Bu makale, kriyo-EM deneyleri için donma işlemine dalmadan önce, 70 ° C'ye kadar yüksek sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) deneyleri için numune ızgaraları genellikle biyolojik numunelerin depolanması için en uygun sıcaklıkta, çoğunlukla 4 ° C'de ve bazen oda sıcaklığında hazırlanır. Son zamanlarda, düşük sıcaklıkta çözülen protein yapısının, özellikle termofilik arkelerden gelen proteinler için işlevsel olarak alakalı olmayabileceğini keşfettik. Kriyo-EM analizi için daha yüksek sıcaklıklarda (70 ° C'ye kadar) protein örnekleri hazırlamak için bir prosedür geliştirilmiştir. Daha yüksek sıcaklıklarda hazırlanan numunelerden elde edilen yapıların işlevsel olarak alakalı ve sıcaklığa bağlı olduğunu gösterdik. Burada, örnek olarak 55 °C kullanarak numune ızgaralarını yüksek sıcaklıkta hazırlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Deney, ek bir santrifüj tüpü kullanılarak modifiye edilmiş bir vitrifikasyon aparatı kullandı ve numuneler 55 ° C'de inkübe edildi. Ayrıntılı prosedürler, buhar yoğuşmasını en aza indirmek ve ızgarada ince bir buz tabakası elde etmek için ince ayarlandı. Başarılı ve başarısız deneylere örnekler verilmiştir.
Giriş
Protein komplekslerinin yapılarını çözmek için kriyo-EM teknolojisi, özellikle yüksek çözünürlüklü yapıların elde edilmesi yönünde gelişmeye devam etmiştir 1,2. Bu arada, vitrifikasyon prosesinden önce pH veya ligandlar gibi numune koşullarının değiştirilmesiyle uygulama alanı da genişletilmiştir3, bu da numune ızgaralarının hazırlanmasını ve ardından dalma dondurma 4,5'i içerir. Bir diğer önemli koşul sıcaklıktır. X-ışını kristalografisi gibi kriyo-EM deneyleri düşük sıcaklıklarda yapılmasına rağmen, kriyo-EM ile çözülen yapı, vitrifikasyondan önceki çözelti durumundaki yapıyı yansıtır. Yakın zamana kadar, tek parçacık analizi (SPA) kriyo-EM çalışmalarının çoğu, vitrifikasyon6'dan önce buz üzerinde (yani 4 ° C'de) tutulan örnekleri kullanır, ancak bir dizi çalışma oda sıcaklığında 7,8,9,10 veya 42 ° C 11 kadar yüksek numuneler kullanır. Yakın tarihli bir raporda, termofilik arkeon Sulfolobus solfataricus'tan (Sso) ketol-asit redüktoizomeraz (KARI) enziminin sıcaklığa bağlı çalışmalarını 4 ° C ila 70 ° C12 arasında altı farklı sıcaklıkta gerçekleştirdik. Çalışmalarımız, fonksiyonel olarak ilgili sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamanın önemli olduğunu ve kriyo-EM'nin aynı protein kompleksinin yapısını çoklu sıcaklıklarda çözmek için pratik olarak mümkün olan tek yapısal yöntem olduğunu göstermektedir.
Yüksek sıcaklıklarda vitrifikasyon için en büyük zorluk, buhar yoğuşmasını en aza indirmek ve ince buz elde etmektir. Burada, Sso-KARI 12 ile ilgili önceki çalışmamızda yüksek sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamak için kullanılan ayrıntılı protokolü sunuyoruz. Okuyucuların veya izleyicilerin kriyo-EM deneyleri için genel numune hazırlama ve veri işleme prosedürlerinde zaten deneyimli olduklarını varsayıyoruz ve yüksek sıcaklıkla ilgili yönleri vurguluyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bu protokol, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) örneklerini belirli sıcaklıklarda, özellikle 37 ° C'den daha yüksek sıcaklıklarda hazırlamak için modifiye edilmiş bir ticari vitrifikasyon aparatı kullanmayı amaçlamaktadır. Genel deney düzeni Şekil 1'de gösterilmiştir. Protokol örnek olarak 55 ° C kullanır. Diğer sıcaklıklardaki özel koşullar için lütfen referans12'deki Ek Tablo 2'ye bakın.
1. Vitrifikasyon aparatının hazırlanması
- Kapalı ucunda 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 1 cm'lik bir delik açın.
- Tüpü, Şekil 2'de gösterildiği gibi, ultrasonik su çıkışındaki vitrifikasyon aparatı odasına yerleştirin.
NOT: Amaç, tüm odaya ulaşmadan önce su buharını borudan ısı eşanjörüne yönlendirerek su yoğuşmasını en aza indirmektir. - Vitrifikasyon aparatı sıcaklığını belirtilen sıcaklığa ayarlayın (örneğin, Şekil 3'te gösterildiği gibi 55 ° C) ve vitrifikasyon aparatı odasının 55 ° C'ye ve% 100 bağıl neme ulaşmasına izin verin. Deneye başlamadan önce koşulları stabilize etmek için en az yarım saat bekletin.
2. Numunenin ve aletlerin ısıtılması
- Su banyosunu bir ocak üzerine yerleştirin ve ocak plakasını istenen sıcaklığa ayarlayın (burada 55 ° C). Suyun 55 ° C'ye ulaştığından emin olmak için bir termometre ile kontrol edin.
- Numuneyi su banyosunda inkübe edin ve kurutma deneyinden önce ocak plakasının kenarındaki pipet ucunu 2 dakika veya daha uzun süre önceden ısıtın.
NOT: Vitrifikasyon aparatı haznesi için en yüksek sıcaklık ayarı 60 °C'dir. Cyro-EM deneyi için daha yüksek sıcaklık ızgaraları hazırlamak üzere (örneğin, 70 ° C), numune 80 ° C'de su banyosunda inkübe edilir ve numune sıcaklığı ile vitrifikasyon aparatı sıcaklığı arasındaki ortalamanın, numunenin ızgaradaki gerçek sıcaklığı olduğu tahmin edilir (bu durumda 70 ° C). Bu tahminle ilgili daha fazla ayrıntı ve sınırlama için Tartışma bölümüne bakın.
3. Lekeleme deneyine hazırlık
- Işıtma, 30 s için 25 mA'da delikli karbon destekli bir ızgarayı boşaltır veya kullanılan cihaza bağlı olarak değerlere alternatif olarak boşaltır.
- Cımbızları vitrifikasyon aparatındaki ızgara ile 2 dakika veya daha uzun süre inkübe edin.
- Etan kabını standart prosedürlere göre etan ile doldurun. Etan'ın taşmasına izin vermeyin.
NOT: Bu adım yaklaşık 10 dakika sürer ve donmayı önlemek için lekeleme deneyi ile hemen takip edilmelidir. - Vitrifikasyon filtre kağıdını, lekeleme deneyinden en geç 5 dakika önce vitrifikasyon aparatı haznesine yerleştirin.
NOT: Filtre kağıdının hazneye çok erken yerleştirilmesi çok ıslanmasına neden olur.
4. Lekelenme deneyi
NOT: Izgarayı tutarken, ızgaranın sabit olduğundan ve cımbızla minimum temas alanı olduğundan emin olun (Şekil 4). Bu, etan'ın en iyi soğutma verimliliğini korumak ve vitröz olmayan buzdan kaçınmak için yapılır.
- Numunenin 7-9 μL'sini ızgaraya uygulamak için bir pipet ucu kullanın. Ardından 1-2 s bekleyin, 1-1.5 s için lekeleyin ve numuneyi hızlı bir şekilde sıvı etan'a batırın.
- Izgarayı sıvı etandan, sıvı azotta depolanan kriyo kutusuna aktarın.
NOT: Bu adım çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir, çünkü cımbız hala sıcaktır, bu nedenle tüm soğutma tankı şu anda buharla doludur.
5. Izgaralar için kalite kontrolü
- Izgaraları kırpın ve bir kriyo-EM cihazına yükleyin.
- Izgaradaki buz durumunu ve numunenin ızgaradaki dağılımını taramak için kriyo-EM cihazının ekran ekranını ve yazılımın düşük doz işlevini kullanın.
NOT: Çoğu zaman, ızgaralar çok kurudur veya buz tabakası çok kalındır. Yüksek sıcaklıklarda hazırlanan ızgaraların başarı oranı, oda sıcaklığında veya 4 °C'dekinden önemli ölçüde daha düşüktür. İyi ızgaraların ve tatmin edici olmayan ızgaraların temsili sonuçları bir sonraki bölümde gösterilmiştir. - Elde edilen ızgaranın kalitesi iyi değilse, ızgara hazırlama işlemini çeşitli koşullarla (bekleme süresi, lekelenme süresi vb.) tekrarlayın. Elde edilen ızgaranın kalitesi iyiyse, ızgaraları farklı bir sıcaklıkta yapmak için aynı adımları tekrarlayın.
6. Veri toplama
- Kaliteli ızgaraları yüksek çözünürlüklü bir kriyo-EM cihazına aktarın.
- Belirlenen prosedürlere göre veri toplama ve veri analizleri gerçekleştirin.
NOT: Önceki yayınımızda gösterildiği gibi, yapının çözünürlüğü yüksek sıcaklık12'den etkilenmez.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Düşük büyütmeye genel bakış Şekil 5A,B'de gösterilmiştir. Panel A, başarılı bir ızgara örneğidir. Sol üstten (daha kalın) sağ alta (daha ince veya boş) bir buz gradyanı vardır. Böyle bir ızgara, mavi ve yeşil kutular gibi veri toplama için uygun orta alanda uygun bir buz tabakası kalınlığı bulmayı kolaylaştırır. B ızgarası çok kuru. Izgaradaki kareler parlak kontrasta sahiptir, bu da buz tabakasının çok ince olduğu veya hiç buz tabakası olmadığı anlamına gelir. Yalnızca kırm...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protokolün 1. adımında, santrifüj tüpünün iyi monte edildiğinden ve deney devam ederken düşmediğinden emin olun. Haznede, filtre kağıdının adsorpsiyon kapasitesini değiştirebilecek çok sayıda su damlacığının birikmesi nedeniyle, vitrifikasyon aparatı haznesi denge sıcaklığına ulaştıktan sonra deneyin toplam süresinin 30 dakikayı geçmemesi önerilir. Çalışma süresi 30 dakikayı aşarsa, operatörün filtre kağıdını değiştirmesi ve kabinin sıcaklık ve nemi tekrar dengelemesini beklemesi gerekir. Protokolün 8. adımında, önerilen...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar, yararlı tavsiyeler için Thermo Fisher Scientific'ten Dr. Hervé Remigy'ye teşekkür eder. Kriyo-EM deneyleri Academia Sinica Cryo-EM Tesisi'nde (ASCEM) gerçekleştirildi. ASCEM, Academia Sinica (Hibe No. AS-CFII-108-110) ve Tayvan Protein Projesi (Hibe No. AS-KPQ-109-TPP2). Yazarlar ayrıca numune hazırlama konusundaki yardımları için Bayan Hui-Ju Huang'a teşekkür eder.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Falcon tüpü | Falcon | 352070 | boyutu: 50 mL |
| Filtre kağıdı | Ted Pella | 47000-100 | Ø 55 / 20mm, Sınıf 595 |
| HI1210 | Leica | su banyosu | |
| K100X | Elektron Mikroskobu Bilimleri | kızdırma deşarjı | |
| Quantifoil, 1.2 / 1.3 200Mesh Cu ızgara | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 düşük doz görüntüleme | |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Cımbız | Ted Pella | 47000-500 |
Kaynaklar
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
