Method Article

Drosophila'da Tüketimin Nicelleştirilmesi için Yüksek Verimli Mikro Plaka Besleyici Tahlili

DOI:

10.3791/62771

⸱

June 14th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Biochemistry and Center for Human Genetics, Clemson University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro plaka besleyici tahlili, Drosophila'dakisıvı gıda tüketimini ölçmek için ekonomik, yüksek verim yöntemi sunar. 3D baskılı bir cihaz, sineklerin barındırıldığı 96 kuyulu bir mikro plakayı, sineklerin bir izleyici boyası ile bir besleme çözeltisi tükettiği 1536 kuyulu bir mikro plakaya bağlar. Çözelti hacmi düşüşü spektrofotometrik olarak ölçülür.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila'da gıda alımını ölçmek, tüketimle ilişkili özelliklerin genetik ve fizyolojik temellerini, çevresel faktörlerini ve çok sayıda maddenin toksikolojik ve farmakolojik etkilerini incelemek için kullanılır. Şu anda uygulanan birkaç yöntem yüksek aktarım hızı ölçümüne uygundur. Microplate Besleyici Test (MFA), absorbans kullanarak bireysel sinekler için sıvı gıda tüketimini ölçmek için geliştirilmiştir. Bu testte, sinekler 1536 kuyulu bir mikro plakanın belirli kuyularından sıvı gıda ortamı tüketir. Seyreltilmiş bir izleyici boyasını sıvı gıda ortamına dahil ederek ve bilinen bir hacmi her kuyuya yükleyerek, tüketimden önce ve sonra elde edilen kuyunun absorbans ölçümleri, elde edilen hacimdeki değişimi (yani tüketilen hacmi) yansıtır. Bu yöntemle yüksek verim analizini etkinleştirmek için, sineklerin 96 kuyulu mikro plakalara ayrı ayrı sıralanmasını sağlayan 3D baskılı bir bağlayıcı tasarlanmıştır. Bu cihaz, her bir uçucuya tüketim için 4 kuyuya erişim sağlamak için 96 ve 1536 kuyulu mikro plakaları hassas bir şekilde yönlendiriyor, böylece düzenli tüketime ek olarak gıda tercihi nicelleştirmesini sağlıyor. Ayrıca, cihaz, bir kerede bir numune sütununun kontrollü bir şekilde çevrelenmesine ve serbest bırakılmasına izin vermek için açık ve kapalı konumlar arasında geçiş yapan bariyer şeritlerine sahiptir. Bu yöntem, aynı anda birçok sinek tarafından sulu çözeltilerin tüketiminin yüksek verim ölçümlerini sağlar. Ayrıca diğer böceklere adapte olma ve besin, toksin veya ilaç tüketimini tarama potansiyeline sahiptir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster, gıda alımının biyolojik temellerini ve tüketimle ilişkili özellikleri incelemek için genetik model organizma olarak geniş bir kullanım görmüştür1. İnsan hastalığına neden olan genlerin% 65'inin sineklerde fonksiyonel homologlara sahip olduğu ve bunların önemli bir kısmının sinekler ve insanlar arasındaki işlevsel olarak eşdeğer dokularda ifade edildiği tahmin edilmektedir2. Ayrıca, D. melanogaster'ın büyüklüğü, kısa kuşaklararası süresi, basit bakımı ve genetik çekiş kabiliyeti, insektisitler5 , kirleticiler6, farmasötik7ve kötüye kullanım ilaçları8,9,10dahil olmak üzere çeşitli maddelerin3,4 ve toksikolojik ve farmakolojik etkileri üzerine yapılan çalışmalar için çekici bir model haline getirmektedir.

Çoğu durumda, bu özelliklerin incelenmesi tüketimin kesin nicelleştirilmesini gerektirir. Tüketimi ölçme yöntemleri çeşitlidir ve CApillary FEeder (CAFE) tahlil11, MAnual FEeding (MAFE) tahlil12, Hortum Uzatma Yanıtı (PER)13, izleyici boyası ekstraksiyonu14,15, oligonükleotid izleyici ekstraksiyonu16ve radyo-izotop ekstraksiyonu5,17içerir. Son çalışmalar, Expresso test18 veya plaka tabanlı Tüm Hayvan Besleme FLat (WAFFL) sistemi19'daolduğu gibi, bu tahlillerin verimini artırmaya odaklanmıştır. Yardımcı programlarına rağmen, bu tahliller karmaşık, maliyetli veya emek yoğun olabilir ve yüksek verim çalışmalarında kullanımlarını engelleyebilir.

figure-introduction-1
Şekil 1: Mikro Plaka Besleyici Tahlili bileşenleri. (A) Monte edilen mikro plaka besleyici testinin 3D oluşturulması. 1536 kuyulu mikro plaka, 3D baskılı bağlayıcı tarafından yönlendirilir, böyle şekilde alt 96 kuyulu mikro plakanın her kuyusu üst 1536 kuyu mikro plakanın dört kuyusuna erişebilir. Kuyulara erişim, bağlayıcıdan oluklu bariyer şeritlerinin konumunu ayarlayarak kontrol edilebilir. (B) Mikro plaka besleyici testinin her kuyusunun grafiksel bir gösterimi. Tüketim çözümleri, sinek tarafından erişime izin vermek için delikli bir sızdırmazlık filmi kullanılarak her kuyuda tutulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-introduction-2
Şekil 2: Mikro Plaka Besleyici Tahlili'ndeki prosedürlere genel bakış. Şekil, protokolün 4.1-5.8 adımlarına karşılık gelen bir akış diyagramı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu engelleri aşmak için Mikro Plaka Besleyici Tahlil (MFA; Şekil 1) geliştirildi. Bu testte, sinekler 96 kuyulu mikro plakalarda ayrı ayrı barındırılıyor. Her mikro plaka, 3D baskılı özel bir cihaz kullanılarak 1536 kuyulu bir mikro plaka ile birleştirilmiştir. Cihaz, iki plakayı tam olarak yönlendiriyor, böylece her biri 96 kuyu plakasının kendi kuyusunda uçuyor ve 1536 kuyulu mikro plakanın 4 kuyusuna erişiyor. Dipsiz 1536 kuyu plakası ve sızdırmazlık filmleri kullanılarak, çözeltiler belirli kuyulara dağıtılır ve sineklere erişim sağlamak için hassas 0,25 mm çapında iğnelerle delinir. Kritik olarak, doğrudan bir mikro plakadan tüketime izin vermek, mikro plaka okuyucu kullanarak anında absorbans tabanlı ölçümlere izin verir. Seyreltilmiş bir izleyici boyası tüketim ortamına dahil edilir ve maruziyet sonrası emiciliğin değişmesi tüketilen hacmi belirlemek için kullanılır (Şekil 2 ve Şekil 3). Her kuyudaki sıvı bir sıvı sütununa yaklaşık olarak sahip olduğundan, hacimsel farklılıklar sütunun yüksekliğinde farklılıklar olarak kendini gösterecektir. (Şekil 3A) Bira-Lambert yasasına göre20:

figure-introduction-3

burada A emiciliktir, ε zayıflatıcı analiz için azı diş emme katsayısıdır, l optik yol uzunluğudur ve c zayıflatıcı analitin konsantrasyonudur. Bu nedenle, sürekli azı diş emme katsayısı ve konsantrasyonu ile, emicilikteki değişiklikler sadece optik ışık yolundaki değişikliklerden, yani belirli bir kuyudaki sıvı seviyesinden kaynaklanmaktadır. Maruz kalmadan önce ve sonra absorbansı ölçerek, emiciliğin oransal değişimi hacimdeki orantılı değişimi yansıtır (Şekil 3B).

figure-introduction-4
Şekil 3: Kuyu hacminin absorbans tabanlı nicelemesi. (A) Bilinen giriş yoğunluğunda olay ışığı (I0) her kuyudan geçer. Farklı dolgu hacimlerinde ışığın zayıflaması, hacim ve emiciliğin doğrusal bir ilişkisini sergileyen farklı çıkış yoğunlukları (I) verir. (B) Emicilik ve hacim için ampirik ölçüm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hacimdeki değişime bağlı olarak, yutmuş herhangi bir bileşiğin miktarı, besleme çözeltisindeki bilinen konsantrasyonundan hesaplanabilir. Test için gerekli parçaların maliyeti düşüktür ve yüksek derecede yeniden kullanılabilirliğe sahiptir ve bu da tahlilin yinelenen maliyetini önemli ölçüde azaltır. Bu nedenle, bu prosedür tüketimi hassas bir şekilde ölçmek için uygun fiyatlı, yüksek verimli bir yöntem sunar.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Açlık plakası hazırlama

  1. 250 mL cam bir beher içine 1,5 g agarose tartın.
  2. Kabın içine 100 mL damıtılmış H2O ekleyin.
  3. Agarose tamamen eriyene kadar aralıklı olarak mikrodalga.
    NOT: Agarose kaynamaya eğilimli olduğundan beheri gözlemleyin.
  4. Erimiş agarose'u bir reaktif oluğuna dökün ve çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyulu bir mikro plakanın her kuyusuna 80 μL erimiş agarose dağıtın. Tabakların oda sıcaklığında kapalıyken kürlenebilmesine izin verin. Kalan agarose'u kapalı bir torbada bir haftaya kadar soğutun ve ek plakalar yapmak için yeniden eritin.

2. Sinek ayıklama ve açlık

  1. Bariyer şeridi kanallarına bariyer şeritleri yerleştirerek bağlayıcıları hazırlayın. Bariyer şeritleri çok gevşekse, onları kanallarda tutmak için eğrilik vermek için parmağın etrafına sarın.
  2. Bağlayıcıyı açlık plakasına yapıştırın. Bağlayıcı kayabileceğinden plakayı manipüle etmek için bağlayıcıyı kullanmayın. Bağlayıcıların doğru yönlendirildiğinden emin olun (yani, bağlayıcının açılı köşesinin mikro plakanın açılı köşesine eşleştiğinden emin olun).
  3. CO2 anestezisi (Malzeme Masası)altında, 3-5 günlük sinekleri sıralayın. Tek tek sinekleri sütunla açlık plakasına yükleyin.
    NOT: Sinekler sütuna göre yüklenmiş olsa da, örnek gruplarının aşağı sütunlar yerine plakanın aşağı satırlarına dağıtılması önerilir (plaka düzeni örneği için Şekil 4'e bakın).
  4. Bariyer şeridini kapalı konuma ayarlayarak her sütunu doldururken kapatın.

figure-protocol-1
Şekil 4: Temsili Açlık Plakası Düzeni. Diyagram, bu çalışmada kullanılan 96 kuyulu bir plakada buharlaşma kontrollerinin ve erkek ve dişi sineklerin organizasyonununu göstermektedir. A ve H satırlarında buharlaşma kontrollerine sahip alternatif erkek ve kadın sıraları da dahil olmak üzere alternatif konfigürasyonlar da kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Numune düzenini mikro plaka içinde dikkatlice kaydedin. Açlık plakası doldurulduktan sonra, CO2'yi çıkardıktan sonra sineklerin kendiliğinden iyileşmesine izin verin ve ilk anestezi sürelerinden başlayarak 6 saat aç bırakın.

3. Sıvı gıda hazırlama

NOT: Sıvı gıdaları her gün taze yapın.

  1. Damıtılmış H2O'da FD&C Blue #1'in 10 mg/mL boya stok çözeltisi hazırlayın.
    NOT: Bu, oda sıcaklığında 6 aya kadar saklanabilir.
  2. 10 mL sıvı gıda (%4 sakkaroz, %1 maya özü, 40 μg/mL FD&C Blue #1) 15 mL konik tüpte 0,4 g sakkaroz ve 0,1 g maya ekstresini 10 mL damıtılmış H2O. Vortex tüpü katılar tamamen çözünene kadar çözün. Çözeltiyi homojenize etmek için 40 μL boya stok çözeltisi ekleyin ve tüpü tekrar tekrar ters çevirin.
  3. Sıvı gıdayı 0,45 μm filtre ile uçlu 10 mL şırınna aktarın. Çözeltinin ~1,5 mL'lik kısmını aynı anda 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne filtreleyin. Çözeltiyi içeren şırınnayı bir kenara koyun ve besleyici plaka hazırlığı sırasında ek çözeltiyi gerektiği gibi filtreleyin.

4. Besleyici plaka hazırlama

NOT: Kuyuda emici okumaları etkileyebilecek kabarcıkların veya damlacıkların oluşumunu önlemek için doldurduktan sonra besleyici plakalarını hafifçe kullanın.

  1. 1536 kuyulu bir mikro plakanın altını sızdırmazlık filmiyle kapatarak bir besleyici plakası hazırlayın. Filme iyice yapışmak için bir sızdırmazlık raketi kullanın. Fazla filmi jiletle sol ve sağ kenarlardan kesin.
  2. Filtrelenmiş sıvı gıda kolonunun 10 μL'sini (çizim için Şekil 5'e bakınız) 1536 kuyulu mikro plakanın uygun kuyularına dağıtın. Dört kuyudan oluşan her küme için sol üst kuyuya dağıtın (çizim için Şekil 5'e bakın).

figure-protocol-2
Şekil 5: 1536 kuyulu besleyici plakası için sırayı ve kuyu konumunu doldurun. Diyagramda protokolün 4.2. Oklar, besleme çözeltisinin besleyici plakasına sütun 1'den 12'ye kadar her seferinde bir sütunda uygulanma sırasını gösterir. Örnek B1, 1 seçimli ve 2 seçenekli tahliller için besleme çözümlerinin yerinin bir örneğini göstermek için büyütülmüştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Tüm kuyular dolduktan sonra, plakanın üstüne bir sızdırmazlık filmi uygulayın. Filme iyice yapışmak için bir sızdırmazlık raketi kullanın. Fazla filmi jiletle sol ve sağ kenarlardan kesin. İstediğiniz sayıda plaka için tekrarlayın.
  2. Sıvıyı yerleştirmek için plakaları 10 s için 200 x g'da santrifüjlayın. Plakanın soğutulmasına izin vermeyin, çünkü bu kuyularda yoğuşma birikmesine neden olabilir ve absorbans okumalarını gizleyebilir.

5. Pozlama

  1. Sinekler tüketim testine hazır olduğunda, plakanın üst yüzeyindeki kuyuları 0,25 mm çapında bir iğne ile donatılmış iğne prob aracı ile delin. Çözümleri dağıtırken kullanılanla aynı sırayı delinmek için kullanın. Plakayı çevirin ve alttaki kuyuları delin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için çözeltiler arasındaki iğneyi silin. Kuyulardan gelen çözeltiyi fitillerken deliklere dokunmamaya dikkat edin.
  2. Plakanın emiciliğini kapaksız 630 nm'de okuyun.
  3. Yoğuşma halkalarının delikli kuyuları çevrelemesini sağlamak için üst sızdırmazlık filmine bir iç kapak yerleştirin. Dış kapağı tabağa yerleştirin.
  4. Besleyici plakasını bağlayıcının üzerine, kılavuzlar besleyici plakasının ve açlık plakasının uygun deliklerini hizaleyecek şekilde yerleştirin. Bağlayıcının ve plakaların doğru yönlendirildiğinden emin olun (yani, bağlayıcının açılı köşesinin ve plakaların eşleştiklerinden emin olun). Bağlayıcıyı bir arada tutmak için elastik bantları üst ve alt plakaların etrafına sarın. Besleyici plakası ile bağlayıcı arasındaki hizalama ve boşlukları kontrol edin.
  5. Tüm besleyici plakaları bağlayıcılara yüklendikten sonra, bağlayıcı üzerindeki bariyer şeritlerini ayarlayarak plakaların kuyularını açın. Bağlayıcı/plaka montajlarını ikincil kaba yerleştirin. Her ikincil kapsayıcı en fazla altı montaj barındırabilir.
  6. Nem sağlamak için her ikincil kaba ıslatılmış kağıt havlu içeren bir pipet kutusunun alt yarısını yerleştirin. İkincil kapların kapağını kapatın ve kontrollü bir ortama aktarın (25 °C, nem kontrollü, 12 saat ışık:karanlık döngüler). Sineklerin 22 saat boyunca tüketilmesine izin verin.
  7. 22 saat pozlama işleminden sonra, her plakada ölü sinek olup olmadığını kontrol edin ve plaka düzenini buna göre güncelleyin. Tüm plakalar kontrol edildikten sonra, ikincil kabın içine CO2 pompalayarak sinekleri toplu olarak uyuşturun. ~60 s'den sonra, tüm sineklerin hareketsiz olduğundan emin olun. Sinekleri yavaşça açlık plakasına koyun ve plastik bariyer şeritlerini değiştirin. Beslemek plakalarını okumak için çıkarın.
  8. Plakanın emiciliğini 630 nm'de yeniden okuyun. Tüm plakalar okunana kadar tekrarlayın.

6. Veri analizi

NOT: Analiz, araştırmacının tercih ettiği yazılım paketi ile yapılabilir.

  1. 22 saat maruz kalma sırasında ölen sinekleri atla.
  2. Her kuyu için, tüketilen hacmi şu şekilde hesaplayın:
    figure-protocol-3
    C - Tüketilen Hacim (μL)
    V - İlk Kuyu Hacmi (yani, 10 μL)
    ABS0 - Ön Pozlama Absorbansı
    ABS1 - Maruz Kalma Sonrası Absorbans
    NOT: Tüketim, hesaplamada pozitif bir hacim olarak gösterilir.
  3. Buharlaşmayı hesaba katmak için, ortalama buharlaşma hacmini ilgili plakalardaki sinek tüketim değerlerinden çıkarın. 2 tercihli/tercihli test için, her kuyuyu ilgili çözümüne göre ayarlayın,örneğinbuharlaştırma kontrollerinde "seçim 1" kuyularını "seçim 1" ile ayarlayın.
  4. Buharlaşma için ayarladıktan sonra, tüketim değeri sıfırdan az olan örnekleri bırakın.
  5. 2 seçenekli testler için, her biri için tercihi hesaplayın:
    figure-protocol-4
    P - Tercih Endeksi (pozitif yön tercihi gösterir)
    FA - Katkı Maddesi İçeren Sıvı Gıdaların Hacmi (Seçim 2)
    FN - Tüketilen Normal Sıvı Gıda Hacmi (Seçim 1)

7. Mikro plaka ve bağlayıcı yıkama protokolü.

NOT: Hasar sızdırmazlıkları etkileyebileceğinden, mikro plakaların alt kısımlarında hasar görmesini önlemeye özen edin.

  1. Filmleri ve etiketleri 1536 kuyulu mikro plakalardan çıkarın. Bağlayıcıları ve bariyer şeritlerini ayırın. Bariyer şeritlerini şişe gibi kapatılabilir bir kaba yerleştirin. Bariyer şeritlerini bir dizi ılık musluk suyu, hafif deterjan çözeltisi, ılık musluk suyu ve ardından damıtılmış H2O'da kuvvetlice sallayarak yıkayın.
  2. 1536 kuyulu mikro plakaları ve bağlayıcıları ılık musluk suyunun altında durulayın. Mikro plakalar için, mümkün olduğunca fazla çözelti ve döküntü temizlemek için her mikro plakanın kuyularından musluk suyu geçirin. Gerekirse, enkazı yerinden çıkarmak için bir pipet ucu kullanın; plakalarda metal veya cam gereçler kullanmayın.
  3. Her tabağı ve bağlayıcıyı hafif bir deterjan çözeltisi (örn. %1 v/v Aquet) ile örtün. Plakalar için yüzeyleri eldivenli bir elle ovalayın. Bağlayıcılar için bir fırça kullanın.
  4. Her plakayı musluk suyuyla ve ardından damıtılmış H2O ile iyice durulayın.
  5. Tabakların ve bağlayıcıların oda sıcaklığında kapalı olarak kurumasını bekleyin. Kullanıma kadar temiz bir depolama kutusunda saklayın.
    NOT: 1536 kuyulu mikro plakaları asla eldivensiz kullanın. Deriden kalan yağlar sızdırmazlığı engelleyebilir, iyi sızıntıya ve buharlaşmaya yol açabilir.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek tek plakaların kuyuları arasında herhangi bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için, buharlaşma her kuyu için ölçüldü (n = üç plaka için 96 kuyu / plaka). Buharlaşmanın -0.036 μL ± 0.003 μL (ortalama ± SEM boyunca) olduğu bulunmuştur. (Şekil 6A) Pearson korelasyonları buharlaşma ve kuyu konumları arasındaki eğilimleri değerlendirmek için hesaplandı. Buharlaşma ve satırlar için korelasyon katsayısı (Şekil 6B,C) -0,04 (p = 0,4949) ve buharlaşma vs sütunlar için -0,23 (p = 0,0001) idi. Gruplar daha sonra sütunlar arasındaki hafif ama istatistiksel olarak anlamlı korelasyonları azaltmak için sütunlar arasında dağıtıldı.

figure-results-1
Şekil 6: MFA'da buharlaşma. (A) Kesik çizgi ile belirtilen ortalama ± SD ile buharlaşma değişikliklerinin yoğunluk dağılımı. Buharlaşma ve satırlar (B) veya sütunlar (C) arasındaki korelasyonlar, belirtilen Pearson korelasyon katsayısı ve p değeri ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokolün geçerliliğini belirlemek için, 3-5 günlük Kanton-S B sinekleri (n = 36 / seks / plaka ve n = üç plaka için 24 buharlaştırma kontrolü / plaka) için tüketim ölçüldü (Şekil 7). Kontrol kuyuları arasındaki buharlaşma sıfırdan önemli ölçüde farklıydı (-0.030 μL ± 0.006 μL, p = 4.81 x 10-6; bir örnek t

figure-results-2

figure-results-3

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Drosophila'dakitüketimi ölçmek için yeni bir protokol açıklanmaktadır: Mikro Plaka Besleyici Tahlili (MFA). Bu tahlilde sinekler, kontrollü boyutlu perforasyonlar yoluyla 1536 kuyulu bir mikro plakanın sızdırmaz kuyularından tüketir (Şekil 1, Şekil 2; Tamamlayıcı Video S.1). Sıvı gıdalar mikro plaka ile boyanıp sağlandığından, bir mikro plaka spektrofotometresi kullanılarak gıdanın optik emicisinin ölçümleri elde edilebilir (Şekil 3). Bu şekilde tüketim, tüketim öncesi ve sonrası emilin karşılaştırılması ve daha sonra bu oranın tüketimden önce dağıtılan bilinen hacme uygulanması ile belirlenir. Bu, boyalı ortamın farklı hacimlerinin emilimini ölçerek ampirik olarak doğrulandı (Şekil 3B).

Bu tahlil geliştirmek için, tüketimin emicine dayalı nicelleştirilmesinden yararlanabilecek bir cihaza ihtiyaç vardı. Sinekleri mikro plaka biçiminde test etmek çekicidir, çünkü yiyecek dağıtmak için kullanılan mikro plakayı tamamlar ve bağlayıcı geometriyi ayarlayarak birden fazla plaka formatından (örneğin, 6, 12, 48 veya 96 kuyu formatları) seçim yapma esnekliği sağlar. Bireysel sinek kültürüne izin vermek için 96 kuyulu bir mikro plaka formatı seçildi.

3D baskılı cihaz (Şekil 1) 1536 kuyulu besleyici plakasını 96 kuyulu kültür plakası ile hassas bir şekilde yönlendirerek her sinekten tüketim için besleyici plakasının 4 kuyusuna kadar erişim sağlar. Ayrıca, gövde plakasına sinek dağıtmak için yeterli zaman sağlamak ve test başlatmasını kontrol etmek için cihaz, ilgili kuyularındaki sinekleri içeren bariyer şeritlerini değiştirmeyi ve ihlalleri önlemeyi içerir. Bu parçaları temin etmek veya değiştirmek için gereken dosyalar sağlanır (Ek Dosyalar S.2-S.3), ve ilgili parçalar için gerekli imalat talimatları (Ek Dosya S.4).

MFA, Drosophila besleme davranışını izlemek için daha ayrıntılı yöntemleri tamamlayan basit bir yüksek aktarım hızı yöntemi sağlar18,21,22. MFA, gıda alımını ölçmek için kullanılan diğer yöntemlere göre birden fazla avantaj sunar. Bir plaka okuyucu kullanılarak tüketimin ölçülmesi ile aktarım hızı artar. Bu, manuel ölçümleri ortadan kaldırır ve manuel veri girişini ortadan kaldırır. Veriler programlı ekstraksiyon ve işleme için de uygun. Ek olarak, daha yüksek verim, özellikle ortak besleyici tasarımlarına kıyasla, uygulanabilir biyolojik çoğaltma sayısını arttırır ve bu da tüketimdeki küçük farklılıkları tespit etme gücünü önemli ölçüde arttırır. MFA'yi kullanarak, tek bir deneyci, tahlilde bir gecede 500'den fazla sinek tüketimini veya tercihini ölçebilir. Testin çakışan koşuları ile 5 günlük bir sürede 2.000'den fazla sinek test edilebilir. Son olarak, mikro plakaların ve bağlayıcıların yeniden kullanılabilirliği nedeniyle uzun vadeli maliyet tasarrufu vardır (Ek Dosya S.5). MFA'nın kullanılmasıyla, test başına tahmini maliyet 14,80 $ kadar düşük olabilir ve ekipman için 127,60 $ peşin maliyet. Yüksek maliyetli hassas mikrokapsiller gerektiren klasik CApillary FEeder (CAFE) testini kullanarak, karşılaştırılabilir sayıda çoğaltma için test başına tahmini maliyet 46,08 USD'dir. Bu nedenle, gerekli ekipmanın elde etmek için önceden bir yatırım olsa da, yinelenen maliyetlerdeki azalma, özellikle tekrarlanan testlerin yapıldığı durumlarda önemli tasarruflara yol açabilir.

Tüm tahlillerde olduğu gibi, MFA'nın da belirli sınırlamaları vardır. Esas olarak, 1536 kuyulu mikro plakaları okuyabilen bir mikro plaka spektrofotometresine erişim gerektirir. Ek olarak, nicelik için absorbans ölçümlerine olan güven, yöntemi optik parazite karşı hassas hale getirir. Bu, test edilen örneklerin küçük bir alt kümesi için negatif tüketim değerleri olarak gösterir. Besin maddeleri, ilaçlar, farmasötikler veya ilgi çekici toksinlerin de testle uyumlu olması için suda çözünür olması gerekir.

Sınırlamalarına rağmen, bu yöntem Drosophila'dakitüketim davranışlarını ölçmek için yüksek verim yöntemi sunar. Ayrıca, kavrama cihazı birçok plaka formatını kabul etmek için kolayca değiştirilebilir ve çeşitli böcek türlerini barındırmasına izin verebilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü'nden (U01 DA041613) TFCM ve RRHA'ya verilen bir hibe ile desteklendi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25 mm Çap İğneleriRave ScientificRS-MN-52-001012
0,45 & m Şırınga FiltreleriOlympus Plastics25-245
10 mL Tek Kullanımlık ŞırıngaEXELINT26200
AgaroseFisher ScientificBP1600
Bariyer Şeritleri (Lazer Kesim)Ponoko-Malzeme: şeffaf PETG, 0,5 mm kalınlık; Ek Dosya:
Santrifüj 5810 REppendorf22625501
Santrifüj Rotoru A-4-62, mikro titre plakalı kovalarEppendorf22638041
FD& C Mavi # 1Spektrum Kimyasal Mfg CorpFD110
Film Sızdırmazlık KürekFisher Scientific50-563-280
Flystuff FlypadGenesee Scientific# 59-114 ve # 59-119CO2 < / sub>Anestezi: Flypads ve nbsp; iki boyutta gelir, bunlardan biri uygun
Mikroplaka Bağlayıcı (3D Baskılı)Şekil Yolları-Malzeme: Multi Jet Fusion naylon (MJF PA12); Ek Dosya:
Mikroplaka KapaklarıGreiner Bio-One656170
Moleküler Cihazlar SpectraMax iD5MolekülerCihazlar-1536 kuyulu çözünürlüğe sahip herhangi bir mikroplaka okuyucu yapacaktır.
İğne Probu TutucuRave ScientificRS-MN-52-001000
Polyester Sızdırmazlık FilmiExcel Scientific, Inc.100-SEAL-PLT
Polistiren 96 oyuklu mikroplakalarGreiner Bio-One655101
Polistiren, Dipsiz, 1536 kuyulu mikroplakalarGreiner Bio-One783000Sipariş Üzerine Üretilmiştir; Satın alırken yeterli teslim süresine izin verin.
Lastik Bantlar
SükrozSigmaS7903
Hava Sıyırma1/2 "x 1/8" Yüksek Yoğunluklu Kendinden Yapışkanlı Neopren Kauçuk
Maya ÖzüFisher ScientificBP1422

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, R., Piper, M. D. W., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS ONE. 4 (6), (2009).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  3. Spitaler, U., et al. Yeast species affects feeding and fitness of Drosophila suzukii adults. Journal of Pest Science. 93 (4), 1295-1309 (2020).
  4. Wang, Q. P., et al. PGC1α controls sucrose taste sensitization in Drosophila. Cell Reports. 31 (1), 107480(2020).
  5. Valtierra-de-Luis, D., et al. Quantification of dose-mortality responses in adult Diptera: Validation using Ceratitis capitata and Drosophila suzukii responses to spinosad. PLoS ONE. 14 (2), 1-11 (2019).
  6. Williams, M. J., et al. Exposure to bisphenol A affects lipid metabolism in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 114 (5), 414-420 (2014).
  7. Jajoo, A., Donlon, C., Shnayder, S., Levin, M., McVey, M. Sertraline induces DNA damage and cellular toxicity in Drosophila that can be ameliorated by antioxidants. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
  8. Fochler, S., et al. Genetics of alcohol consumption in Drosophila melanogaster. Genes, Brain and Behavior. 16 (7), 675-685 (2017).
  9. Highfill, C. A., Baker, B. M., Stevens, S. D., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Genetics of cocaine and methamphetamine consumption and preference in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 15 (5), 1007834(2019).
  10. Keebaugh, E. S., Park, J. H., Su, C., Yamada, R., Ja, W. W. Nutrition Influences caffeine-mediated sleep loss in Drosophila. Sleep. 40 (11), (2017).
  11. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (20), 8253-8256 (2007).
  12. Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8 (1), 87(2015).
  13. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193(2007).
  14. Shell, B. C., et al. Measurement of solid food intake in Drosophila via consumption-excretion of a dye tracer. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  15. Wu, Q., et al. Excreta quantification (EX-Q) for longitudinal measurements of food intake in Drosophila. iScience. 23 (1), 100776(2020).
  16. Park, A., Tran, T., Atkinson, N. S. Monitoring food preference in Drosophila by oligonucleotide tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9020-9025 (2018).
  17. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  18. Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A Taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
  19. Jaime, M. D. L. A., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
  20. IUPAC. Compendium of Chemical Terminology (The "Gold Book"). , Blackwell Scientific Publications. Research Triangle Park, NC. (1997).
  21. Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560(2014).
  22. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microplate Feeder AssayDrosophila FeedingHigh Throughput AssayFood Intake QuantificationAbsorbance MeasurementLiquid Food Consumption96 Well Microplate1536 Well MicroplateFeeding BehaviorFood Preference Assay

Related Articles