Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli kaynaklı tümörlerde in vivo embriyonik öldürücü olan gen nakavtlarını gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz ve daha sonra nakavtın tümör büyümesi, proliferasyon, sağkalım, göç, invazyon ve transkriptom in vitro ve in vivo üzerindeki etkisini değerlendiriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümör Hücrelerinde Floks Alellerinin Ex vivo Ablasyonu ile Tümörigenezde Gen Fonksiyonlarının Tanımlanması
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan kanserlerinde anahtar proteinleri tam olarak hedef alan yeni ilaçların geliştirilmesi, kanser terapötiklerini temelden değiştirmektedir. Bununla birlikte, bu ilaçların kullanılabilmesi için önce, hedef proteinlerinin spesifik kanser türlerinde terapötik hedefler olarak doğrulanması gerekir. Bu doğrulama genellikle, genetiği değiştirilmiş bir fare (GEM) kanser modelinde aday terapötik hedefi kodlayan geni nakavt ederek ve bunun tümör büyümesi üzerindeki etkisinin ne olduğunu belirleyerek gerçekleştirilir. Ne yazık ki, geleneksel nakavtlarda embriyonik öldürücülük ve koşullu nakavtlarda mozaiklik gibi teknik konular genellikle bu yaklaşımı sınırlar. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, bir GEM modelinde üretilen malign periferik sinir kılıfı tümörlerinin (MPNST'ler) kısa süreli kültürlerinde ilgi çekici bir floks embriyonik ölümcül genin ablatasyonuna yönelik bir yaklaşım geliştirilmiştir.
Bu yazıda, uygun genotipe sahip bir fare modelinin nasıl oluşturulacağı, bu hayvanlardan kısa süreli tümör kültürlerinin nasıl türetileceği ve daha sonra Cre rekombinaz ve gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) eksprese eden adenoviral bir vektör kullanarak floklu embriyonik ölümcül genin nasıl ablate edileceği açıklanmaktadır. Daha sonra floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanılarak adenovirüs ile dönüştürülen hücrelerin saflaştırılması ve gen ablasyonunun hücresel proliferasyon, canlılık, transkriptom ve ortotopik allogreft büyümesi üzerindeki etkilerinin ölçülmesi detaylandırılır. Bu metodolojiler, terapötik hedefleri in vitro ve in vivo olarak tanımlamak ve doğrulamak için etkili ve genellenebilir bir yaklaşım sağlar. Bu yaklaşımlar aynı zamanda in vitro büyüme artefaktları azalmış düşük pasajlı tümör türevi hücrelerin yenilenebilir bir kaynağını sağlar. Bu, hedeflenen genin biyolojik rolünün, sekretomun aracılık ettiği göç, istila, metastaz ve hücreler arası iletişim gibi çeşitli biyolojik süreçlerde incelenmesini sağlar.
Giriş
Son yirmi yıldan önce, insan kanserlerinin tedavisi, DNA'ya zarar vererek veya DNA sentezini inhibe ederek hızla çoğalan hücresel popülasyonları geniş ölçüde hedef alan radyoterapi ve kemoterapötik ajanlara dayanıyordu. Bu yaklaşımlar kanser hücresi büyümesini inhibe etmesine rağmen, bağırsak epitel hücreleri ve saç folikülü hücreleri gibi normal hızla çoğalan hücre tipleri üzerinde zararlı yan etkileri de vardı. Daha yakın zamanlarda, kanser tedavisi, bireysel bir hastanın neoplazmının büyümesi için kritik öneme sahip sinyal yolaklarındaki proteinleri tam olarak hedef alan kemoterapötik ajanları kullanmaya başlamıştır. Genellikle "Hassas Tıp" olarak adlandırılan bu y....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Farelerle herhangi bir prosedür gerçekleştirmeden önce, tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmeli ve onaylanmalıdır. Bu makalede açıklanan protokol, Güney Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, MUSC'nin kurumsal hayvan bakım yönergelerini izleyerek uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirilmiştir.
1. Erbb4 floks alelleri için MPNST'leri homozigot geliştiren farelerin üretimi
- F1 nesil P 0-GGFβ3'ü üretin; Trp53+/-; Erbb4fl/+
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 4, P 0-GGFβ3'ü dönüştürürken elde edilen tipik bir sonucu göstermektedir; Trp53-/+; Ad5CMV-eGFP adenovirüsü veya Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirüsü ile Erbb4fl/fl MPNST hücreleri (Şekil 4A). Kültürler, eGFP eksprese eden hücreleri tanımlamak için floresan mikroskobu ile ve aynı alanda bulunan toplam hücre sayısını 10x (üstte) ve 40x'te (altta) belirlemek için faz-kontrast mikroskobu ile incelenir. İstenirse, eGFP.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan ayrıntılı yöntemler, MPNST'lerin GEM modeli kullanılarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, ilgilenilen tümör dokusu bireysel hücrelere dağılabilirse, bu metodolojiler GEM'lerde ortaya çıkan çeşitli tümör tipleri için kolayca uyarlanabilir. Floksed alelin i) tümörleri taramak için yeterli fareler elde etmeyi zorlaştırabilecek sağkalımın azalmasına veya ii) yeterli tümör taşıyan farelerin elde edilmesini zorlaştırabilecek tümör gecikmesinin artmasına neden olmadığından emin olmak önemlidir. Eğer floksed al.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü (R01 NS048353, R01 NS109655), Ulusal Kanser Enstitüsü (R01 CA122804), Savunma Bakanlığı (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 ve W81XWH-15-1-0193) ve Çocuk Tümörü Vakfı (2014-04-001 ve 2015-05-007) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ad5CMV-eGFP | Gen Transfer Vektör Çekirdeği, Iowa Üniversitesi | VVC-U Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gen Transfer Vektör Çekirdeği, Iowa Üniversitesi | VVC-U Iowa-1174 | |
| Alexa 568 İkincil Antikor | Thermo / Fisher | GaR A11036 | |
| Biyoninformatik Biyoiletken için Açık Kaynak Yazılım | Biyoiletken http://www.bioconductor.org | Adım 4.4 | |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Görüntü Sitometresi | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Hücre Sıyırıcı | Corning | 25-056-Cl | şelatör karışımı |
| DAB boyama kiti | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Ek Açıklama, Görselleştirme ve Entegre Keşif Veritabanı) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | adım 4.5 için kullanılan fonksiyonel zenginleştirme analiz yazılımı |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq ve Tampon (Genotipleme PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 ve K1072 | |
| erbB4 antikorları | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 antikorları | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 antikorlar | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace Araçları ve Veri Kaynakları | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | adım 4.5 için çeşitli açık kaynaklı biyoinformatik araçlar için genel kaynak |
| Glutamin | Corning | 25-005- | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment analizi ve visuaLizAtion aracı | Gorilla | N/A, | adım 4.5 için kullanılan http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il fonksiyonel zenginleştirme analiz yazılımı |
| GSEA Gen Seti Zenginleştirme Analizi | Broad Institute | N/A, | adım 4.5 HSD için kullanılan https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp fonksiyonel zenginleştirme analiz yazılımı |
| : Athymic Nude-FOxn1nu fareler | Envigo (Daha önce Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (yeni nesil DNA dizileyici) | Adım 4.2 için kullanılan | Illumina | Hi Seq 2500 |
| Lasergene: ArrayStar Gen ekspresyonu ve varyant analizi | DNAStar LaserGene yazılımı | N/A | yazılımı adım 4.4 için kullanılan istatistiksel ve normalizasyon analizi |
| Lasergene: SeqMan NGen dizi hizalama düzeneği | adım 4.3 için kullanılan yazılım hizalaması | N/A | adım 4.3 için kullanılan yazılım hizalaması |
| Matrigel, düşük büyüme faktörlü bazal membran matrisi | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | Şirket içi | SLC tarafından üretilmiştir, ayrıca R & D Sistemleri (396-HB-050 / CF). | |
| Nükleer Leke Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panter Gen Ontolojisi Sınıflandırma Sistemi | Panther | http://pantherdb.org | adım 4.5 için kullanılan fonksiyonel zenginleştirme analiz yazılımı |
| Partek (BWA hizalayıcı ve analizörü) | Partek, Ver 7 | N/A | adım 4.3 için kullanılan yazılım hizalaması ve istatistiksel/normalleştirme |
| /Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| Astar 1: 5 & prime; -CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT < / > GTCTG- 3 & prime; | Eurofins Genomik Astar | 1 + 2: 250 bp ErbB4 boş ürün ve 350 bp Floxlu ErbB4 ürünü; | |
| Astar 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ | Eurofins Genomik Astar | 1 + 2: 250 bp ErbB4 boş ürün ve 350 bp Floxlu ErbB4 ürünü; | |
| Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA | Eurofins Genomik Astar | 1 + 3: 350 bp vahşi tip ErbB4 ürünü. | |
| Propidyum İyot | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteom Profiler Fosfo-Kinaz Dizileri | R& D Systems | ARY003B | |
| Gerçek zamanlı glo | Promega | G9712 | biyolüminesan hücre canlılık testi |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | adım 4.5 için kullanılan fonksiyonel zenginleştirme analiz yazılımı |
| Trizol (asit-quanidinium-fenol ve koloroform bazlı reaktif) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Sinyal Amplifikasyon Kiti | Perkin Elmer | NEL721001EA |
Kaynaklar
- Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
- Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblast....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
