1: 5 & prime; -CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT < / > GTCTG- 3 & prime;Eurofins Genomik Astar1 + 2: 250  bp ErbB4 boş ürün ve 350  bp Floxlu ErbB4 ürünü;
Astar 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		Eurofins Genomik Astar1 + 2: 250  bp ErbB4 boş ürün ve 350  bp Floxlu ErbB4 ürünü;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

Eurofins Genomik Astar1 + 3: 350  bp vahşi tip ErbB4 ürünü.
Propidyum İyotFisher51-351-0
Proteom Profiler Fosfo-Kinaz DizileriR& D SystemsARY003B
Gerçek zamanlı gloPromegaG9712biyolüminesan hücre canlılık testi
ToppGene SuiteToppGenehttps://toppgene.cchmc.orgadım 4.5 için kullanılan fonksiyonel zenginleştirme analiz yazılımı
Trizol (asit-quanidinium-fenol ve koloroform bazlı reaktif)Invitrogen15596026
Tyramide Sinyal Amplifikasyon KitiPerkin ElmerNEL721001EA
için kullanılan alternatif istatistiksel analiz aracı Cl DNA dizileyici Pen

Kaynaklar

  1. Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
  2. Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347(2019).
  3. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
  4. Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218(2012).
  5. Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74(2019).
  6. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  7. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
  8. Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
  9. Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
  10. Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
  11. Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
  12. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  13. Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
  14. Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
  15. Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
  16. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690(2021).
  17. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  18. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  19. Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
  20. Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577(2018).
  21. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  23. Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28(2016).
  24. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48(2009).
  25. Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183(2007).
  26. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
  27. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  28. Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984(2010).
  29. Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919(2016).
  30. Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
  31. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558(2011).
  32. Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175(2007).
  33. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  34. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807(2021).
  35. Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
  36. Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
  37. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Gen AblasyonuGenetiği Değiştirilmiş FareAdenoviral Cre RekombinazFloresan Aktive Hücre AyıklamaTümör Hücre KültürüOrtotopik AllogreftDiferansiyel Gen EkspresyonuFonksiyonel Zenginleştirme Analizi
Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümör Hücrelerinde Floks Alellerinin Ex vivo Ablasyonu ile Tümörigenezde Gen Fonksiyonlarının Tanımlanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.