Filamentli mantar A. nidulanslarının hem batık kültürlerde hem de katı ortamda görüntülerini yakalamak, analiz etmek ve büyüme kinetiğini ölçmek için iletilen ışık mikroskopi tekniklerini kullanarak etiketsiz canlı görüntüleme protokolü sunuyoruz. Bu protokol floresan mikroskopi ile birlikte kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Mikroskopi ve Açık Kaynaklı Yazılım Kullanılarak Aspergillus nidulans Büyüme Hızının Nicel Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Çoğunlukla hyphae/mycelia apikal büyüme oranındaki değişikliklere bağlı olan filamentli mantarların koloni büyümesinin, koloni büyüklüğü karşılaştırılarak katılaşmış medyada makroskopik olarak tahmin edildiği iyi belirlenmiştir. Bununla birlikte, farklı çevresel/büyüme koşulları altında (pH, sıcaklık, karbon ve azot kaynakları, antibiyotikler vb.) genetik olarak farklı mantar suşlarının veya suşlarının büyüme hızını nicel olarak ölçmek zordur. Böylece, mantar hücre büyümesini daha iyi anlamak için büyüme kinetiğini ölçmek için tamamlayıcı yaklaşımların takibi zorunlu hale gelir. Ayrıca, Aspergillus spp. de dahil olmak üzere filamentli mantarların, katı ortamlar veya batık kültürler üzerinde hava altı koşullar altında farklı büyüme ve farklılaşma modlarına sahip olduğu iyi bilinmektedir. Burada, model mantarı Aspergillus nidulans'ınbüyüme kinetiğini analiz etmek için nicel bir mikroskobik yöntem hem batık kültürlerde hem de katı medyada canlı görüntüleme kullanarak detaylandırıyoruz. Farklı mantar suşlarının büyüme oranlarını, kullanıcıdan önceden görüntü analizi uzmanlığı gerektirmeyecek şekilde biyo-görüntüler için açık kaynaklı, özgür bir yazılım (örneğin Fiji) kullanarak tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde yakalar, analiz eder ve ölçürüz.
Giriş
Filamentli mantarlar büyük sosyoekonomik ve ekolojik öneme sahiptir, hem enzim ve antibiyotik üretimi için endüstriyel / tarımsal araçlar olarak çok önemlidir1,2 ve mahsul bitkilerinin patojenleri olarak3, haşere böcekleri4 ve insanlar3. Ayrıca, Aspergillus nidulans gibi filamentli mantarlar, genetik, hücre ve evrimsel biyoloji çalışmaları ve hiphal uzatma çalışmaları gibi temel araştırmalar için model organizmalar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır5. Filamentli mantarlar, membran lipitlerin / ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Inoculum hazırlığı
NOT: Tüm adımlar laminer akış kabini altında yapılmalıdır.
- Steril bir aşılama döngüsü kullanarak gliserol stoğundan (-80 °C) incelenen suşla ilgili uygun beslenme gereksinimleriyle desteklenmiş minimal ortam (MM) plakalarına kadar mantar suşu çıkarın [MM: 10,0 g/L glikoz, 20 mL/L tuz çözeltisi (tuz çözeltisi: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4,2,0 mL/L kloroform) ve 1 mL/L iz elementler (eser elementler: 40 mg/L Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO4, 8 g/L ZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün ardından, filamentli mantar A. nidulans'ınfarklı büyüme / gelişim aşamalarına karşılık gelen çeşitli görüntüler yakaladık ve analiz ettik. Bu çalışmada sunulan veriler Fiji yazılımı kullanılarak işlendi ve analiz edildi. Ölçümler csv dosyaları olarak kaydedildi, istatistiksel olarak analiz edildi ve pandalar, numpy, istatistikmodelleri, matplotlib ve seaborn gibi yazılım kütüphaneleri kullanılarak ticari istatistiksel yazılım ve / veya Python programlama dili kullanılarak grafikler olarak hazırland.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mantar hücre büyümesini ve fenotipini zaman atlamalı mikroskopi ile izlemek, hücresel davranışı gerçek zamanlı ve nicel ve doğru bir şekilde değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır ve belirli bir ilaç tedavisinin ve/veya genetik müdahalenin zaman içinde tespit edilebilir hücre büyümesi veya fenotipik farklılıklarla sonuçlanıp sonuçlanmadığını belirlemek için güçlü bir yaklaşımdır.
Bu çalışmada, A. nidulans'ta mikrop tüpü ve hiphal ucu büyümesinin dinamikleri de dahil olmak üzere mantar geliş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen"Rekabetçilik, Girişimcilik ve İnovasyon" (NSRF 2014-2020) Operasyonel Programı (NSRF 2014-2020) tarafından finanse edilen ve Yunanistan ve AB tarafından ortaklaşa finanse edilen "Araştırma ve yenilik Altyapısının Güçlendirilmesi" Eylemi kapsamında uygulanan "Temel Biyolojik Süreçleri Görselleştirmek ve İzlemek için Bir Yunan Araştırma Altyapısı (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) projesi tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| &mikro;-Slayt 8 Kuyu | Ibidi | 80826 | Görüntüleme slaytları |
| 4-Aminobenzoik asit | Merck | A9878 | |
| azhA ve Delta; ngnA ve Delta; | Genotip: zhAΔ::p yrGAf; ngnAΔ::p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / Kaynaklar:Laboratuvar koleksiyonu, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sülfat pentahidrat | Merck | C8027 | |
| Glikoz | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prizma 8.0 | GraphPad Yazılımı | İstatistiksel | |
| Yazılım ImageJ | NIH | Görüntü işleme ve analiz yazılımı | |
| Aşılama Döngüsü | Merck | I8263-500EA | |
| Demir (III) fosfat | Merck | 1.03935 | |
| Leica Uygulama Paketi X | Leica Mikro Sistemler | Mikroskop yazılımı | |
| Magnezyum sülfat heptahidrat | Merck | 63138 | |
| Manganez (II) sülfat monohidrat | Merck | M7899 | |
| Mikroskop Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nikotinamid (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Pepton | Millipore | 68971 | |
| Mikrobiyoloji Kültürü için Petri Kapları | KISKER | G090 | |
| Potasyum klorür | Merck | P4504 | |
| Potasyum fosfat monobazik | Merck | P5655 | |
| Piridoksin hidroklorür | Merck | P6280 | |
| Quali - Mikrosantrifüj Tüpleri, 1,7 mL, DNaz-, RNaz ve pirojen içermez, steril | KISKER | G052-S | |
| Quali - Mikrosantrifüj Tüpleri, 2.0 mL, steril | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standart Uçlar, Eğimli, 100-1000 & mikro; L | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standart Uçlar, Eğimli, 1-200 & L | KISKER | VL700G | |
| Quali Mikro Hacim Uçları, DNase-, RNase içermez, 0,1-10 ve mikro; L/net | KISKER | GC. Ipuç -ları. B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Neşter bıçakları NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodyum klorür | Merck | S7653 | |
| Sodyum hidroksit | Merck | S8045 | |
| Sodyum tetraborat dekahidrat | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP ve H1-mRFP) | Genotip: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / Kaynaklar:Laboratuvar koleksiyonu, Biratsi ve ark., 2021 | ||
| WT | Genotip: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4; pyrG89 / Referanslar: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Maya Özü | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
Kaynaklar
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
