Tek Taraflı İskemi-Reperfüzyon Hasarının Etkili Bir Fare Modeli

Böbrekler vücuttaki en yüksek perfüze edilen organlar arasındadır ve kan perfüzyonundaki değişikliklere karşı son derece hassastır¹. Renal iskemi-reperfüzyon hasarı (İİİ) akut böbrek yetmezliğinin önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir ^2,3 ve hastanede yatan hastalarda yüksek morbidite ve yüksek mortalite ile ilişkilidir⁴. Mevcut sınırlı terapötik ^{seçeneklerle,4,5} renal IRI şu anda biyotıpta çeşitli araştırma çabalarının odak noktasıdır^6,7 Yeni terapötik hedeflerin geliştirilmesini ve böbrek hasarının erken ve hassas belirteçlerinin karakterizasyonunu amaçlayan ^8,9,10 . Bu ihtiyaçları karşılamak için güvenilir, zaman ve uygun maliyetli bir hayvan modelinin belirlenmesi gerekli görülmektedir. Bu yazıda tek taraflı renal IRI'nin basit ve etkili bir fare modeli sunulmaktadır. İskemi, sağ renal pedikülün 30 dakika^11,12 süre ile sıkıştırılmasıyla indüklenir. Bu modelin önemli bir parçası, tübüler nekroz, polimorfonükleer inflamatuar hücre infiltrasyonu veya fibroz gibi ilgilenilen patolojik olayları yeniden üretecek en uygun reperfüzyon zamanını seçmektir. Bu nedenle, araştırmacılara IRI böbreğinde beklenen temsili patolojik değişikliklerin bu sıralı genel bakışı sunulmaktadır.

Aşağıdaki protokol bir sağkalım ameliyatını tanımlamaktadır. Bu nedenle en yüksek aseptik ve cerrahi uygulama uygulanmaktadır. Tüm hayvan deneyleri kurumsal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. IRI etkilerindeki cinsiyet ve gerinim bazlı farklılıkları ortadan kaldırmak için, çalışmada sadece erkek C57BL6 fareleri kullanılmıştır. Tüm hayvanlar, karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için yaş ve ağırlık bakımından eşleştirildi.

1. Hazırlık

NOT: Farklı deneysel aşamaların ve müdahalelerin zaman çizelgesi Şekil 1A'da gösterilmiştir.

1. Her işlemden önce ameliyat masasını temizleyin ve dezenfekte edin. Gerekli tüm malzemeleri (sterilize aletler ve pamuklu çubuklar, steril gazlı bez ve perdeler, önceden seyreltilmiş anestezikler, ısıtma yastığı, sterilize vasküler kelepçe, steril salin çözeltisi ve cilt antiseptikleri ve dikişleri) cerrahi masaya hazırlayın ve yerleştirin (bkz.
2. Erkek C57BL6 farelerini (yaş aralığı 11-13 hafta) intraperitoneal ketamin / ksilazin enjeksiyonu ile anesteziye alın (sırasıyla 100 mg / kg ve 20 mg / kg vücut ağırlığı, daha önce steril salin ile seyreltilmiş).
   NOT: Hayvan için stresi en aza indirmek için yetenekli hayvan kullanımı esastır, çünkü stres tepkileri anesteziklerin etkisini olumsuz yönde etkileyebilir.
3. Ketamin / ksilazin uygulamasından sonra, sağ kanattaki cerrahi bölgeyi bir tıraş bıçağı ve sabun kullanarak tıraş edin.
   NOT: Cildi tıraş etmek, hayatta kalma ameliyatlarının genel sonuçlarının yanı sıra yara iyileşmesini de iyileştirir.
4. Cerrahi bölgedeki cildi önce %70 alkolle, daha sonra pamuklu çubukla povidon iyot çözeltisiyle dezenfekte edin.
5. Cilt hazırlığından sonra, fareyi ventral dekübitus pozisyonunda bir ısıtma masasına yerleştirin ve vücut ısısını 37 ° C'de stabilize edin (rektal ve ped sensörü probları ile izlenir).
   NOT: Böbreklere lateral yerine ventral dekübitusa yerleştirildiğinde böbreklere daha kolay erişilebilir ve cerrahi olarak maruz kalınır.
6. Vücut ısısı stabilize edilirken, farenin gözlerine göz merhemi uygulayın.
   NOT: Ketamin gibi dissosiyatif anestezikler, anestezi yapılırken hayvanın gözlerinin açık kalmasına neden olur.

2. Ameliyat

1. Ağrı refleksleri olmadığında (cımbızla ayak parmağını sıkıştırma), neşter bıçağı kullanarak sağ kanatta yaklaşık 1 cm'lik dorso-lateral cerrahi kesi yapın. Kesiye son kaburganın arkasından başlayın ve lomber orta hatta yaklaşık 1 cm paralel olarak kaudal olarak devam edin.
2. Retroperitoneal boşluğu görselleştirmek için makas kullanarak karın kas sistemini transekte edin. Kasların bölümlenmesi sırasında üretilen az miktarda kanı steril pamuklu çubuklarla çıkarın.
   NOT: Dorso-lateral yaklaşım kullanıldığından, bu prosedürle periton boşluğuna değil, retroperitoneuma erişilir.
3. Sağ böbreği karın boşluğundan dışarı itin. Böbreği dikkatlice ortaya çıkarmak için Graefe forseps kullanın.
   NOT: Karnın üzerine yerleştirildiğinde böbreğin travmatik yaralanmasını önlemek için forsepsleri daima kapalı tutun ve sadece böbreği cerrahi insizyona doğru dikkatlice itmek ve yönlendirmek için kullanın.
4. Doğru böbreği yavaşça ortaya çıkarın ve böbrek pedikülünü tanımlayın. Pedikülün etrafındaki yağ dokusunu dikkatlice çıkarın.
5. İskemiyi indüklemek için, vasküler kelepçeyi renal pedikülde bulunan renal arter ve venin üzerine yerleştirin ve bitişik üreterin sıkışmasını önleyin. Vasküler kelepçeyi manipüle etmek için bir Halsted-Mosquito hemostat kullanın.
   NOT: İskemi, böbrek rengindeki kırmızı-pembeden koyu mora doğru bir değişimin görselleştirilmesiyle doğrulanır (Şekil 1B).
6. Kenetlenmiş böbreği, kurumayı önlemek için tuzlu suya batırılmış steril gazlı bezle örtün ve 30 dakika bekletin.
7. Bu süre zarfında gazlı bezin anestezi derinliğini ve nemini periyodik olarak izleyin.
   NOT: Anestezinin indüksiyon dozu, iskemik olayın sonuna kadar analjezi sağlamak için yeterlidir; Bu nedenle, ek anestezik enjeksiyonlara gerek yoktur.
8. İskemi döneminin bitiminden kısa bir süre önce, gazlı bezi çıkarın ve böbreği ortaya çıkarın. Halsted-Mosquito hemostatını kelepçe çıkarmaya hazır tutun.
9. Dakika 30'da, hemostat ile vasküler kelepçeyi açın ve böbreğin reperfüzyonuna izin vermek için böbrek pedikülünden çıkarın.
   NOT: Reperfüzyon, böbrek rengindeki değişimin koyu mordan kırmızı-pembeye doğru görselleştirilmesiyle doğrulanır (Şekil 1C).
10. Böbrek pedikülünü sıkıştırmadan sahte hayvanlar için yukarıda açıklanan prosedürleri uygulayın.
11. Böbrek rengi değişiminin doğrulanmasından sonra, böbreği karın boşluğuna geri döndürün. Karın kaslarını emilebilir dikişle 5-0 çapraz bir desen kullanarak kapatın.
    NOT: Kasların ve cildin dikilmesi sırasında analjezi sağlamak için ikinci bir anestezik enjeksiyonu gerekebilir. Başlangıç dozunun yarısının, ameliyatın sonuna kadar analjezi sağlamada etkili olduğu kanıtlanmıştır.
12. Yatay bir yatak deseni kullanarak cildi emilebilir dikiş 5-0 ile kapatın. Yarayı pamuklu çubukla bir povidon iyot çözeltisi ile temizleyin.

3. İyileşme ve ameliyat sonrası

NOT: Ameliyat sonrası zaman gerçek reperfüzyon zamanı olduğundan, uygun cerrahi sonrası bakım etik olarak zorunludur ve bilimsel olarak önemlidir. Reperfüzyon süreleri araştırmacının istediği şekilde seçilebilir. 4 saat, 8 saat, 16 saat, 1 gün, 2 gün, 4 gün ve 7 günlük reperfüzyon süreleri, renal İRI tarafından indüklenen patolojik değişikliklerin sıralı bir özetini elde etmek için karşılaştırılmıştır.

1. Anesteziden kurtulmaya başlayana kadar fareyi ısıtma yastığının üzerinde tutun.
   NOT: Farenin bacaklarını hareket ettirmeye başlaması ve hareket etmeye çalışması için beklemeniz önerilir. Ameliyat sırasında ek anestezik enjeksiyonların gerekli olduğu durumlarda iyileşme süresi daha uzundur. Bir alfa-2 reseptör antagonisti olan Atipamezol, ksilazin etkilerini tersine çevirmek ve iyileşme aşamasını kısaltmak için intraperitoneal olarak 0.5 mg / kg vücut ağırlığı dozunda uygulanabilir. Ağrı yönetimi için, buprenorfin (intraperitoneal olarak 0.1 mg / kg vücut ağırlığı) ameliyat öncesi ve iyileşme ve ameliyat sonrası aşamada her 6 saatte bir uygulanır. Steroidal olmayan anti-enflamatuar ilaçların kullanımı, bu ailedeki birkaç ilacın nefrotoksisiteye neden olması ve bu nedenle sonuçları değiştirebilmesi nedeniyle önerilmemektedir.
2. Anesteziden kurtulduktan sonra, fareyi su ve yiyeceğe serbestçe erişerek kafesine geri yerleştirin.
   NOT: Püresi yiyecekler Petri kabında ve ayrıca saklanmak ve oynamak için malzeme (örneğin, kağıt tabakalar, kağıt havlu tüpleri) temin edilebilir.
3. Yara iyileşmesini, yiyecek ve su alımını, vücut ağırlığını ve davranışını değerlendirmek için fareyi günlük olarak izleyin.
   NOT: Yara iyileşme durumu aşağıdaki ölçek kullanılarak değerlendirilmiştir: 1, kuru; 2, ıslak; 3, kısmen açılmış; 4, açıldı. Bu çalışmada hızlı yara iyileşmesi belgelenmiştir ve 2. günden sonra kuru yaraların% 90'ından fazlası ile belgelenmiştir.

4. Ötenazi ve örnek toplama

1. Fareleri, fareler için anestezik dozun iki katı (100 mg / kg) olan bir dozda intraperitoneal olarak uygulanan sodyum pentobarbital ile ötenazileştirin.
2. Gerektiğinde sıvı ve doku örnekleri toplayın.
   NOT: Her iki böbrek, tam kan (kan hücresi sayımı için), serum (kan biyokimyası için), idrar, kalp ve akciğerler toplandı. Kan biyokimyası analizi için birkaç mikrolitre serum gereklidir (kan üre azotu (BUN), kreatinin, elektrolitler). Gerekirse, ötenaziden 24 saat önce, böbrek fonksiyon parametrelerinin belirlenmesine izin veren daha yüksek bir idrar hacmi toplamak için fareler metabolik kafeslere yerleştirilebilir.

Fizyolojik parametreler
Fareler bu tek taraflı renal IRI ameliyatından olaysız bir şekilde iyileşti; aktif ve uyanık görünüyordu; ve ertesi güne kadar normal yeme, içme ve davranış gösterdi. Bazı fareler IRI sonrası vücut ağırlığı kaybına sahip olabilir, ancak genellikle ilk vücut ağırlığının% 10'undan azdır (Şekil 2). Daha büyük vücut ağırlığı kayıpları (˃10%) zararlı olabilir ve bu hayvanlar çalışmadan çıkarılmalıdır. Sahte olarak ameliyat edilen fareler ameliyat sonrası vücut ağırlığı değişiklikleri göstermedi (ameliyattan 24 saat sonra ölçüldü). Çoğu fare, ameliyat sonrası 4 ila 7. günler arasında ilk vücut ağırlığını geri kazandı (bkz. IRI 7 günlük grup, Şekil 2). Böbrek fonksiyonu, kan üre azotu (BUN) ve kreatinin gibi geleneksel belirteçler kullanılarak değerlendirilebilir. Ek olarak, serumdaki elektrolit seviyeleri (sodyum, potasyum ve klorür) ve otomatik diferansiyel kan sayımı analize dahil edildi.

Histopatolojik değişiklikler
Histopatolojik bulguların değerlendirilmesi, hematoksilin/eozin (HE), periyodik asit Schiff ve Masson trikrom boyaları ile boyanmış böbreğin %4 paraformaldehit sabit, parafin gömülü bütün orta sagital kesitleri kullanılarak yapıldı. Bu tek taraflı renal IRI modeli tarafından üretilen en belirgin değişiklikler, kortiko-medüller bileşkede, özellikle proksimal tübüllerde, Henle döngüsünün kalın yükselen uzuvlarında ve distal kıvrımlı tübüllerde ve ayrıca tübüler interstisyumda görülebilir ( Şekil 3 için efsaneye bakınız). Böbrekte IRI sonrası en karakteristik lezyonları gösteren mikroskobik görüntüler Şekil 3'te görülebilir. Sıralı histopatolojik bulguların listesi Tablo 1'de verilmiştir.

Zaman içindeki hasarı kategorize etmek için boru şeklindeki yaralanma skorlama sistemi geliştirilmiştir (Şekil 4). Bunda, beş tanımlanmış değişiklik üç farklı değerlendirici tarafından değerlendirilmiştir: 1) tübüler epitel zayıflaması; 2) fırça sınırı kaybı; 3) tübüler nekroz; 4) luminal tıkanıklık; ve 5) proteinli dökümün varlığı. "1" ataması değişikliğin mevcut olduğunu, "0" ise olmadığını gösterir.

Şekil 1: Farede deneysel renal IRI modeli . (A) Deney ve girişimlerin fazları (anestezi indüksiyonu, iskemi ve reperfüzyon) gösterilmiştir. İskemi sırasında sağ böbreğin renginin koyu kırmızıya (B) reperfüzyon sırasında pembeye (C) dönüştüğüne dikkat edin. (D) IRI sağ böbreğinin (kırmızı ok) makroskopik görünümü, ameliyattan 24 saat sonra aynı hayvanın kontralateral IRI olmayan böbreğine kıyasla. (B) içindeki kırmızı ok, hemostatik kelepçenin konumunu gösterir. Kısaltma: IRI = İskemi-reperfüzyon hasarı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Renal IRI'den önce ve sonra farelerin vücut ağırlığı. Tek tek veriler gösterilir. Kısaltmalar: IRI = İskemi-reperfüzyon hasarı; h = saat; d = gün. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: IR ile çalışan farelerin kortekste ve kortiko-medüller kavşağında gözlenen tipik mikroskobik lezyonlar. Şam ve farklı reperfüzyon süreleri gösterilir (her resmin üstünde gösterilir). (A) Bozulmamış yapılar sahte olarak gösterilir (büyütme 40x; ölçek çubuğu = 20 μm). IRI 4 h'deki oklar, boru şeklindeki lümende proteinli dökümün varlığını gösterir (büyütme 40x; ölçek çubuğu = 20 μm). IRI 8 h'deki oklar boru şeklindeki dilatasyonu gösterir (büyütme 40x; ölçek çubuğu = 50 μm). IRI 16 h'deki siyah ok, medüller segmentlerde boru şeklindeki dökümü gösterir; beyaz oklar hücresel nekroz alanlarını gösterir (büyütme 40x; ölçek çubuğu = 50 μm). IRI 1 d'deki siyah oklar boru şeklindeki dilatasyonu gösterir (büyütme 10x; ölçek çubuğu = 100 μm). IRI 2 d'deki siyah ok, genişlemiş hücre çekirdeklerini gösterir; beyaz ok uçları lenfosit ve makrofaj infiltrasyon alanlarını gösterir (büyütme 40x; ölçek çubuğu = 50 μm). IRI 4 d'deki beyaz ok uçları mitotik boru şeklindeki hücreleri gösterir (büyütme 40x; ölçek çubuğu = 50 μm). IRI 7 d'deki siyah ok, fokal fibrozun bir alanını gösterir; beyaz ok ucu bir rejenerasyon alanı gösterir (büyütme 20x; ölçek çubuğu = 100 μm). (B) Erken reperfüzyon sırasında farelerin renal korteksini gösteren PAS boyama (4 saat, 8 saat ve 16 saat). Fırça kenarlığının (oklar) aşamalı olarak zayıflamasına dikkat edin. Büyütmeler 40x; ölçek çubukları = 50 μm (C) İnterstisyel fibroz alanlarını gösteren sahte ve IRI 7 d farelerin masson trikrom boyaması (beyaz oklar). Büyütme 40x; ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: IRI = İskemi-reperfüzyon hasarı; Glo = glomerulus; PCT = proksimal kıvrımlı tübül; DCT = distal kıvrımlı tübül; CD = toplama kanalı; PAS = periyodik asit Schiff; d = gün. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Sahte ve IRI ile çalışan farelerin tübüler yaralanma skoru. Tübüler epitel zayıflaması için skorlama sistemi ölçeği 1'den 5'e kadar; fırça sınırı kaybı; tübüler nekroz; luminal obstrüksiyon; ve proteinli döküm varlığı. "1" ataması değişikliğin mevcut olduğunu, "0" ise olmadığını gösterir. Tek tek değerler gösterilir. Çubuklar ortalama ± SD'yi temsil eder (n = 4). Kısaltma: IRI = İskemi-reperfüzyon hasarı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Zaman içinde en önemli patolojik değişiklikler. Grup başına 4-6 hayvanın mikroskobik incelemesine dayanarak teşhis edilir.

Yazarlar bu makale ile ilgili çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.