1. Test Çubuklarının Hazırlanması
- Herhangi bir işlem işlemi tamamlandıktan sonra, kuru ahşabı 2 mm x 4 mm x 20 mm boyutlarında test çubukları halinde kesin (Şekil 1). Hava kuru, laboratuvar koşullarında sabit bir ağırlığa yapışır. Test edilen her ahşabın en az 5 çoğaltmasını kullanın.

Şekil 1: Gribble besleme oranlarını değerlendirmek için kısa süreli laboratuvar testlerinde kullanılan test çubukları. 2 mm x 4 mm x 20 mm boyutlarında test ahşap çubuklar. Soldan sağa: ekki, terebentin, tatlı kestane ve kayın kalp ağacı ve İskoç çam ağacı. Ölçek çubuğu 4 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Vakum Emprenye
- Ahşap hazırlama sonrası (yani, varsa kesme ve arıtma), çubukları gıda açısından güvenli bir plastik kapta, vakum kurutucunun içine bir ağın altına yerleştirin ve vakum yağı kaplaması ile kolaylaştırılan sıkı bir conta olmasını sağlayan kapağı değiştirin (Şekil 2).
- Kurutucu ve pompayı birbirine bağlayan boru arasına açık havaya giden üçüncü bir tüple üç yönlü bir vana takın (Şekil 2). Üç yönlü vananın havaya kapalı olduğundan emin olun ve vakum kurutucu içinde -0,75 ila -1,0 bar arasında bir vakum elde etmek için pompayı çalıştırın ve bu vakumu 45 dakika - 1 saat tutun.
- Üçüncü tüpün açık ucunun bir deniz suyu kabına batırın. Pompayı kapatın ve pompaya giden vanayı kapatın, ardından deniz suyu vakum tarafından kurutucuya çekilene kadar vanayı yavaşça açın. Suyun plastik kabı doldurana kadar akmasına izin verin, ağ seviyesinin üzerinde.
- Daha sonra tüpü konteynerdeki deniz suyundan çekin, kurutucu atmosferik basınca dönene kadar havanın girmesine izin verin. Çubukları plastik kabın dibine batana kadar ağın altına batırın.

Şekil 2: Laboratuvar besleme tahlilleri sırasında kum torbalarına beslenmeye hazırlık olarak ahşap çubukları deniz suyu ile emprenye etmek için kullanılan ekipman. A) Vakum kurutucu; B) Pompa; C) Vakum kurutucu için basınç göstergesi; D) Vakum kurutucu, pompa ve açık hava veya deniz suyuna (turuncu tüp) giden üç yönlü vana. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Liç Ahşap
- Deniz suyuna doymuş test çubuklarını 50 mL tüplerde bulunan deniz suyuna batırın (Şekil 3). Suyu 20 günlük bir süre için düzenli olarak değiştirin.
NOT: Liç işlemi, işlenmiş veya doğal ormanlar da dahil olmak üzere test edilen deneysel ahşaplar için geçerlidir.

Şekil 3: Laboratuvar besleme tahlilleri sırasında kumsallara beslenmeye hazırlanmak için ahşap çubuklardan liç. Düzenli su değişimi (1-3 gün) ile 50 ml Falcon tüpünde bulunan deniz suyuna tamamen batırılmış ahşap, belirgin renkli liç üretti. Soldan sağa liç kalp ağacı; tatlı kestane, terebentin, ekki ve kayın ve İskoç çam sapwood. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Gribble Ayıklama
- Istila edilmiş bir ahşap bloktan tek tek gribble örnekleri çıkarın. Bir çift ince tokmak ve ince (000/0,4 mm veya daha küçük boyut) bir boya fırçası kullanın. Kumlu yuvayı kümeslerle kaplayan herhangi bir ahşabı dikkatlice soyun
NOT: Yuvalar ahşabın yüzeyinde bulunur ve küçük deliklerle tanımlanabilir (Şekil 4).
- Kum dalaşı ortaya çıktıktan sonra, bireyleri alttan hafifçe almak ve deniz suyuyla dolu bir petri kabına biriktirmek için bir boya fırçası kullanın. Türleri tanımlamak ve ayıklanırken herhangi bir hasara yol açtığına emin olmak için mikroskop altında gribble'ı kontrol edin.
NOT: Pleopodları dövmek canlılık belirtisidir.
- Gravid dişiler daha az beslenme kapasitesine sahip olduğu için yumurta kara düşünen dişileri atın.

Şekil 4: İki tipik havalandırma deliği ile bir gribble yuvası görüntüsü. L. Quadripunctata, 2 mm x 4 mm x 20 mm büyüklüğünde Radiata çam ağacının bir çubuğu üzerinde yuva. Yuva girişinin yanında iki küçük havalandırma deliği görülebilir. Ölçek çubuğu 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Limnoria quadripunctata'yı tanımlama
- Limnoria quadripunctata'yı stereomikroskop altında, beşinci pleonit19'daki X şeklindeki bir karineye ek olarak, kare desenli olarak düzenlenmiş dört farklı tüberkül tarafından tanımlayın (Şekil 5).

Şekil 5: Limnoria quadripunctata tanımlayıcı özellikler. Dorsal yüzey Limnoria quadripunctata görüntüsü, x20 büyütmede stereomikroskop üzerine çekilmiştir. Kırmızı okla gösterilen özellikleri tanımlamak - X şeklindeki karina ve mavi oku gösterir - pleotelson üzerinde dört tüberkül gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Kuyu Plakalarının Hazırlanması
- 20 mm çapında kuyulara sahip çok kuyulu plakalarda, kuyu başına 32-35 PSU arasında bir test çubuğu ve 5 mL filtresiz deniz suyu yerleştirin (Şekil 6).
- Her ahşap türünün plaka başına en az bir kez temsil edildiği şekilde, kuyu plakası boyunca sistematik olarak ahşap tedavileri / türleri yerleştirin. Kuyu başına bir gribble ekleyin.
NOT: Sıcaklık L türleri için 20 °C ± 2 °C'de bir inkübatörde sabit tutulmalıdır. quadripunctata, diğer Limnoria türleri, belirli türlere uyacak şekilde yapılan sıcaklık ayarlamaları ile kullanılabilir.
- Fotoperiod'un gribble besleme oranı üzerinde bir etkisi olmadığı için plakaları sabit karanlık koşullarda tutun15.

Şekil 6: Gribble besleme tahlilleri için deneysel kurulum. Gribble besleme oranının laboratuvar testinde kullanılan 12 çok kuyulu plaka örneği. Her kuyuda 5 ml deniz suyu ve farklı ahşap türlerinden bir test çubuğu (20 mm x 4 mm x 2 mm) bulunur; İskoç Çam sapwood ve ekki, kayın, tatlı kestane ve terebentin kalp ağacı. Ölçek çubuğu 20 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Faecal Peletleri Toplamak ve Saymak ve Canlılığı Değerlendirmek.
- Haftada iki kez, test çubuğunu ve her bir gribble'ı (kuyu başına bir) kuyu plakasından çıkarın ve taze önceden hazırlanmış bir kuyu plakasına yerleştirin (kuyu başına 5 mL deniz suyu içerir [32-35 PSU, 18-22 °C]).
- Aktarmadan önce çubuktan herhangi bir faekal peletleri hafifçe fırçalamak ve faekal peletleri orijinal kuyuda tutmak için bir boya fırçası kullanın.
NOT: Gribble'ı taze bir kuyu plakasına aktarmadan önce, canlılık 1-5 ölçeğinde değerlendirilebilir; 1= ölü, 2 = pasif, ahşap üzerinde değil, 3 = aktif olarak yüzen veya dövülen pleopodlar, ahşap üzerinde değil, 4 = ahşabın yüzeyinde sürünme, 5 = ahşaba göm.
- Görüntü İşleme
- Herhangi bir topak ayırmak için ince bir boya fırçası kullanın, böylece tek tek peletler görülebilir ve peletleri kuyunun kenarlarından uzağa fırçalayın. Stereo mikroskop altında, büyütme x4'te ayrıntılı bir fotoğraf çekin ve bir bilgisayara yükleyin (Şekil 7).
NOT: Peletlerin odakta olduğundan ve arka planın su yüzeyinde gölge veya ışık yansıması olmadan düzgün olduğundan emin olun.

Şekil 7: Gribble faecal peletlerin görüntüsü. L. quadripunctata faecal peletler (küçük, silindirik, kahverengi peletler) Radiata çam ağacı ile beslenmekten çok kuyulu bir tabakta. x4 büyütmede çekilmiş. Görüntü analizi için manipülasyondan önceki görüntüler (bkz. Şekil 7). A) ImageJ'de otomatik sayım için kullanılacak uygun bir görüntü örneği. Peletler yeterince yayılır ve kuyunun kenarlarından uzaklaşır. Kuyu ortalanmıştır ve herhangi bir engel veya yansıma yoktur. B) Görüntü analizi için uygun olmayan bir görüntü örneği. Kuyu ortadan kalkmış, alt yarısını kesiyor. Mavi (noktalı) daire, su yüzeyinden ışık yansımasını gösterir. Turuncu (katı) daire, birbirine çok yakın ve kuyunun kenarına çok yakın bir şekilde topaklanmış peletleri gösterir. Kırmızı (kesikli) daire, çıkarılmamış bir ahşap yonga gösterir. Ölçek çubuğu 10 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- ImageJ Kullanarak Faecal Pelet Sayısı Oluşturma İşlemi.
- ImageJ'i (03/08/21, 1.8.0_172 itibariyle en son sürüm) https://imagej.nih.gov/ij/download.html'den indirin veya bilgisayarın tarayıcısından çalıştırın.
- Sürükleyip bırakarak veya Dosya | seçerek görüntü yığınını karşıya yükleme | al Görüntü sırası | Göz atın. Parametreleri değiştirmeyin ve Tamam'ı seçin.
- Ardından, faekal peletleri içeren kuyunun alt bölümünü seçmek için daire aracını kullanın. Kuyu kenarlarını kaldırın, | Düzenle'yi seçin Dışarısı temiz. Görüntüyü ikili yap, İşlem |'nı seçin İkili yapın.
- Analiz | seçerek kalibre etme Ölçeği ayarlayın ve görüntü için milimetre başına piksel sayısını seçin (örneğin 10 piksel = 1 mm). Peletleri sayın, Analiz |'nı seçin Parçacıkları analiz edin.
- Boyut (birim2) yanındaki kutuda, daha önce ayarlanan birim ölçeğini kullanarak en küçük boyutlu peletle aynı olan bir alt eşik seçin (örneğin, 10 piksel = 1 mm ve en küçük pelet 0,5 mm ise, 5 sonsuzluğu seçin).
- Göster açılan kutusunda Anahatlar'ı seçin ve Özetle'yi işaretleyip Tamam'a basın (Şekil 8).
NOT: Daha fazla bilgi https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html


Şekil 8: ImageJ'de faekal peletleri saymak için kullanılan işlemin akış şeması. A) ImageJ'nin Dosya sekmesinde bir görüntü dizisi içe aktarma. B) Yerel bir cihazdan bir dizi görüntü almak için 'Görüntü Sırasını İçeri Aktar' iletişim kutusundaki gözat düğmesi. C) Faekal pelet içeren alanı seçmek için daire aracını kullanmak D) Seçili alanın dışını kaldırmak için düzenleme sekmesi alanındaki dış düğmeyi temizleyin. E) İşlem sekmesinde ikili düğme yapın. F) Analiz sekmesinde ölçek düğmesini ayarlayın. Piksel cinsinden uzaklık, piksel sayısının bir ölçü birimine (mm) eşdeğerdir. G) Analiz sekmesindeki parçacıkları analiz etme düğmesi. Boyut (birim^2), piksel cinsinden faecal pelet boyutunun alt eşiğine sonsuzluğa ayarlanır. 'Anahatları' göster ve 'özetle' seçilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
-
Veri Analizi
- Pelet sayılarını günde peletlere dönüştürün, bu da beslenme hızının dolaylı ve dolaylı ölçüsünü verir. Tüylenmenin meydana geldiği günlerde, herhangi bir ürküten kişiden gelen verileri atın (Şekil 9).
NOT: Tüylenme 1-3 gün içinde gerçekleşir ve dış iskeletin tam bir tüylenme görüldüğünde tanımlanabilir.

Şekil 9: Bir gribble moult örneği. Gribble (L. quadripunctata) tüylenme, 20 mm x 4 mm x 2 mm büyüklüğünde bir Radiata çam ağacı test çubuğu üzerinde. Moults kırmızı daireler tarafından gösterilir. Ölçek çubuğu 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.