Bu protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli nöronlarda ve ölüm sonrası insan dokularında nükleoplazma ve NPC'ler içindeki bireysel nükleoporinleri değerlendirmek için çekirdek izolasyonu ve süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu için optimize edilmiş bir iş akışını tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Nörodejenerasyonunda Nükleoporin Değişikliklerini İncelemek için Çekirdek İzolasyonu ve Süper Çözünürlüklü Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu
Bu makalede
Özet
Özet
Nükleer gözenek kompleksi (NPC), ~30 farklı nükleoporin proteininin (Nup) çoklu kopyalarından oluşan karmaşık bir makromoleküler yapıdır. Toplu olarak, bu Nup'lar genom organizasyonunu, gen ekspresyonunu ve nükleositoplazmik taşımayı (NCT) düzenleme işlevi görür. Son zamanlarda, Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), Alzheimer Hastalığı (AD)/Frontotemporal Demans (FTD) ve Huntington Hastalığı (HD) dahil olmak üzere çoklu nörodejeneratif hastalıklarda NCT'deki defektler ve spesifik Nup'lardaki değişiklikler erken ve belirgin patolojiler olarak tanımlanmıştır. Hem ışık hem de elektron mikroskobundaki gelişmeler, NPC ve Nup bileşenleri de dahil olmak üzere hücre altı yapıların daha yüksek hassasiyet ve çözünürlükle kapsamlı bir şekilde incelenmesine izin verir. Yaygın olarak kullanılan tekniklerden, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), geleneksel antikor bazlı etiketleme stratejilerini kullanarak bireysel Nup'ların lokalizasyonunu ve ekspresyonunu incelemek için eşsiz bir fırsat sunar. SIM'den önce çekirdeklerin izolasyonu, NPC ve nükleoplazma içindeki bireysel Nup proteinlerinin tam ve doğru bir şekilde yeniden yapılandırılmış 3B uzayda görselleştirilmesini sağlar. Bu protokol, insan iPSC'den türetilmiş CNS hücrelerinde ve postmortem dokularda Nup ekspresyonunu ve dağılımını değerlendirmek için çekirdek izolasyonu ve SIM için bir prosedürü tanımlar.
Giriş
Yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıkların prevalansı, nüfus yaşlandıkça artmaktadır1. Genetik temeller ve patolojik özellikler iyi karakterize edilmiş olsa da, nöronal hasara yol açan kesin moleküler olaylar tam olarak anlaşılamamıştır2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
iPSC üretimi ve otopsi doku koleksiyonları için tüm kan örnekleri, Johns Hopkins etik gözetimi ile Johns Hopkins IRB tarafından onaylanmıştır. Tüm hasta bilgileri HIPPA uyumludur. Aşağıdaki protokol tüm Johns Hopkins biyogüvenlik prosedürlerine uygundur.
1. İmmün boyama ve görüntüleme için slaytların hazırlanması
- Pozitif yüklü bir cam mikroskop slaytını boş bir hücre hunisine yerleştirin ve çekirdekleri biriktirmek için bir alanın ana hatlarını çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemle bir daire çizin.
- Adım 1.1'de çizilen dairenin merkezine 50 μL 1 mg / mL kollajen çözeltisi (1x PBS'd....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İnsan nöronal çekirdeklerinde POM121'in NPC ve nükleoplazmik dağılımını ve ekspresyonunu incelemek için, kontrol ve C9orf72 iPSN'ler daha önce tarif edildiği gibi farklılaştırıldı15. Postmortem insan motor korteksi ve 32. gün iPSN'leri parçalandı ve yukarıda tarif edildiği gibi çekirdek izolasyonu ve immün boyamaya tabi tutuldu. NeuN pozitif izole çekirdekler, bir süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (Zeiss) kullanılarak süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
NCT eksikliklerinin çoklu nörodejeneratif hastalıklarda erken ve belirgin bir fenomen olarak yakın zamanda tanımlanması göz önüne alındığında 16,27,28,30,31, bu patolojinin ortaya çıktığı mekanizmanın kapsamlı bir şekilde incelenmesi için kritik bir ihtiyaç vardır. NPC ve bireysel Nup proteinleri, fonksiyonel NCT
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Postmortem insan CNS dokuları, Johns Hopkins ALS Otopsi Bankası ve Hedef ALS Postmortem Doku Çekirdeği tarafından sağlandı. Bu çalışma, ALSA Milton Safenowitz Doktora Sonrası Bursu (ANC) tarafından desteklenmiştir ve ayrıca NIH-NINDS, Savunma Bakanlığı, ALS Derneği, Musküler Distrofi Derneği, F Prime, Robert Packard ALS Araştırma Merkezi Cevap ALS Programı ve Chan Zuckerberg Girişimi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 50 mL konik tüpler | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Beckman Ultrasantrifüj | Beckman Coulter | ||
| Hücre Sıyırıcılar | Sarstedt | 83.183 | |
| Kollajen | Gelişmiş Biomatrix | 5005 | |
| Lameller | MatTek | PCS-170-1818 | |
| Cytofunnel | Thermo Fisher Scientific | ||
| Cytospin 4 | Fisher Scientific | A78300003 | |
| Dounce Homojenizatörler | DWK Yaşam Bilimleri | 357542 | |
| DTT | Sigma Aldrich | D0632 | |
| Eppendorf tüpleri | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Keçi Anti-Tavuk Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21449 | |
| Keçi Anti-Fare Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Keçi Anti-Fare Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11031 | |
| Keçi Anti-Fare Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21236 | |
| Keçi Anti-Tavşan Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | |
| Keçi Anti-Tavşan Alexa 568 | Thermo Fisher Bilimsel | A-11036 | |
| Keçi Anti-Tavşan Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21245 | |
| Keçi Anti-Sıçan Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | |
| Keçi Anti-Sıçan Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11077 | |
| Keçi Anti-Sıçan Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21247 | |
| Hemasitometre | Fisher Scientific | 267110 | |
| Mikroskop slaytları | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Normal Keçi Serumu | Vektör Laboratuvarları | S-1000 | |
| Nuclei PURE Hazırlık Çekirdeği İzolasyon Kiti | Sigma Aldrich | NUC201 | , lizis tamponu, %10 Triton X-100, 2 m sükroz gradyanı, sükroz yastık çözeltisi ve çekirdek depolama tamponu içerir; Protokolde "çekirdek izolasyon kiti" olarak atıfta |
| bulunulmuşturPBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| PFA | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15714-S | |
| Prolong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | Protokolde "sert montajlı antifade montaj ortamı" olarak atıfta bulunulmuşturSW |
| 32 Ti Ultrasantrifüj Rotoru | Beckman Coulter | 369694 | Protokolde "ultrasantrifüj rotoru" olarak atıfta bulunulan |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tripan Blue | Thermo Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ultrasantrifüj Tüpleri | Beckman Coulter | 344058 | |
| Nükleoporin Primer Antikorları | Bireysel nükleoporinlerin immünofloresan tespiti için uygun primer antikorlar birden fazla şirketten temin edilebilir |
Kaynaklar
- Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
- Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
